一种血清中GABA、Glu、DA、5-HT及苯丙胺类毒品的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物医药检测技术领域，具体属于药代动力学、生物样本含量测定领 域，尤其设及一种血清中6484細11、04、5-町及苯丙胺类毒品的检测方法。
【背景技术】
[0002] W甲基苯丙胺（Methamphetamine，简称MA，俗称：冰毒，其它苯丙胺类化合包括 Amphetamine :Amp ; 3 , 4-Methylenedioxyamphetamine :MDA; 3 , 4-Methylenedioxymethamphetamine:MDMA;3,4-Methylenedioxyethylamphetamine:MDEA)为 代表的新型毒品正成为全球范围内滥用最广泛、蔓延最迅速、危害最严重的毒品。研究表 明，甲基苯丙胺可损害中枢神经细胞，在一定的大脑区域，使滥用者出现多己胺和5-径色胺 水平下降、酪氨酸径化酶及色氨酸径化酶活性下降、多己胺和5-径色胺吸收转运能力下降 W及组织学可见的末端损伤，提示多己胺和5-HT在中枢神经系统中的含量变化与吸毒人员 滥用程度具有相关性。此外，研究显示中枢神经系统中GABA、Glu含量变化与苯丙胺类毒品 的滥用程度存在关联。通过测定血清中上述四种神经递质和苯丙胺类化合物的含量变化规 律，可间接反映神经系统中上述神经递质与苯丙胺类毒品成癒之间的关系。
[0003] 6484、6111、04、5-肌及苯丙胺类均属于小分子极性化合物，04、5-肌及苯丙胺类为 含氨基的碱性化合物，GABA和Glu为即含氨基又含簇基的两性化合物。此外，GABA、Glu、DA及 5-HT是血液中内源性存在的化合物，且浓度相差较大，运些特点给同时测定上述化合物造 成极大困难。目前，将上述内源性氨基酸、儿茶酪胺与苯丙胺类等九种化合物同时测定的 LC-MS/MS方法尚未见报道。
[0004] 相关技术中测定此S类化合物的方法包括HPLC法、电化学法、离子色谱-质谱联用 法、衍生化法、固相微萃取法及GC-MS法等。上述方法存在如下问题:HPLC操作简便，但灵敏 度较低，选择性差，常需衍生化或固相萃取等复杂耗时的样品前处理过程;电化学方法灵密 度低;离子色谱-质谱联用法需用到缓冲盐离子对，常无法与质谱检测器兼容;GC-MS法样品 处理过程繁琐，费时费力，且平均检测时间较长，不适合大样本检测。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于针对吸毒人员血清中6484、6111、04、5-肌及苯丙胺类含量测定 的技术难题，避免现有技术中的上述不足之处而提供一种建立样本处理简便、方法灵敏、及 实用性强的同时测定上述化合物的，用于评价吸毒人员血清样本中神经递质含量变化与苯 丙胺滥用程度相关性的LC-MS/MS检测方法。
[0006] 本发明的目的通过W下技术方案实现：
[0007] 提供了一种血清中6484、6111、04、5-肌及苯丙胺类毒品的检测方法，其特征在于： 包括W下步骤：
[000引81:标准溶液的配制：包括6484、6111、04、5-1'山和苯丙胺类储备液、标准曲线工作 溶液、质控工作溶液的配制W及内标化合物储备液和工作溶液的配制;其中，所述苯丙胺类 储备液为商品化的Img ? m[i的甲醇溶液，所述Glu采用内标一点法测定，无标准曲线工作溶 液；
[0009] S2:"空白"血清样本和吸毒人员血清样本的处理:吸取"空白"血清样本，分别加入 GABA、DA、5-TH及苯丙胺类化合物的标准曲线工作溶液或质控工作溶液，再依次加入含Glu-(15;氯乙酸溶液和含DA-cU和Amp-d6的乙腊溶液，满旋震荡、离屯、，吸取上清液待测；未知生 物样本除不添加标准曲线或质控工作溶液外，其它处理方式同上，并采用50%的甲醇-水溶 液补齐预设体积；
[0010] S3:液相色谱-质谱联用仪检测：将步骤S2中获得的上清液进行检测，检测的化合 物包括GABA、Glu、DA、5-HT及苯丙胺类，所述苯丙胺类包括Amp、MA、MDA、MDMA及MDEA;
[0011 ] S4:标准曲线的绘制，其中，所述Glu采用内标一点法测定，无标准曲线。
[0012] 优选地，所述S氯乙酸溶液、乙腊、"空白"血清样本或吸毒人员血清样本的体积比 为1:1:1;所述满旋设置为4000巧m、5min，离屯、为4°C14000巧m、10min。
[0013] 优选地，步骤S2中"空白"血清样本和吸毒人员血清样本的体积为80化，所述添加 的GABA、DA、5-TH及苯丙胺类化合物的标准曲线工作溶液或质控工作溶液的体积为20化，含 Glu-dsS氯乙酸溶液的体积为80化，含DA-Ck和Amp-d6的乙腊溶液体积为80化;所述S氯乙 酸溶液浓度为0.6N，其中，所述Glu采用内标一点法测定，无标准曲线工作溶液，样本的预设 体积采用50%的甲醇-水溶液补齐至预定值。
