一种采用液相色谱法测定阿普斯特及其制剂中杂质的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分析化学领域，具体涉及用液相色谱法测定阿普斯特及其制剂中杂质 的方法。
【背景技术】
[0002] 阿普斯特（Methylnaltrexone bromide)是一种憐酸二酯酶-4 (FOE-4)的抑制剂， 其分子式为C22H24N20 7S，其结构式见下式（a)化合物。
[0003] 阿普斯特的化学名为：（S)-2-[l_(3-乙氧基-4-甲氧基苯基）-2_甲磺酰基乙 基]-4-乙酰基氨基异吲哚啉-1，3-二酮。在合成该化合物的过程中，有几步重要的中间 体和未知杂质可能会由于去除不完全而影响药物的纯度和质量，这些已知中间体和未知杂 质以及产生的降解产物即为药物质量控制中通常所说的有关物质（即杂质)。对于阿普斯 特的合成主要控制的已知杂质有八个，分别是：起始原料SM2,其结构式见下式（b);中间体 Π ，其结构式见下式（c);中间体IV，其结构式见下式（d) ;IP1，其结构式见下式（e) ;IP8， 其结构式见下式（f) ;IP9,其结构式见下式（g) ;IP10,其结构式见下式（h) ;IP14,其结构 式见下式（i)。其中，中间体II即式（c)可通过商业途径购买；IP1、IP9、IP10和IP14已 在 Disposition, metabolism and mass balance of [14C]apremilast following oral administration vfewoAioiica, 2011; 41(12) :1063 - 1075 中公开。
[0004] 可见，阿普斯特的相关物质较多，且结构类似，给分离带来难度，另外，各个杂质的 极性各不相同，有极性差异较大的中间体IV和IP1，有极性相近的IP9和IP10、以及IP1和 IP14,在满足阿普斯特与各个杂质分离的前提下，还要满足杂质与杂质之间的分离，这使检 测增大了难度。采用常规的检测手段方法难以实现阿普斯特与杂质以及杂质与杂质之间的 有效分离，这会影响阿普斯特及其制剂的质量控制。
[0005] 为了准确地控制阿普斯特及制剂产品的质量，有必要研究一种能简单、快速、准确 地分离检测出阿普斯特及其制剂有关物质的方法。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种用液相色谱法（HPLC)分离测定阿普斯特及其制剂中 杂质的方法，该方法能有效实现阿普斯特与杂质、杂质与杂质之间的分离和测定，从而实现 对阿普斯特及其制剂质量的有效控制。
[0007] 这里所说的杂质是指从合成过程中引入的杂质或原料药或其制剂降解产生的杂 质，包括起始原料等，还包括已知结构杂质和未知结构杂质。所述测定阿普斯特及其制剂中 的杂质是指测定阿普斯特原料药和含有阿普斯特的制剂中的杂质或称为相关物质，所述已 知结构的杂质包含：4_氨基-2-[l- (3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2_ (甲基磺酰基)乙基]-1H-异吲哚-1，3 (2H)-二酮(简称IP1)、3-乙酰基邻苯二甲酸(简称ΙΡ8)、Ν-{2-[1-(3-乙 氧基-4-羟基苯基）-2-(甲基磺酰基）乙基]-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基}乙酰胺(简称 ΙΡ9)、Ν-{2-[1- (3-乙氧基-4-羟基苯基）-2-(甲基磺酰基）乙基]-1,3-二氧代异吲哚 啉-5-基}乙酰胺(简称ΙΡ10)、Ν-{2-[1- (3-乙氧基-4-甲氧基苯基）-2-(甲基磺酰基） 乙基]-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基}-2-羟基乙酰胺(简称IP14)、3-硝基邻苯二甲酸(简 称SM2)、（S)-1- (3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-(甲基磺酰基）乙胺，N-乙酰基-L-亮氨 酸盐(简称中间体II)或3-氨基邻苯二甲酸(简称中间体IV)。
[0008] 为实现本发明的方法，提供了如下实施方案： 在一实施方案中，本发明的一种采用液相色谱法测定阿普斯特及其制剂中杂质的方 法，包括： a) 采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱； b) 以缓冲溶液为流动相A，甲醇与乙腈的混合溶剂为流动相B ; c) 流动相采用梯度洗脱方法，流速为0. 8ml/min~1. 2ml/min，用紫外检测器进行检 测； 其中，所述缓冲溶液为磷酸、磷酸盐溶液或它们的混合物，甲醇和乙腈的体积比为60 : 40~40 :60〇
[0009] 在上述实施方案中，本发明的方法，所说的缓冲溶液的pH为2.0至2. 4,优选 ρΗ2· 0至2. 3,最优为ρΗ2· 3 ;缓冲溶液的浓度为0· 0001mol/L至lmol/L，优选为0· OOlmol/ L至0. lmol/L，最优选为0. 01m〇l/L ;所说的缓冲溶液优选为磷酸盐缓冲溶液，其浓度为 0· 0001mol/L 至 lmol/L，优选 0· 001mol/L 至 0· 01mol/L，最优 0· 01mol/L ;所说的磷酸盐为 磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢铵、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠或磷酸氢二铵，优选磷酸二 氢钾。
