一种丹参多酚酸提取物指纹图谱及有关成分的含量测定方法
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及一种中药提取物的检测方法，特别涉及一种丹参多酚酸提取物指纹图 谱的建立及有关成分的含量测定方法
【背景技术】：
[0002] 丹参为唇形科鼠尾草属植物。又名：紫丹参、红根、血参、大红袍等。丹参以根供药 用，味苦，性微寒。具有活血调经、祛瘀生新、镇静安神、凉血消痈、消肿止痛等功能。用于治 疗月经不调、痛经、产后瘀阻腹痛、关节酸痛、神经衰弱失眠、心悸、痈肿疮毒等症。近代医学 临床证明，丹参有扩张血管与增进冠状动脉血流量的作用，用来治疗冠心病、心绞痛、心肌 梗塞、心动过速等症，有显著的疗效；还用来治疗慢性肝炎、早期肝硬变等症，亦有良好的效 果。
[0003] 丹参中含有两类主要有效成分，即脂溶性丹参酮类和水溶性丹参酚酸类。现代医 学认为，丹参酸酸类（salvianolie acids)成分，能够缩小心肌梗死的范围，减轻其病情，对 大鼠心肌缺血、再灌注损伤具有保护作用，同时有明显的抑制血小板聚集、抗凝、溶纤及降 低血脂、抗动脉粥样硬化的作用，具有较大的临床药用价值。该类化合物主要有丹酚酸、丹 参素、原儿茶醛、咖啡酸等，其中丹酚酸B是丹参水溶性成分中的主要药效成分。
[0004] 丹参多酚酸注射剂是一种已经上市的产品，其活性物质被称为"丹参多酚酸"。丹 参多酚酸的提取制备方法有多种，例如：取丹参饮片，用纯化水煎煮提取三次，每次〇. 5~ 1小时，将三次提取液合并，冷却，用盐酸溶液调节至酸性，放置4~8小时，过滤，得澄明药 液，将药液用聚酰胺柱层析工艺纯化，上样后用纯化水冲洗，以碳酸氢钠溶液进行洗脱，收 集洗脱液，将洗脱液用盐酸溶液调节至酸性，采用大孔树脂柱层析工艺纯化药液，上样后用 纯化水冲洗，以乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液减压浓缩回收乙醇，所得浓缩液 冷藏12~24小时后过滤，滤液用氢氧化钠溶液调节pH值至5. 3~6. 0,冷冻干燥，即得。 之后再将丹参多酚酸提取物与辅料进行混合制备成各种制剂。例如，与甘露醇溶液进行混 合，并调pH至5. 5~6. 0,定容后冷冻干燥，制备丹参多酚酸注射剂。
[0005] 作为丹参多酚酸注射剂的活性成分，目前丹参多酚酸提取物和制剂的质量标准现 状来看，质控项目很不全面，普遍采用紫外-可见分光光度法来测定多酚酸的含量。该法是 以丹酚酸B为对照计算多酚酸的含量，专属性和准确度差。且对于成分复杂的中药制剂，仅 以一种成分控制含量指标，在缺乏整体性的同时，对于复杂成分的指认也并不充足。
[0006] 因此，针对上述复杂成分指认不充分以及定量不准确等缺陷。本发明开发了 UPLC 色谱指纹图谱的方法，利用液质进行峰指认，从而确定了 23个紫外检测共有的指纹峰。并 且同时对于指认出的三个含量较大、活性比较明显且结构明确的指标性成分建立了 HPLC 含量测定方法。
[0007] 本发明是以全面表征中药制剂的质量为目标，提供了一种采用UPLC-PDA法（超高 效液相多波长可见紫外检测法），建立了丹参多酚酸提取物的数字化定量指纹图谱，并以二 级系统指纹定量法鉴定了多批丹参多酚酸提取物样品的一致性与稳定性，共检出化学成分 39个，结合多级质谱信息及对照品，鉴定丹参酚酸类化合物23个。考虑到UPLC应用到大规 模检测的成本及HPLC的广泛应用性，又以HPLC-VWD法（高效液相色谱可变波长检测法） 同时测定三个指标性成分迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的含量。在确保准确性、有效性的同 时，又兼顾了成本节约原则，更适合应用于扩大化生产，完善了现有的注射用丹参多酚酸的 质控标准。
【发明内容】
：
[0008] 本发明提供一种丹参多酚酸提取物指纹图谱及含量测定方法，其特征在于，步骤 如下：
[0009] 步骤1 :采用超高效液相多波长可见紫外检测法，建立丹参多酚酸提取物数字化 定量指纹图谱；
[0010] 步骤2 :利用质谱对步骤1中指纹图谱中的峰进行指认，确定紫外检测共有的指纹 峰；
[0011] 步骤3 :采用高效液相色谱可变波长检测法对步骤2中指认出的三个含量较大、活 性比较明显且结构明确的指标性成分含量进行测定。
