用梯度洗脱，确保能够使阿普斯特与杂质、杂质与杂质之间得到有效分离；配合磷 酸二氢钾，可以增强保留，改善分离度，确保色谱峰的良好对称性和较高的柱效；流动相B 选择甲醇和乙腈的混合溶液，增大了分离度，使杂质与杂质之间得到有效分离。
[0017] 本发明的方法可以将阿普斯特与相邻的杂质峰、降解产物以及起始原料、中间体 II、中间体IV以及各个已知结构的杂质达到有效分离，能准确测定杂质，而且峰形对称，柱 效较高，从而解决了阿普斯特及其制剂有关物质(杂质：包括起始原料、中间体和降解产物） 分离和测定较为困难的问题，从而保证了阿普斯特及其制剂的质量可控。
【附图说明】
[0018] 图1稀释剂的液相色谱图 图2 SM2 (起始原料）对照溶液的液相色谱图 图3中间体II对照溶液的液相色谱图 图4中间体IV对照溶液的液相色谱图 图5 IP1对照溶液的液相色谱图 图6 IP8对照溶液的液相色谱图 图7 IP9对照溶液的液相色谱图 图8 IP10对照溶液的液相色谱图 图9 IP14对照溶液的液相色谱图 图10阿普斯特+SM2+中间体11+中间体IV+IP1+IP8+IP9+IP10+IP14的液相色谱图 图11阿普斯特原料药有关物质供试品溶液的液相色谱图 图12阿普斯特原料药有关物质1.0%对照溶液的液相色谱图 图13阿普斯特片杂质测定供试品溶液的液相色谱图 图14阿普斯特片杂质测定空白辅料供试液的液相色谱图。
[0019]
【具体实施方式】
[0020] 实施例1 仪器与条件 Agilent 1200型液相色谱仪及化学工作站；自动进样；以Agilent Eclipse Plus C18 柱（5臟，250\4.6111111)为分离色谱柱；紫外检测器波长：23011111 ;流动相：以0.01111〇1/1磷酸 二氢钾溶液(用磷酸溶液调节pH值至2. 3)为流动相A，以甲醇-乙腈（45 :55 ;V/V)为流动 相B，梯度洗脱；0分钟，流动相A为95% (V/V)，流动相B为5% (V/V);0分钟至8分钟，流动 相A线性减少至80% (V/V)，流动相B线性增加至20% (V/V);8分钟至40分钟，流动相A线 性减少至20% (V/V)，流动相B线性增加至80% (V/V) ;40分钟至50分钟，流动相A为20% (V/V)，流动相B为80% (V/V) ;50分钟至53分钟，流动相A线性增加至95% (V/V)，流动相 B线性减少至5% (V/V) ;53分钟至60分钟，流动相A为95% (V/V)，流动相B为5% (V/V); 即50分钟后为平衡色谱柱。柱温为25°C，流速：1.0ml/min，进样体积为20ml。
[0021] 操作方法： 分别取IP1、IP8、IP9、IP10、IP14、SM2、中间体II、中间体IV 10mg，精密称量，分别 置50ml量瓶中，加乙腈或水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液，分别精密量取贮备液 1.0ml，置10ml量瓶中，加稀释剂（乙腈：水=20 :80V/V)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质 对照溶液；取阿普斯特约l〇mg，精密称定，置50ml量瓶中，精密加入杂质贮备液各0. 5ml，加 稀释剂（乙腈：水=20 :80V/V)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为混合对照溶液。
[0022] 分别取稀释剂（乙腈：水=20 :80V/V)、阿普斯特对照溶液、各杂质对照溶液以及混 合对照溶液，按上述色谱条件进行液相色谱分析，记录色谱图，结果见图1、图2、图3、图4、 图5、图6、图7、图8、图9、图10。
[0023] 图10中依次出峰的顺序是中间体IV、IP8、中间体II、SM2、IP9、IP10、IP14、IP1、 阿普斯特。
[0024] 图1表明，稀释剂及色谱系统不干扰测定；图10证明，本法可以有效分离阿普斯特 中可能存在的未知结构的杂质和已知结构的杂质，即本方法可以用于阿普斯特及其制剂的 杂质的测定。
[0025] 实施例2 阿普斯特原料药中杂质的测定。
[0026] 取阿普斯特约10mg，精密称定，置50ml量瓶中，加稀释剂（乙腈：水=20 :80V/V)超 声处理使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另精密称取阿普斯特对照品l〇mg，置 50ml量瓶中，加稀释剂（乙腈：水=20 :80V/V)超声处理使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对 照溶液；照实施例1的色谱条件进行液相色谱分析，供试品溶液的色谱图中如有杂质峰(除 溶剂峰外)，已知杂质乘以校正因子后峰面积不得大于对照溶液主峰面积的1/2 (0. 5%)，单 个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积1/2 (0. 5%)，各杂质峰面积的和不得大于对照溶 液主峰面积（1.0%)。结果见图11、图12。
[0027] 实施例3 用液相色谱法测定阿普斯特片的杂质。
