抗心磷脂抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法

抗心磷脂抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗心磷脂抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法，抗心磷脂抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒包括：抗心磷脂抗体IgG单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒和抗人IgG二抗标记的化学发光标记物。这种抗心磷脂抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒能够以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具，完成抗心磷脂抗体IgG的检测这种抗心磷脂抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒，经过实验，其检测灵敏度达到10pg/mL，相对于传统的抗心磷脂抗体IgG的检测方法灵敏度至少提高了10倍，这种抗心磷脂抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒的检测精度较高。
【专利说明】
抗心磷脂抗体I gG化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及体外检测领域，尤其涉及一种抗心磷脂抗体IgG化学发光免疫检测试 剂盒及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 心磷脂是从牛的心肌中分离出来的一种具有抗原性的磷脂，并加以命名，其在哺 乳动物肌中含量最高，每个心磷脂分子包含4个不饱和的脂肪酸，极易氧化。抗心磷脂抗体 (anticardiolipin，ACL)是一种以血小板和内皮细胞膜上带负电荷的心磷脂作为革巴抗原的 自身抗体。见于50%的系统性红斑狼疮患者和约4-50%的其他系统性自身免疫异常患者 (类风湿性关节炎、硬皮病、干燥综合征等）。该抗体与血栓形成、血小板、自然流产或宫内死 胎关系密切。心磷脂抗体可有IgA、IgG或IgM亚型，诊断价值最高的是高浓度IgG抗体，但很 多患者血清中可检出IgA和IgM型心磷脂抗体。此外，有证据表明高浓度的抗心磷脂IgG型抗 体与血小板减少症尚度有关，而尚浓度的抗性憐脂I gM型抗体和溶血性贫血尚度有关。
[0003] 临床检测抗心磷脂抗体IgG的主要方法为酶联免疫吸附法，但该方法存在着下述 的不足之处：
[0004] (1)使用12 X 8型、6 X 8型、8 X 12型或整板型96孔专用微孔板作为抗原包被用具和 反应容器，在使用时只能分成12批次、6批次、8批次或整板一次使用，无法进行独立的、单人 份的检测；
[0005] (2)定量测定所用的试剂种类较多，每一种检测试剂都要用试剂瓶来盛装，并且每 使用一种试剂时都需要更换吸液嘴来分别加注到微孔板的微孔中，不但试剂瓶种类多，加 注试剂的操作也极为繁琐；
[0006] (3)缺少对检测信息的相应标注，只能通过查看试剂盒外包装盒的标识才能了解 或知悉检测试剂的生产批号及有效期信息，而且所知悉的信息在检测过程中不受控，具有 很大的随意性；
[0007] (4)检测试剂在检测过程中处于开放的空间，容易引起各种试剂之间的交叉污染 而影响检测结果的准确性；
[0008] (5)检测过程多采用手工操作，试剂或样本的加量不很精确，操作过程极为繁琐和 复杂，容易发生操作差错，检测结果的准确度和精密度较差；
[0009] (6)在检测项目成套试剂的数量配置及使用上均为项目数X48/96人份，如果需要 检测10个项目，则试剂的配置及使用数须为10X48/96人份，如果只有一份样本需要检测10 个不同的项目，也需要配置10 X 48/96人份的试剂，存在着不够经济合理的缺点。

【发明内容】

[0010] 基于此，有必要提供一种检测灵敏度较高的抗心磷脂抗体IgG化学发光免疫检测 试剂盒及其制备方法。
[0011] -种抗心磷脂抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒，包括:抗心磷脂抗体IgG单克隆 抗体包被的羧基化的磁微粒和抗人IgG二抗标记的化学发光标记物。
[0012] 所述抗心磷脂抗体IgG单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒中，所述抗心磷脂抗体 I gG单克隆抗体与所述羧基化的磁微粒的比例为1:2 5~3 5。
[0013] 所述抗人IgG二抗标记的化学发光标记物中，所述抗心磷脂抗体IgG单克隆抗体与 所述化学发光标记物的比例为50:1~10。
[0014] 所述羧基化的磁微粒的粒径为0.05μηι~Ιμπι。
[0015] 所述化学发光标记物为鲁米诺、异鲁米诺、三联吡啶钌或吖啶酯。