[0012] 进一步的，步骤1的具体步骤如下：
[0013] (1)对照品溶液的制备：精密称定对照品丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸D、丹酚酸A、 丹酚酸-LM、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B，加超纯水溶解，定容至丹参素钠、原儿茶醛、丹酚 酸D、丹酚酸A、丹酚酸-LM终浓度分别为200-500 μ g/ml，迷迭香酸、紫草酸终浓度分别为 300-600 μ g/ml，丹酚酸 B 终浓度为 500-1500 μ g/ml 即得；
[0014] (2)供试品溶液的制备：分别精密称定10-50批丹参多酚酸提取物，样品溶于超纯 水，溶解后过滤膜，稀释成浓度为lmg/mL-5mg/mL的溶液；
[0015] (3)指纹图谱的测定：精密吸取供试品溶液1-5 μ L，注入超高效液相色谱仪，记录 色谱图，即得；
[0016] 其中，色谱条件如下：
[0017] 色谱柱：UPLC C18柱或Τ3柱；
[0018] 流动相：溶剂A冰，含〇. 1% -0.5%甲酸；溶剂B :乙腈，含1% -5%甲醇；
[0019] 梯度洗脱：
[0020] 0-3min, 12-18 % B ；3-15min, 18 % B ；15-17min, 18-20 % B ；17-25min, 20 % B ； 25-28min, 20-23 % B ；28-35min, 23 % B ；35-40min, 23-40 % B ；4〇-45min, 40-95 % B ； 45-50min, 95% B ；
[0021] 温度：30-40°C;
[0022] 流速：0· 2-0. 3ml/min ;
[0023] 色谱图光谱采集范围：190~400nm。
[0024] 优选的，步骤1中，
[0025] 色谱柱优选：UPLC C18柱；
[0026] 流动相优选：
[0027] 溶剂A冰，含0.2%甲酸；溶剂B:乙腈，含3%甲醇；或
[0028] 溶剂A :水，含0. 1 %甲酸；溶剂B :乙腈，含2%甲醇。
[0029] 本发明的UPLC的色谱条件是经过筛选获得的：
[0030] 1、色谱柱的选择
[0031] 本发明对比了目前广泛使用的三种不同厂牌色谱柱：(A)Fortis C1S1. 7μ m，2. lx 50mm ;(B) Agilent Eclipse Plus C18,1.8 μ m, 2. lx 150mm ;(C) Waters HSS T3C18,1.7 μ m, 2. lx 150mm。从三种柱子的液相对比谱图中可以看出，待分析成分在A型色谱柱上出峰时 间较晚，且分离效果不好，考虑到扩大生产的成本及最终成分指认结果的准确性，排除色谱 柱A ;而后对比丹参多酚酸样品在色谱柱B及色谱柱C中的图谱，可以明显看到色谱柱B较 C分离效果更好，且B图中的色谱峰数明显多于C图，有利于成分研究的全面性。后经反复 实验，发现Eclipse对于极性较大的酚酸类成分分离效果比较好，因此本发明优化选用了 Eclipse Plus C18色谱柱。色谱图见图1。
[0032] 2、洗脱梯度的筛选：
[0033] (1)采用溶剂A冰，含〇. 1 %甲酸，溶剂B :乙腈，进行系统优化，结果显示极性较 大的色谱与邻近杂质难以分离。记录如下：
[0034] (A)0-3min:12-20 % B, 3-10min:20-22 % B, l〇-22min:22 % B, 22-27min:22-35 % B, 27-29min:35% -50% B ；
[0035] (B) 0-3min:12-18 % B, 3-10min:18-22 % B, l〇-12min:22 % B, 12-22min, 22-25 % B ；22-27min:25-35% B, 27-29min:35% -50% B ；
[0036] (C) 0-2min: 12-18 % B, 2-5min: 18-22 % B, 5-15min: 22-25 % B, 15-20min: 25-45 % B, 20-25min:45% -95% B.
