0 μ g/ml，丹酚酸B质量浓度为1. Omg/ml的混合对照品溶液。
[0218] (4)精密吸取供试品溶液5μ L，注入高效液相色谱仪，采用外标峰面积法，同时测 定供试品溶液中迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸Β的含量；
[0219] 其中，色谱条件如下：
[0220] 色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 (4. 6 X 250mm, 5 μ m);
[0221] 流动相：A相冰，含〇. 3%的甲酸；B相：含3%的甲醇和0. 3%的甲酸；
[0222] 梯度洗脱：0 ~40min，20 % Β ;40 ~50min，20-70 % Β ;
[0223] 流速：0· 9mL/min ;
[0224] 柱温：35°C ;
[0225] 检测波长288nm ;
[0226] 实施例3
[0227] 步骤1 :采用超高效液相多波长可见紫外检测法，建立丹参多酚酸提取物数字化 定量指纹图谱；
[0228] (1)对照品溶液的制备：
[0229] 分别称取丹酚酸B对照品约7. 5mg ;迷迭香酸、紫草酸对照品各约2mg ;丹参素钠、 原儿茶醛、丹酚酸D、丹酚酸A、丹酚酸-LM对照品各约2. 5mg，于5mL容量瓶，以超纯水定容， 摇匀，过微孔滤膜（0. 22 μ m)，取续滤液，即得。
[0230] (2)供试品溶液的制备：分别精密称定50批丹参多酚酸提取物，样品溶于超纯水， 定溶至10ml容量瓶中，溶解后过0. 22 μ m滤膜，稀释成浓度为3mg/mL的溶液；
[0231] (3)指纹图谱的测定：精密吸取供试品溶液5 μ L，注入超高效液相色谱仪，记录色 谱图，即得；
[0232] 其中，色谱条件如下：
[0233] 色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18, 1. 8 μ m，2. lx 150mm ;
[0234] 流动相：溶剂A冰，含〇. 5%甲酸；溶剂B :乙腈，含5%甲醇；
[0235] 梯度洗脱：
[0236] 0-3min, 12-18 % B ；3-15min, 18 % B ；15-17min, 18-20 % B ；17-25min, 20 % Β ； 25-28min, 20-23 % B ；28-35min, 23 % B ；35-40min, 23-40 % B ；4〇-45min, 40-95 % Β ； 45-50min, 95% Β ；
[0237] 温度：35°C ;
[0238] 流速：0· 2ml/min ;
[0239] 色谱图光谱采集范围：190~400nm。
[0240] 步骤2 :利用质谱对步骤1中指纹图谱中的峰进行指认，确定紫外检测共有的指纹 峰；
[0241] 质谱条件如下：
[0242] qTOF采用（_)-ESI离子源，雾化气为高纯氮气，碰撞气为高纯氦气；
[0243] 扫描范围：m/z100 -1200 ;
[0244] 碰撞能量：6eV ;
[0245] MSE 梯度裂解能：20-40eV ;
[0246] 用上述色谱条件对50批丹参多酚酸提取物样品进行UPLC指纹图谱分析。对各样 品的23个共有峰紫外光谱图进行对比分析。
[0247] 利用"中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统4. 0"软件计算各批次指纹图 谱的相似度。
[0248] 采用表1中所示的系统指纹定量法标准，对50批样品进行质量评价。
[0249] 步骤3 :采用高效液相色谱可变波长检测法对步骤2中指认出的三个含量较大、活 性比较明显且结构明确的指标性成分含量进行测定。
[0250] (1)供试品溶液的制备：精密称取丹参多酚酸提取物，加初始流动相溶解并定容 到1. Omg/mL，摇匀，即得。
[0251] (2)混合对照品溶液的制备：分别精密称取迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B对照品各 适量，加初始流动相制成混合对照品溶液，得迷迭香酸质量浓度为150 μ g/ml,紫草酸质量 浓度为1〇〇 μ g/ml，丹酚酸B质量浓度为2. 5mg/ml的混合对照品溶液。
[0252] (4)精密吸取供试品溶液1 μ L，注入高效液相色谱仪，采用外标峰面积法，同时测 定供试品溶液中迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸Β的含量；
[0253] 其中，色谱条件如下：
[0254] 色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 (4. 6 X 250mm, 5 μ m);
[0255] 流动相：A相：水，含0.6%的甲酸；B相：含4%的甲醇和0.6%的甲酸；
[0256] 梯度洗脱：0 ~40min，20 % Β ;40 ~50min，20-70 % Β ;
[0257] 流速：1. lmL/min ;
[0258] 柱温：30°C ;
[0259] 检测波长288nm。
【主权项】
1. 一种丹参多酚酸提取物指纹图谱及含量测定方法，其特征在于，步骤如下： 步骤1 :采用超高效液相多波长可见紫外检测法，建立丹参多酚酸提取物数字化定量 指纹图谱； 步骤2 :利用质谱对步骤1中指纹图谱中的峰进行指认，确定紫外检测共有的指纹峰； 步骤3 :采用高效液相色谱可变波长检测法对步骤2中指认出的三个含量较大、活性比 较明显且结构明确的指标性成分含量进行测定。