]在一种优选的实施方式中，该应用还包括采用高效亲和色谱法测定头孢西丁在注射一定时间后与血浆蛋白的结合率。药物血浆蛋白结合率是药物与血浆蛋白结合的量占药物总浓度的百分率，是药物代谢动力学的重要参数之一。它影响药物在体内的分布、代谢与排泄，从而影响其作用强度和时间，并往往与药物的相互作用及作用机制等密切相关。因此，药物血浆蛋白结合率的研究对于指导临床合理用药都具有重要意义。
[0027]在一种优选的实施方式中，该应用还包括将一定浓度的头孢西丁处理Caco-2细胞，检测细胞形态、电阻值、头孢西丁的通透性和碱性磷酸酶活性，以检测头孢西丁的透膜性和细胞吸收能力。
[0028]在一种优选的实施方式中，该应用还包括将一定浓度的头孢西丁处理整体动物、S9、人肠微粒体及单克隆纯化酶检测头孢西丁体外代谢稳定性及代谢产物的鉴定，通过结合LC-MS/MS，NMR技术，在定量分析的基础上对头孢西丁可能的I相及II相代谢产物进行了鉴定。体外代谢稳定性是预测化合物生物半衰期的重要手段。基于肠微粒体技术以及重组单克隆P450酶技术建立了体外快速代谢酶鉴定及药物代谢相互作用平台。根据药物在肠微粒体中的消除速率以及在各种与药物代谢密切相关的P450酶亚型如CYPIA2、2A6、286、2C8、2C9、2C19、2D6、3A4等特异性抑制剂存在下的消除速率差异研究，判断何种酶亚型可能参与了该药的代谢。根据微粒体研究结果，进一步应用单克隆酶进行确证，并进行深入的酶动力学参数与代谢途径研究。
[0029]应用各种与药物代谢密切相关的CYP450酶亚型的特异性抑制剂，在体外肠微粒体体系中进行药物代谢表型的初步确证，而后根据初步结果选择相应的CYP450酶亚型单克隆酶进行确证。通过二种方法的结合研究，可以大降低研究成本，相比于国外直接应用单克隆酶进行研究，本项技术具有更为通用、简便及低成本的特点。
[0030]代谢产物与药物在体内的药效活性及毒性作用密切相关，通过结合LC-MS/MS，NMR等结构鉴定技术，在定量分析的基础上对该药物可能的I相及II相代谢产物进行了鉴定。
[0031]药物的II相代谢通常是其最终消除和解毒的过程，因此II相代谢研究对于深入了解药物的体内处置机制，尤其是有毒药物的解毒过程与机制具有十分重要的意义。本发明采用了小肠黏膜胞质液和微粒体及其混合液(S9)对化合物的II相代谢进行了系列研究。本发明采用以葡萄糖醛酸酶、硫酸酶水解后测定相应的I相代谢物或原形药的方法进行II相结合产生定量研究。
[0032]本发明还提供了临床前药物代谢动力学关键技术与研究体系在头孢西丁的应用，其包括将一定浓度的头孢西丁给予实验动物一定时间后，收集血液，采用高效亲和色谱法测定头孢西丁与血浆蛋白的结合率。
[0033]本发明还提供了临床前药物代谢动力学关键技术与研究体系在头孢西丁的应用，其包括将一定浓度的头孢西丁处理Caco-2细胞，检测细胞形态、电阻值、头孢西丁的通透性和碱性磷酸酶活性，以检测头孢西丁的透膜性和细胞吸收能力。
[0034]本发明还提供了临床前药物代谢动力学关键技术与研究体系在头孢西丁的应用，其包括将一定浓度的头孢西丁处理整体动物、S9、人肠微粒体及单克隆纯化酶，检测头孢西丁体外代谢稳定性及代谢产物的鉴定，通过结合LC-MS/MS，NMR技术，在定量分析的基础上对该药物可能的I相及II相代谢产物进行了鉴定。
[0035]本发明提供的临床前药物代谢动力学关键技术与研究体系在头孢西丁的应用，其包括采用高通量、高灵敏度定量分析技术，运用新的高效亲和色谱法测定头孢西丁在注射后的血浆蛋白结合率，运用Caco-2细胞模型对其透膜性和细胞吸收能力进行了评价的综合运用。