[0016] 所述的抗心磷脂抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒，还包括化学发光底物液，所述 化学发光底物液包括A液和B液。
[0017] 所述A液为H2O2溶液，所述B液为NaOH溶液。
[0018] 所述的抗心磷脂抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒，还包括抗心磷脂抗体IgG定标 品。
[0019] 所述抗心磷脂抗体IgG定标品为浓度分别为0GPLU/mL、10GPLU/mL、20GPLU/mL、 50GPLU/mL、100GPLU/mL 和 200GPLU/mL 的抗心磷脂抗体 IgG 的溶液。
[0020] -种上述的抗心磷脂抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，包括如下步 骤：
[0021] 取羧基化的磁微粒的悬浮液，磁分离去上清后用MES缓冲液重悬，接着加入EDC水 溶液，活化羧基化的磁微粒的表面羧基，接着加入抗心磷脂抗体IgG单克隆抗体，室温下混 悬2h~IOh，磁分离去除上清后用Tr is缓冲液重悬，得到抗心磷脂抗体IgG单克隆抗体包被 的羧基化的磁微粒；以及
[0022] 取抗心磷脂抗体IgG单克隆抗体，加入碳酸盐缓冲液后混匀，然后加入化学发光标 记物后混匀，室温下避光反应Ih~2h后除杂，得到抗人IgG二抗标记的化学发光标记物。
[0023] 这种抗心磷脂抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒能够以全自动化学发光免疫分析 仪为检测工具，完成抗心磷脂抗体IgG的检测这种抗心磷脂抗体IgG化学发光免疫检测试剂 盒，经过实验，其检测灵敏度达到〇.2GPLU/mL，相对于传统的抗心磷脂抗体IgG的检测方法 灵敏度至少提高了 10倍，这种抗心磷脂抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒的检测精度较高。
【附图说明】
[0024] 图1为一实施方式的抗心磷脂抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒的制备方法的流 程图；
[0025]图2为实施例3得到的抗心磷脂抗体IgG标准曲线图。
【具体实施方式】
[0026] 为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实 施例对本发明的【具体实施方式】做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于 充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术 人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施 的限制。
[0027] -实施方式的抗心磷脂抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒，包括:抗心磷脂抗体 IgG单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒和抗人IgG二抗标记的化学发光标记物。
[0028] 优选的，抗心磷脂抗体IgG单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒中，抗心磷脂抗体 IgG单克隆抗体与羧基化的磁微粒的比例为1:25~35。
[0029] 优选的，抗人IgG二抗标记的化学发光标记物中，抗心磷脂抗体IgG单克隆抗体与 化学发光标记物的比例为50:1~10。
[0030]优选的，羧基化的磁微粒的粒径为0·05μηι~Ιμπι。
[0031] 化学发光标记物可以为鲁米诺、异鲁米诺、三联吡啶钌或吖啶酯。其中，化学发光 标记物优选为吖啶酯。
[0032] 在其他的实施例中，上述抗心磷脂抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒还包括化学 发光底物液。
[0033] 化学发光底物液包括A液和B液。A液可以为H2O2溶液，B液可以为NaOH溶液。
[0034] 本实施例中，A液为浓度为0. lmol/L的H2O2溶液，B液为浓度为0.25mol/L的NaOH溶 液。
[0035] 在其他的实施例中，上述抗心磷脂抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒还包括抗心 磷脂抗体IgG定标品。
[0036] 抗心磷脂抗体IgG定标品为浓度分别为0GPLU/mL、10GPLU/mL、20GPLU/mL、50GPLU/ mL、100GPLU/mL和200GPLU/mL的抗心磷脂抗体IgG的溶液。