[0014] 优选地，步骤Sl中的所述标准工作溶液的制备方法如下：
[00巧](I)GABA标准溶液:称取GABA标准品11 .OOmg,置IOmL容量瓶中，按标准曲线和质 控工作溶液要求，W纯水溶解得GABA 1. IOmg ? m[i标准品储备液，W纯水依次稀释得到系 列工作溶液和质控溶液；
[0016] (2)Glu标准溶液:称取Glu 21.OOmg于IOmL容量瓶内，W纯水溶解，得到2. IOmg ? m[i标准品储备液，依据需要配制相应浓度的Glu质控工作溶液；
[0017] (3)DA和5-HT标准溶液：称取DA ? HCl 11.37mg和5-HT ? HCl 10.37mg标品，置于 IOmL栋色容量瓶，用甲醇溶解定容至刻度;按照标准曲线及质控工作溶液要求，用甲醇梯度 稀释获得DA和5-HT混合标准曲线工作溶液和质控工作溶液；
[0018] (4)苯丙胺类标准溶液:苯丙胺类储备液为商品化的1.OOmg ? mL-i的甲醇溶液，标 准曲线工作溶液和质控工作溶液由母液用甲醇进行梯度稀释获得；
[0019] (5)内标化合物工作溶液：
[0020] ①Glu-d日内标工作溶液:每次称取约2mg Glu-d日，使用约ImL纯水溶解，作为Glu-ds 内标储备液，Glu-ds储备液用0.6N立氯乙酸水溶液稀释成100(K)ng ? ml/i内标工作溶液；
[0021] ②DA-cU和Amp-ds混合内标工作溶液：每次称取约Img DA-Ck-肥1样品，使用约ImL 甲醇溶解，获得DA-d冷量为Img ? mL-i，作为DA-Ck储备液;Amp-d6内标工作溶液为lOOiig/mL 甲醇溶液，混合DA-ck和Amp-ds母液，用乙腊稀释，配制成二者浓度分别为250ng ? mL-哺 200ng ? ml/i的混合内标工作溶液；
[0022] 上述两组内标化合物工作溶液均作为血清蛋白沉淀剂使用。
[0023] 优选地，步骤S4中使用的标准曲线样品配制方法如下：
[0024] (1)使用"空白"血清配制含药浓度如下述的标准曲线血清样本：
[0025] @6484:25、62.5、125、313、625、及1250雌.111[1;
[0026] ② DA、Amp、MA、MDA、MDMA、MDEA:5、10、25、62.5、125、250、及500ng?mL-l;
[0027] @5-册：15、30、75、188、375、750、及1500。邑.111[1;
[002引④Glu采用内标一点法定量，未配制标准曲线血清样本；
[0029] 在上述各含药血清样本中分别加入80化含各内标化合物的乙腊和S氯乙酸溶液， 满旋振荡、离屯、；W各待测物的浓度为横坐标，各待测物的峰面积与内标峰面积比值为纵坐 标，采用加权最小二乘法进行线性回归；
[0030] (2)配制质控血清样品：质控血清样品的处理方法与步骤S2-致，上述各个化合物 的质控样本低浓度和高浓度依次为GABA:71.4、46化g ? mL-i;Glu:10000,65600ng ? mL-i; DA、Amp、MA、MDA、MDMA、MDEA:15、400ng ? mL-i;5-HT:45、1200ng ? mL-1。
[0031] 优选地，所述步骤S3中采用的液相色谱-质谱联用仪为美国Agilent HPllOO四元 低压高效液相色谱系统，包括自动进样器、柱溫箱;美国API4000QQQ型质谱仪，控制软件为 Analyst 1.4版本;所述液相色谱-质谱联用仪检测方法的操作条件如下：
[0032] ①色谱柱：ES Epic Polar Hy化O C18 150mmX4.6mm，5]im，接菲罗口Security Guard Cl8保护柱；
[0033] ②柱溫:室溫；
[0034] ③流动相：甲醇(B相）：0.1%甲酸-水(A相）；
[0035] @流速:0.91111^.111111-1，梯度洗脱，0~6.00111111，8相5%~95%;6.01~6.50111111，8相 95%~95% ;6.51 ~12.OOmin B相5%B;
[0036] ⑤进样量化L分流比48:52，48 %洗脱液进质谱仪；
[0037] ⑥质谱条件：ESI离子源，正离子检测模式；碰撞气：化? h-i;气帘气：2化? h-i; 051:4化-11-1，652:401^*11-1;毛细管电压:5000￥;雾化溫度:500°(：;多级反应监测，各化合 物碰撞能均为：16.0V，解簇电压:55.0V。
[003引优选地，采用多级反应监测方式，监测的待测化合物离子对：GABA( 104.000一 87.000) Xlu( 148.000^84.200) ^DA( 154.200^137.000) ^5-HT( 177.200^160.000) ^Amp (136.000一9