【主权项】
1.临床前药物代谢动力学关键技术与研究体系在头孢西丁的应用，其包括: (1)将一定浓度的头孢西丁给予实验动物一定时间后，收集血液、尿液和粪便中的一种或多种生物样品； (2)将步骤(I)中获得的生物样品采用液液萃取、蛋白沉淀、固相萃取技术进行处理，制成相应的溶液； (3)采用液相色谱-质谱(LC-MS)、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析步骤(2)中制备的溶液。2.根据权利要求1所述的应用，其中，在步骤(2)中，所述液液萃取采用乙酸乙酯和氨水的混合物以及乙酸乙酯和氢氧化钠的混合物，所述蛋白沉淀采用甲醇沉淀、乙腈沉淀、甲醇和乙腈混合物沉淀。3.根据权利要求1所述的应用，其中，在步骤(3)中，通过系统优化流动相组成、流动相梯度流速、质谱离子化条件，以提高对头孢西丁定量分析的灵敏度。4.根据权利要求1-3中任意一项所述的应用，其中，该应用还包括采用高效亲和色谱法测定头孢西丁在注射一定时间后与血浆蛋白的结合率。5.根据权利要求1-4中任意一项所述的应用，其中，该应用还包括将一定浓度的头孢西丁处理Caco-2细胞，检测细胞形态、电阻值、头孢西丁的通透性和碱性磷酸酶活性，以检测头孢西丁的透膜性和细胞吸收能力。6.根据权利要求1-5中任意一项所述的应用，其中，该应用还包括将一定浓度的头孢西丁处理整体动物、S9、人肠微粒体及单克隆纯化酶检测头孢西丁体外代谢稳定性及代谢产物的鉴定，通过结合LC-MS/MS，NMR技术，在定量分析的基础上对该药物可能的I相及II相代谢产物进行了鉴定。7.临床前药物代谢动力学关键技术与研究体系在头孢西丁的应用，其包括将一定浓度的头孢西丁给予实验动物一定时间后，收集血液，采用高效亲和色谱法测定头孢西丁与血浆蛋白的结合率。8.临床前药物代谢动力学关键技术与研究体系在头孢西丁的应用，其包括将一定浓度的头孢西丁处理Caco-2细胞，检测细胞形态、电阻值、头孢西丁的通透性和碱性磷酸酶活性，以检测头孢西丁的透膜性和细胞吸收能力。9.临床前药物代谢动力学关键技术与研究体系在头孢西丁的应用，其包括将一定浓度的头孢西丁处理整体动物、S9、人肠微粒体及单克隆纯化酶，检测头孢西丁体外代谢稳定性及代谢产物的鉴定，通过结合LC-MS/MS，NMR技术，在定量分析的基础上对该药物可能的I相及II相代谢产物进行了鉴定。
【专利摘要】本发明提供了临床前药物代谢动力学关键技术与研究体系在头孢西丁的应用，其包括：(1)将一定浓度的头孢西丁给予实验动物一定时间后，收集血液、尿液和粪便中的一种或多种生物样品；(2)将步骤(1)中获得的生物样品采用液液萃取、蛋白沉淀、固相萃取技术进行处理，制成相应的溶液；(3)采用液相色谱-质谱(LC-MS)、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析步骤(2)中制备的溶液。本发的应用，其还可采用Caco-2细胞检测头孢西丁的透膜性和细胞吸收能力，或采用整体动物、S9、人肠微粒体及单克隆纯化酶，检测头孢西丁体外代谢稳定性及代谢产物的鉴定。
【IPC分类】G01N30/02, G01N33/50
【公开号】CN105588894
【申请号】CN201510924528
【发明人】卢婷, 刘晓东
【申请人】刘晓东, 山西振东泰盛制药有限公司
【公开日】2016年5月18日
【申请日】2015年12月14日