[0028] 取本品适量(约相当于阿普斯特10mg),置50ml量瓶中，加稀释剂（乙腈：水=20 : 80V/V)超声处理使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另精密称取阿普斯特对照品 10mg，置50ml量瓶中，加稀释剂（乙腈：水=20 :80V/V)超声处理使溶解并稀释至刻度，摇匀， 作为对照溶液；另按处方比例取空白辅料适量，照供试品溶液相同的方法制备空白辅料供 试液；照实施例1的色谱条件进行液相色谱分析，供试品溶液的色谱图中如有杂质峰(除溶 剂峰和空白辅料峰外)，已知杂质乘以校正因子后峰面积不得大于对照溶液主峰面积的1/2 (0. 5%)，单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积1/2(0. 5%)，各杂质峰面积的和不得大 于对照溶液主峰面积（1.0%)。结果见图13、图14。
[0029] 实施例4 参照实施例1的试验操作和条件参数，分别改变色谱条件中的流速、柱温、流动相B的 混合比例、缓冲液的pH值和色谱柱，其它条件及参数不变，考察阿普斯特与杂质、杂质与杂 质之间的分离情况。结果见下表：
根据上表的结果表明，本发明的方法均能使阿普斯特与杂质、杂质与杂质之间达到基 线分离，从而实现阿普斯特与杂质以及各杂质间有效的分离测定。本发明的方法专属性强， 准确度高，操作简便。
【主权项】
1. 一种采用液相色谱法测定阿普斯特及其制剂中杂质的方法，包括： a) 采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱； b) 以缓冲溶液为流动相A，甲醇与乙腈的混合溶剂为流动相B ; c) 流动相采用梯度洗脱方法，流速为0. 8ml/min~1. 2ml/min，用紫外检测器进行检 测； 其中，所述缓冲溶液为磷酸、磷酸盐溶液或它们的混合物，甲醇与乙腈的体积比为60 : 40 至 40 :60。2. 根据权利要求1所述的方法，所述缓冲溶液为磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢 铵、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二铵或它们的混合磷酸盐溶液。3. 根据权利要求2所述的方法，所述磷酸盐为磷酸二氢钾。4. 根据权利要求1-3任一所述的方法，所述缓冲溶液的浓度为0. 0001mol/L至lmol/ L〇5. 根据权利要求4所述的方法，所述缓冲溶液的浓度为0. 001m〇l/L至0. lmol/L。6. 根据权利要求1所述的分离测定方法，所说的缓冲溶液用磷酸溶液调节pH为2. 0至 2. 4。7. 根据权利要求1所述的方法，所述梯度洗脱方法为：0分钟，流动相A为95%~80%， 流动相B为5%~20% ;0分钟至8分钟，流动相A线性减少至80%~60%，流动相B线性增 加至20%~40% ;8分钟至40分钟，流动相A线性减少至20%~0%，流动相B线性增加至 80%~100% ;40分钟至50分钟，流动相A为20%~0%，流动相B为80%~100% ;50分钟至 53分钟，流动相A线性增加至95%~80%，流动相B线性减少至5%~20% ;53分钟至60分 钟，流动相A为95%~80%，流动相B为5%~20% ;即50分钟后为平衡色谱柱，流动相A和 流动相B均为体积百分比。8. 根据权利要求1所述的方法，还包含以下步骤： a) 供试品溶液的配制：取阿普斯特或含阿普斯特的制剂适量，加稀释剂溶解样品，并 配制成每lml含阿普斯特0. 5至10mg的样品溶液作为供试品溶液； b) 对照溶液的配制：精密量取阿普斯特对照品适量，加稀释剂制成浓度为供试品溶液 浓度0. 1%~2. 0%的溶液，作为对照溶液； 设置流动相的流速为〇. 8~1. 2ml/min，优选1. 0ml/min ;设置检测波长为200nm至 250nm，优选230nm ;设置色谱柱的柱温为15°C至40°C，优选25°C ;设置进样量为5ml至 l〇〇ml，优选20ml ;分别精密量取等体积的供试品溶液与对照溶液，注入液相色谱仪，记录 色谱图，完成供试品溶液有关物质的分离测定； 其中，所述稀释剂为乙腈和水的混合溶液，乙腈与水的体积比为5 :95~30 :70,优选 20 ：80〇9. 根据权利要求1所述的方法，所述杂质包含已知结构的杂质和未知结构的杂质。10. 根据权利要求9所述的方法，所述已知结构的杂质选自下列化合物中一种或多种： 4_氨基-2-[l- (3-乙氧基-4-甲氧基苯基）-2-(甲基磺酰基）乙基]-1H-异吲哚-1，3 (2H)-二酮、3-乙酰基邻苯二甲酸、Ν-{2-[1- (3-乙氧基-4-羟基苯基)-2-(甲基磺酰基） 乙基]-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基}乙酰胺、N-{2-[1- (3-乙氧基-4-羟基苯基)-2-(甲 基磺酰基）乙基]-1，3-二氧代异吲哚啉_5_基}乙酰胺、Ν-{2-[1- (3-乙氧基-4-甲氧基
【专利摘要】本发明公开了一种采用液相色谱法分离测定阿普斯特及制剂中杂质的方法，该方法以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，以缓冲溶液为流动相A，甲醇与乙腈的混合溶剂为流动相B，流动相采用梯度洗脱方法，测定阿普斯特及其制剂的杂质。该方法可以将阿普斯特与已知杂质和未知杂质进行有效分离和测定，专属性强，准确度高，操作简便，能有效控制阿普斯特及其制剂的质量。
【IPC分类】G01N30/02
【公开号】CN105588886
【申请号】CN201410653684
【发明人】熊娟, 代广会, 万娟, 张道林
【申请人】重庆医药工业研究院有限责任公司
【公开日】2016年5月18日
【申请日】2014年11月18日