[0037] 色谱图见图2。
[0038] (2)将流动相优化为溶剂A冰，含〇. 2%甲酸，溶剂B :乙腈，含2%甲醇，对分离细 节改善明显，5-10分钟得到分离。进一步优化，高极性酚酸在18%有机相等度洗脱中得到 分离（图3,13min)。记录如下：
[0039] (A) 0-3min: 12-18 % B, 3-10min: 18-20 % B, l〇-20min: 20 % B ；
[0040] (B) 0-3min: 12-17 % B, 3-20min: 17 % B, 2〇-23min: 17-20 % B ；
[0041] (C) 0-3min: 12-18 % B, 3-15min: 18 % B, 15-17min: 18-20 % B, 17-25min: 20 % B.
[0042] 色谱图见图3、图4(图3放大图）。
[0043] 3、方法学考察
[0044] (1)精密度试验
[0045] 取供试品溶液（批号20130202)，连续进样6次，以紫草酸为参照，分别对共有峰相 对保留时间和相对峰面积进行考察。各共有峰相对保留时间的RSD均小于0. 5%，相对峰面 积的RSD均小于3. 0%，表明仪器精密度良好。
[0046] (2)重复性实验
[0047] 取样品（批号20130202) 6份，按上述步骤1中方法制备供试品溶液，并进行检测， 以紫草酸为参照分别对共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行考察。各共有峰相对保留 时间的RSD均小于0. 5%，相对峰面积的RSD均小于3. 5%，表明本方法重复性良好。
[0048] (3)稳定性试验
[0049] 取供试品溶液（批号为130301)，分别于0, 2,4,8,12, 24h进样分析，以紫草酸为参 照，分别对共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行考察。
[0050] 结果表明，各共有峰相对保留时间的RSD均小于0. 5%，相对峰面积的RSD均小于 3.0%。表明供试品溶液在室温24h内稳定。
[0051] 丹参多酚酸提取物样品UPLC色谱图（280nm)参见图5。
[0052] 利用本发明步骤1的方法可对多批丹参多酚酸提取物样品进行UPLC指纹图谱分 析，并对各样品的23个共有峰紫外光谱进行对比分析，从而对多批丹参多酚酸提取物样品 的一致性与稳定性进行鉴定。
[0053] 对于不同批次指纹图谱相似度的对比分析，可采用市面上售卖的多种软件进行。
[0054] 本发明优选采用"中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统4. 0"软件对结果 信号进行二级定量指纹图谱分析，确定了对照指纹图谱，并以此为参照计算各批次指纹图 谱的相似度，得到多批样品的最终指纹图谱质量结果。
[0055] 系统指纹定量法客观、准确地定量描述各化学物质对复方制剂化学指纹的贡献大 小。把丹参多酚酸提取物UPLC指纹看作一个整体，用宏定性相似度（