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1的具体步骤如下： (1) 对照品溶液的制备：精密称定对照品丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸D、丹酚酸A、丹 酚酸-LM、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B，加超纯水溶解，定容至丹参素钠、原儿茶醛、丹酚 酸D、丹酚酸A、丹酚酸-LM终浓度分别为200-500 μ g/ml，迷迭香酸、紫草酸终浓度分别为 300-600 μ g/mL，丹酚酸 B 终浓度为 500-1500 μ g/mL，即得； (2) 供试品溶液的制备：分别精密称定10-50批丹参多酚酸提取物，样品溶于超纯水， 溶解后过滤，稀释成浓度为lmg/mL-5mg/mL的溶液； (3) 指纹图谱的测定：精密吸取供试品溶液1-5 μ L，注入超高效液相色谱仪，记录色谱 图，即得； 其中，色谱条件如下： 色谱柱：UPLC C18柱或Τ3柱； 流动相：溶剂A冰，含〇. 1 % -〇. 5%甲酸；溶剂B :乙腈，含1 % -5%甲醇； 梯度洗脱： 0-3min, 12-18 % B ；3-15min, 18 % B ；15-17min, 18-20 % B ；17-25min, 20 % B ； 25-28min, 20-23 % B ；28-35min, 23 % B ；35-40min, 23-40 % B ；4〇-45min, 40-95 % B ； 45-50min, 95% B ； 温度：30-40°C ; 流速：〇· 2-0. 3ml/min ; 色谱图光谱采集范围：190~400nm。3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1中， 色谱柱优选：UPLC C18柱； 流动相优选： 溶剂A :水，含0.2%甲酸；溶剂B :乙腈，含3%甲醇；或 溶剂A冰，含〇. 1%甲酸；溶剂B :乙腈，含2%甲醇。4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中的质谱条件如下： 四级杆-飞行时间质谱采用（_)-ESI离子源，雾化气为高纯氮气，碰撞气为高纯氦气； 扫描范围：m/z100 -1200 ; 碰撞能量：6eV ; MSE梯度裂解能：20-40eV。5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3中所述三种指标性成分分别为迷迭香 酸、紫草酸、丹酚酸B。6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3的具体步骤如下： (1)供试品溶液制备：取丹参多酚酸提取物，精密称定，加初始流动相溶解并定容至终 浓度为〇· 6-1. 2mg/mL，摇匀，即得； (2) 混合对照品溶液制备：分别精密称取迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B对照品各适量，加 初始流动相制成混合对照品溶液，得迷迭香酸质量浓度为100-150 μ g/mL，紫草酸质量浓度 为100-150 μ g/mL，丹酚酸B质量浓度为1. 0-2. 5mg/mL的混合对照品溶液； (3) 精密吸取供试品溶液1-5 μ L，注入高效液相色谱仪，采用外标峰面积法，同时测定 供试品溶液中迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸Β的含量； 其中，色谱条件如下： 色谱柱：HPLC C18柱； 流动相：A相冰，含0.3%~0.6%的甲酸；B相：乙腈，含2%~4%的甲醇和0.3%~ 0. 6%的甲酸； 梯度洗脱：〇 ~40min，20 % B ;40 ~50min，20-70 % B ; 流速：〇· 9_L lmL/min ； 柱温：30°C -35°C ; 检测波长：288nm ; 其中，步骤（1)、（2)中所述初始流动相，是指80% A流动相和20% B流动相的混合溶 液。7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤3中， 流动相优选： A相冰，含0.5%的甲酸；B相：乙腈，含2%的甲醇和0.5%的甲酸；或 A相冰，含〇. 3%的甲酸；B相：乙腈，含3%的甲醇和0. 3%的甲酸； 流速优选lmL/min ; 柱温优选30°C。8. 如权利要求1~7任一所述的方法，其中丹参多酚酸提取物，可根据现有技术中的任 一合适方法进行制备，也可以制备成任一制剂。9. 如权利要求8所述的方法，其中丹参多酚酸提取物制备方法为：取丹参饮片，用纯化 水煎煮提取三次，每次〇. 5~1小时，将三次提取液合并，冷却，用盐酸溶液调节至酸性，放 置4~8小时，过滤，得澄明药液，将药液用聚酰胺柱层析工艺纯化，上样后用纯化水冲洗， 以碳酸氢钠溶液进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液用盐酸溶液调节至酸性，采用大孔树脂柱 层析工艺纯化药液，上样后用纯化水冲洗，以乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液减 压浓缩回收乙醇，所得浓缩液冷藏12~24小时后过滤，滤液用氢氧化钠溶液调节pH值至 5. 3~6. 0,冷冻干燥，即得。10. 如权利要求8所述的方法，其中丹参多酚酸提取物为注射剂，其制备方法为：取重 量比为1 :〇. 1~0. 5的丹参多酚酸提取物及甘露醇，分别加入10~20倍重量体积比的注射 用水溶解；将上述两种溶液混合均匀后加入药用炭，加热搅拌，过滤，药液降温后进行超滤， 将滤液调节pH值至5. 5~6. 0,加注射用水定容，搅拌均匀，将上述药液微孔滤膜过滤后灌 装至西林瓶中，冷冻干燥，即得注射用丹参多酚酸。
【专利摘要】本发明涉及一种丹参多酚酸提取物指纹图谱的建立及有关成分的含量测定方法，包括如下步骤：步骤1：采用超高效液相多波长可见紫外检测法，建立丹参多酚酸提取物数字化定量指纹图谱；步骤2：利用质谱对步骤1中指纹图谱中的峰进行指认，确定紫外检测共有的指纹峰；步骤3：采用高效液相色谱可变波长检测法对步骤2中指认出的三个含量较大、活性比较明显且结构明确的指标性成分含量进行测定。
【IPC分类】G01N27/64, G01N30/02
【公开号】CN105588885
【申请号】CN201410572435
【发明人】佟玲, 徐静瑶, 刘小琳, 岳洪水, 鞠爱春
【申请人】天津天士力之骄药业有限公司
【公开日】2016年5月18日
【申请日】2014年10月24日