[0037] 具体的，抗心磷脂抗体IgG定标品可以采用标准品缓冲液将抗心磷脂抗体IgG配制 成浓度分别为 OGPLU/mL、I OGPLU/mL、20GPLU/mL、50GPLU/mL、I OOGPLU/mL 和 200GPLU/mL 的抗 心磷脂抗体IgG的溶液。
[0038]这种抗心磷脂抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒用于抗心磷脂抗体IgG检测时，利 用全自动化学发光免疫分析仪对抗心磷脂抗体IgG定标品进行检测，绘制标准曲线，内置于 电脑软件;接着测试实际样本，根据样本发光值计算样本浓度;最后对抗心磷脂抗体IgG全 自动化学发光免疫分析系统进行性能(灵敏度、线性、精密度、干扰性)的评价。
[0039] 这种抗心磷脂抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒能够以全自动化学发光免疫分析 仪为检测工具，完成抗心磷脂抗体IgG的检测这种抗心磷脂抗体IgG化学发光免疫检测试剂 盒，经过实验，其检测灵敏度达到〇.2GPLU/mL，相对于传统的抗心磷脂抗体IgG的检测方法 灵敏度至少提高了 10倍，这种抗心磷脂抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒的检测精度较高。
[0040] 此外，这种抗心磷脂抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒还具有以下优点：
[0041] 1、选择吖啶酯作为标记材料，并应用于化学发光免疫分析系统，该发光体系为直 接化学发光，与传统的酶促化学发光相比，该反应不需要酶的参与，更加节约成本；
[0042] 2、选用吖啶酯的化学发光免疫分析系统线性范围宽，能达到2GPLU/mL~120GPLU/ mL，而传统的抗心磷脂抗体IgG的检测方法的检线性范围为lOGPLU/mL~60GPLU/mL;
[0043] 3、吖啶酯化学发光免疫分析系统重复性高，批内及批间差均在5%以内，这是其它 化学发光免疫分析系统难以达到的；
[0044] 4、化学发光免疫分析系统已实现样本的定量，通过内置标准曲线到测试软件，只 需测试样本就可直接得到样本的浓度值；
[0045] 5、化学发光免疫分析系统可以实现全自动化，试剂及样本的添加全有仪器完成， 操作更加简便，减少了人为的误差。
[0046]如图1所示的上述抗心磷脂抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，包括如 下步骤：
[0047]取羧基化的磁微粒的悬浮液，磁分离去上清后用MES缓冲液重悬，接着加入EDC水 溶液，活化羧基化的磁微粒的表面羧基，接着加入抗心磷脂抗体IgG单克隆抗体，室温下混 悬2h~IOh，磁分离去除上清后用Tr is缓冲液重悬，得到抗心磷脂抗体IgG单克隆抗体包被 的羧基化的磁微粒。
[0048] MES(2-(N-吗啡啉）乙磺酸)缓冲液的浓度为0.02M，pH为5.5。
[0049] Tris缓冲液的浓度为0.1M并且含有2%BSA，pH为8.0。
[0050] EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺)水溶液的浓度为10mg/mL~20mg/ mL，EDC与羧基化的磁微粒的比例为0.05:0.1~1。
[0051 ]优选的，抗心磷脂抗体IgG单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒中，抗心磷脂抗体 IgG单克隆抗体与羧基化的磁微粒的比例为1:25~35。
[0052]优选的，羧基化的磁微粒的粒径为0·05μηι~ΙμL?。
[0053]取抗心磷脂抗体IgG单克隆抗体，加入碳酸盐缓冲液后混匀，然后加入化学发光标 记物后混匀，室温下避光反应Ih~2h后除杂，得到抗人IgG二抗标记的化学发光标记物。 [0054]的顺序可以颠倒。
[0055] 碳酸盐缓冲液浓度为0 · IM，pH为9 · 0~9 · 5，
[0056]除杂的操作为离心脱盐柱脱盐，具体操作为:先分别用纯净水及TBS缓冲液(40mM Tris-HCl，0.5%BSA，l%NaCl，pH 8.0)处理离心脱盐柱，最后加入得到的抗心磷脂抗体IgG 单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒的溶液，最后收集离心管中的液体。
[0057]优选的，抗人IgG二抗标记的化学发光标记物中，抗心磷脂抗体IgG单克隆抗体与 化学发光标记物的比例为50:1~10。
[0058] 化学发光标记物可以为鲁米诺、异鲁米诺、三联吡啶钌或吖啶酯。其中，化学发光 标记物优选为吖啶酯。
[0059] 得到的抗心磷脂抗体IgG单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒和抗人IgG二抗标记 的化学发光标记物组合即可得到上述抗心磷脂抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒。