[0010] 在上述实施方案中，本发明的方法，所说的色谱柱选自下列牌号的色谱柱： Agilent Eclipse Plus C18、Agilent Zorbax SB_C18、Agilent Zorbax XDB_C18、Agilent Zorbax Extend-C18、Welch XB-C18 和 Welch AQ-C18 色谱柱。
[0011] 在上述实施方案中，本发明的方法，所说的梯度洗脱方法为：〇分钟，流动相A为 95%~80%(V/V)，流动相B为5%~20%(V/V);0分钟至8分钟，流动相A线性减少至80%~ 60% (V/V)，流动相B线性增加至20%~40% (V/V);8分钟至40分钟，流动相A线性减少至 20%~0% (V/V)，流动相B线性增加至80%~100% (V/V) ;40分钟至50分钟，流动相A为 20%~0% (V/V)，流动相B为80%~100% (V/V) ;50分钟至53分钟，流动相A线性增加至 95%~80% (V/V)，流动相B线性减少至5%~20% (V/V) ;53分钟至60分钟，流动相A为 95%~80% (V/V)，流动相B为5%~20% (V/V);即50分钟后为平衡色谱柱。
[0012] 在上述实施方案中，本发明的方法，优选的梯度洗脱方法为：0分钟，流动相A为 95% (V/V)，流动相B为5% (V/V) ;0分钟至8分钟，流动相A线性减少至80% (V/V)，流动 相B线性增加至20% (V/V) ;8分钟至40分钟，流动相A线性减少至20% (V/V)，流动相B 线性增加至80% (V/V);40分钟至50分钟，流动相A为20% (V/V)，流动相B为80% (V/V); 50分钟至53分钟，流动相A线性增加至95% (V/V)，流动相B线性减少至5% (V/V) ;53分 钟至60分钟，流动相A为95% (V/V)，流动相B为5% (V/V);即50分钟后为平衡色谱柱。
[0013] 在上述实施方案中，本发明的方法，还包括以下步骤： a)供试品溶液的配制：取阿普斯特或含阿普斯特的制剂适量，加稀释剂溶解样品，并 配 制成每lml含阿普斯特0. 5至lOmg的样品溶液作为供试品溶液； b) 对照溶液的配制：精密量取供试品溶液适量，加稀释剂制成浓度为供试品溶液浓度 0. 1%~2. 0%的溶液，作为对照溶液； c) 设置流动相的流速为0. 8~1. 2ml/min，优选1.0ml/min ;设置检测波长为200nm 至250nm，优选230nm ;设置色谱柱的柱温为15°C至40°C，优选25°C ;设置进样量为5ml至 l〇〇ml，优选20ml ;分别精密量取等体积供试品溶液与对照溶液，注入液相色谱仪，记录色 谱图，完成供试品溶液有关物质的分离测定； 其中，所述稀释剂为乙腈和水的混合溶液，乙腈与水的体积比为5 :95~30 :70,优选 20 ：80〇
[0014] 在一具体实施方案中，本发明的一种采用液相色谱法测定阿普斯特及其制剂中杂 质的方法，包括：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以0.0 lmol/L磷酸二氢钾溶 液为流动相A，其pH值为2. 3,以体积比为45 :55(V/V)的甲醇-乙腈为流动相B，进行梯度 洗脱：〇分钟，流动相A为95% (V/V)，流动相B为5% (V/V);0分钟至8分钟，流动相A线性 减少至80% (V/V)，流动相B线性增加至20% (V/V);8分钟至40分钟，流动相A线性减少至 20% (V/V)，流动相B线性增加至80% (V/V) ;40分钟至50分钟，流动相A为20% (V/V)，流 动相B为80% (V/V) ;50分钟至53分钟，流动相A线性增加至95% (V/V)，流动相B线性减 少至5% (V/V) ;53分钟至60分钟，流动相A为95% (V/V)，流动相B为5% (V/V);即50分 钟后为平衡色谱柱，包括以下步骤： a) 供试品溶液的配制：取阿普斯特或含阿普斯特的制剂适量，加稀释剂溶解样品，并配 制成每lml含阿普斯特0. 5至10mg的样品溶液作为供试品溶液； b) 对照溶液的配制：精密量取供试品溶液适量，加稀释剂制成浓度为供试品溶液浓度 0. 1%~2. 0%的溶液，作为对照溶液； c) 设置流动相的流速为0. 8~1. 2ml/min，优选1.0ml/min ;设置检测波长为200nm 至250nm，优选230nm ;设置色谱柱的柱温为15°C至40°C，优选25°C ;设置进样量为5ml至 l〇〇ml，优选20ml ;分别精密量取等体积供试品溶液与对照溶液，注入液相色谱仪，记录色 谱图，完成供试品溶液有关物质的分离测定； 其中，所述稀释剂为乙腈和水的混合溶液，乙腈与水的体积比为5 :95~30 :70,优选 20 ：80〇
[0015] 本发明所述的杂质包括已知结构的杂质和其它未知结构的杂质(包括降解产物)。 所述的 已知结构的杂质包含选自以下化合物中的一种或多种：IP1、IP8、IP9、IP10、IP14、 SM2、中间体II和中间体IV。
[0016] 本发明采用Agilent Eclipse Plus C18色谱柱，能够有效的分离检测阿普斯特及 其制剂中的杂质。选用水与乙腈混合液作为稀释剂溶解样品，排除了溶剂峰的干扰和溶剂 效应；采