[0060] 这种抗心磷脂抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒在使用时，还需要化学发光底物 液和抗心磷脂抗体IgG定标品。
[0061] 化学发光底物液和抗心磷脂抗体IgG定标品可以自行配制得到。
[0062] 化学发光底物液包括A液和B液。A液可以为H2O2溶液，B液可以为NaOH溶液。
[0063] 本实施例中，A液为浓度为0. lmol/L的H2O2溶液，B液为浓度为0.25mol/L的NaOH溶 液。
[0064] 具体的，抗心磷脂抗体IgG定标品可以采用标准品缓冲液将抗心磷脂抗体IgG配制 成浓度分别为 OGPLU/mL、I OGPLU/mL、20GPLU/mL、50GPLU/mL、I OOGPLU/mL 和 200GPLU/mL 的抗 心磷脂抗体IgG的溶液。
[0065] 这种抗心磷脂抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒的制备方法简单方便，制得的抗 心磷脂抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒的检测灵敏度较高，具有良好的应用前景。
[0066]以下为具体实施例。
[0067]实施例1:抗心磷脂抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒的制备
[0068] (I)抗心磷脂抗体IgG单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒的制备：
[0069] 取含有50mg粒径为0·05μπι~Ιμπι的羧基化的磁微粒(MagnaBind?，货号21353)悬浮 液，磁分离去上清，用0 · 02M，pH为5 · 5MES缓冲液重悬，加入ImL新配置的10mg/mL的EDC水溶 液，活化磁珠表面羧基，加入4mg抗心磷脂抗体IgG单克隆抗体(biorbyt，货号orb48780)，室 温下混悬6h，磁分离，去除上清，用含2%BSA的0.1M，pH为8.0的Tris缓冲液重悬到lmg/mL， 得到抗心磷脂抗体IgG单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒，每瓶5mL分装保存于4°C备用。
[0070] (2)抗人IgG二抗标记的吖啶酯的制备：
[0071] 取50μΙ^度为25mg/mL的抗心磷脂抗体IgG单克隆抗体，加入150yL浓度为0.1M、pH 为9.0~9.5的碳酸盐缓冲液，混匀，然后加入1.5yL浓度为5mg/mL的吖啶酯溶液混匀，室温 下避光反应，1.5h后取出，用2mL的zeba离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先分别用纯净 水及TBS缓冲液进行处理，最后加入得到的抗人IgG二抗标记的吖啶酯溶液，收集离心管中 的液体至保存管得到抗人IgG二抗标记的吖啶酯，每瓶5mL分装保存于4°C备用。
[0072 ] (3)抗心磷脂抗体I gG定标品的制备：
[0073] 用标准品缓冲液（40mM Tris-HCl，0.5%BSA，l%NaCl，pH 8.0)将抗心磷脂抗体 IgG 配置成浓度为 0GPLU/mL、10GPLU/mL、20GPLU/mL、50GPLU/mL、100GPLU/mL 和 200GPLU/mL， 每瓶0.5mL分装冻干，4 °C保存备用。
[0074]实施例2:抗心磷脂抗体IgG化学发光免疫检测方法
[0075]以全自动化学发光免疫分析仪(YHL0,货号iFlash3000)为检测工具，方法学模式 为双抗体夹心法，即仪器依次加入50yL的样品、50yL的抗心磷脂抗体IgG单克隆抗体包被的 羧基化的磁微粒以及50yL的抗心磷脂抗体IgG处理液，反应20min后，再加50yL的抗心磷脂 抗体IgG包被的吖啶酯，反应20min后，进行磁分离，仪器将反应混合物送入暗室，依次加入 发光底物A液(H 2O2)及B液(NaOH)进行发光反应，最后记录发光值。
[0076] 实施例3:抗心磷脂抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒性能评价
[0077] 采用实施例2中的方法对抗心磷脂抗体IgG定标品进行检测，得到绘制标准曲线如 图2所示。
[0078] 接着对接着测试实际样本，根据样本发光值计算样本浓度。
[0079]灵敏度的检测：
[0080]参照CLSI EP17-A文件推荐实验方案，计算抗心磷脂抗体IgG化学发光免疫检测试 剂盒的灵敏度，求得的灵敏度为〇. 2GPLU/mL。
[0081 ]线性的检测：
[0082] 对浓度为 2GPLU/mL、10GPLU/mL、20GPLU/mL、50GPLU/mL、120GPLU/mL 标准品做线性 分析，计算线性相关系数，r = 0.9996，另外，该试剂盒对抗心磷脂抗体IgG样品检测的线性 范围为2GPLU/ml ~120GPLU/mL。
[0083] 精密度测定：
[0084] 取浓度为lOGPLU/mL及lOOGPLU/mL两个抗心磷脂抗体IgG样品，每个样本每个浓度 各做3个平行，用三批试剂盒进行检测，计算试剂盒批内及批间差，结果表明该试剂盒批内 及批间差均小于5%。
[0085] 干扰性实验：
[0086]取混合血清分别添加干扰物包括:结合胆红素、游离胆红素、血红蛋白、抗坏血酸、 甘油酯，添加比例按照1:20进行，分别测定混合血清及添加了各种干扰物后混合血清的测 值，计算二者之间的偏差，以±10%为可接受范围。结果表明，干扰性均达到NCCLS的文件标 准，可用于临床实验室抗心磷脂抗体IgG状况的准确评估。
[0087]实施例4、抗心磷脂抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒的对比实验
[0088]分别用化学发光检测方法和传统的酶联免疫吸附法对浓度为0 . IGPLU/mL及 lOGPLU/mL的抗心磷脂抗体IgG样品做检测，两种方法检测灵敏度相比，数据如下表所示：
[0091] 由上表可以看出，化学发光检测方法的灵敏度较酶联免疫吸附法提高了约20倍。
[0092] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保 护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种抗心磷脂抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，包括:抗心磷脂抗体 IgG单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒和抗人IgG二抗标记的化学发光标记物。2. 根据权利要求1所述的抗心磷脂抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所 述抗心磷脂抗体IgG单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒中，所述抗心磷脂抗体IgG单克隆抗 体与所述羧基化的磁微粒的比例为1:25~35。3. 根据权利要求1所述的抗心磷脂抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所 述抗人IgG二抗标记的化学发光标记物中，所述抗心磷脂抗体IgG单克隆抗体与所述化学发 光标记物的比例为50:1~IO。4. 根据权利要求1所述的抗心磷脂抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所 述羧基化的磁微粒的粒径为〇. 〇5μηι~Ιμπι。5. 根据权利要求1所述的抗心磷脂抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所 述化学发光标记物为鲁米诺、异鲁米诺、三联吡啶钌或吖啶酯。6. 根据权利要求1所述的抗心磷脂抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，还 包括化学发光底物液，所述化学发光底物液包括A液和B液。7. 根据权利要求6所述的抗心磷脂抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所 述A液为H2O2溶液，所述B液为NaOH溶液。8. 根据权利要求1所述的抗心磷脂抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，还 包括抗心磷脂抗体IgG定标品。9. 根据权利要求8所述的抗心磷脂抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所 述抗心磷脂抗体IgG定标品为浓度分别为0GPLU/mL、10GPLU/mL、20GPLU/mL、50GPLU/mL、 lOOGPLU/mL和200GPLU/mL的抗心磷脂抗体IgG的溶液。10. -种根据权利要求1~9中任一项所述的抗心磷脂抗体IgG化学发光免疫检测试剂 盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 取羧基化的磁微粒的悬浮液，磁分离去上清后用MES缓冲液重悬，接着加入EDC水溶液， 活化羧基化的磁微粒的表面羧基，接着加入抗心磷脂抗体IgG单克隆抗体，室温下混悬2h~ l〇h，磁分离去除上清后用Tris缓冲液重悬，得到抗心磷脂抗体IgG单克隆抗体包被的羧基 化的磁微粒；以及 取抗心磷脂抗体IgG单克隆抗体，加入碳酸盐缓冲液后混匀，然后加入化学发光标记物 后混匀，室温下避光反应Ih~2h后除杂，得到抗人IgG二抗标记的化学发光标记物。
【文档编号】G01N33/577GK105891194SQ201610516757
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年6月30日
【发明人】李江, 邹定标, 夏福臻, 钱纯亘, 代洪飞
【申请人】深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司