使用磁珠的微流体免疫试验的方法和系统的制作方法

使用磁珠的微流体免疫试验的方法和系统的制作方法
【专利摘要】一种微流体Western印迹方法和系统，包括用于蛋白质的免疫试验的微流体Western印迹方法，该方法包括将包含蛋白质的样品引入至芯片上；电泳分离蛋白质；将分离的蛋白质结合至珠以形成蛋白质附连的珠，该珠有磁性；使蛋白质附连的珠流入磁性保持区；向磁性保持区施加磁场以使蛋白质附连的珠在磁性保持区内固定就位；将一抗结合至与蛋白质附连的珠上的目标蛋白质；将二抗结合至结合的一抗；并且检测结合的二抗。
【专利说明】
使用磁珠的微流体免疫试验的方法和系统
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2014年1月15日提交的美国临时专利申请号61/927,960的权益，其通 过引用全文纳入本文。
技术领域
[0003] 本发明的技术领域是试验系统，具体地，使用磁珠的微流体免疫试验的方法和系 统。
[0004] 发明背景
[0005] 已经针对多种分析化学和生物化学操作提议微流体技术的应用。该技术允许在易 于自动化的高通量低体积系统中进行从简单到相对复杂的化学和生物化学反应、大分子分 离等。关于微流体装置和系统的其他信息描述于2003年3月18日授权Kennedy的美国专利号 6,534,013,并且通过引用全文纳入。
[0006] 当用于描述流体元件，如通道、腔室或管道时，本文所用术语"微流体"或术语"微 尺度"一般是指一种或多种流体通道、腔室或管道，其具有约0.1WI1至500μπι的至少一个内部 截面尺寸，例如深度或宽度。在本发明的装置中，微孔通道优选具有约0.1WI1至200μπι，更优 选约0.1皿至100皿，并且通常约0.1皿至20皿的至少一个截面尺寸。
[0007] 通常，微流体系统包括微流体装置或忍片，其具有集成的亚微米通道的网络，物质 在其中被运输、混合、分离并检测。微流体系统通常也含有向忍片提供流体驱动力并检测忍 片发出的信号的组件。
[000引可从多种不同材料，包括玻璃或聚合材料制造微流体忍片。市售的微流体忍片的 示例是由马萨诸塞州霍普金顿的卡尺生命科学公司（Caliper Life Sciences,Inc.)制造 的D N A LabChjp I'，其与由加利福尼亚帕罗奥图安捷伦科技有限公司（A g i 1 e η t Technologies，Inc.)制造的Agilent 2lOOBioanalyzer系统联用。该忍片有2个主要组件： 玻璃制成的工作部分，和与该工作部分结合的塑料盒(caddy)或安装件(mount)。工作部分 在其内部含有微流体通道，并且在其外部含有向微流体通道提供入口的孔。一般通过将2个 或更多个平面基片层结合在一起来制造工作部分。当一个平面基片包封在另一个平面基片 上形成的凹槽时在工作部分中形成微流体通道。安装件保护忍片的工作部分，并且让使用 者更易于操作该忍片。增加的操作容易性部分由W下事实导致:安装件比装置的工作部分 大，其在许多情况中太小且太薄W无法容易地操作。可从任意合适的聚合材料，如丙締酸类 或热塑性材料制造安装件。一般使用紫外固化粘合剂来将玻璃工作部分结合至聚合物安装 件。安装件中的储器向忍片的工作部分上的孔提供了入口。储器容纳比工作部分中的孔大 得多的材料体积，由此在使用者的宏观环境和微流体装置的孔和通道的微环境之间提供接 P。
[0009]运种微流体忍片类型是"平面"忍片。在平面忍片中，该忍片中微通道的唯一入口 是通过盒中的储器并且进而通过工作部分中的孔。另一个微流体忍片类型是"吸管"忍片， 其具有从忍片延伸的小管或毛细管Γ吸管"），忍片外储存的流体通过其被导入忍片中的微 流体通道。典型的吸管忍片具有1至12个吸管。使用中，将吸管置于具有样品材料的容器中， 并且微量的样品材料通过毛细管引入或"吸入"忍片的微流体通道中。可重复该吸入过程W 将任意数量的不同样品材料引入忍片中。吸管使得更易于在单个微流体忍片上对多种样品 进行高通量分析。
[0010] 已经开发了 Western印迹电泳试验来检测样品中的特定蛋白质。可将该过程分成3 个部分:蛋白质分离、样品转移和免疫试验。在蛋白质分离中，将机械和/或化学技术应用于 样品，如组织样品，W暴露蛋白质。然后用凝胶电泳分离蛋白质，其中不同蛋白质在差分电 压下通过凝胶的移动速度由单个蛋白质的分子量所控制。在样品转移中，分离的蛋白质在 称为电印迹的过程中从凝胶内移动到膜上，其使用电流来移动蛋白质。在免疫试验中，一抗 附连至膜上的目标蛋白质，二抗附连至一抗，并且发光体与二抗反应W在各目标蛋白质处 产生光。光的检测提供了对目标蛋白质的鉴定和定量。
[0011] 虽然现有Western印迹电泳方法提供了有价值的结果，但该现有方法存在多个问 题。现有方法是耗费劳动的过程，其手动进行并且需要凝胶平板和特定膜纸来转移分离的 蛋白质。该过程的手动性质增加了成本并且限制了可测试的样品数量。典型的Western分析 需要8-24小时的监视操作，几乎一半需要亲自手动操作。
[0012] 需要克服上述缺陷的使用磁珠的微流体免疫试验的方法和系统。

【发明内容】

[0013] 本发明的一个方面提供了用于蛋白质免疫试验的微流体Western印迹方法，该方 法包括将包含蛋白质的样品引入至忍片上；电泳分离蛋白质；将分离的蛋白质结合至珠 W 形成蛋白质附连的珠，该珠有磁性;使蛋白质附连的珠流入磁性保持区；向磁性保持区施加 磁场W使蛋白质附连的珠在磁性保持区内固定就位;将一抗结合至蛋白质附连的珠上的目 标蛋白质;将二抗结合至结合的一抗;并且检测结合的二抗。
[0014] 本发明的另一个方面提供了用于蛋白质免疫试验的微流体Western印迹方法，该 方法包括提供具有限定样品孔、与样品孔可操作接合(couple)的分离区，和与分离区可操 作接合的磁性保持区的基材的微流体忍片；向样品孔中引入包含蛋白质的样品；使样品流 入分离区；施加跨越分离区的电压W电泳分离分离区中的蛋白质;将电泳分离的蛋白质结 合至珠 W形成蛋白质附连的珠，该珠是有磁性的;使蛋白质附连的珠流入磁性保持区；向磁 性保持区施加磁场W使蛋白质附连的珠在磁性保持区内固定就位;将一抗结合至蛋白质附 连的珠上的目标蛋白质;将二抗结合至结合的一抗;并且检测结合的二抗。
[0015] 本发明的另一个方面提供了使用珠的蛋白质免疫试验的微流体Western印迹系 统，该系统包括具有限定样品孔、与样品孔可操作接合的分离区，和与分离区可操作接合的 磁性保持区的基材的微流体忍片；W及可操作连接W向磁性保持区提供磁场的电磁体，可 操作该磁场W使珠在磁性保持区内固定就位。
[0016] 本发明的另一个方面提供了用于分析物免疫试验的微流体方法，该方法包括基于 一种或多种分析物的尺寸和电荷在第一流体区中解析置于第一流体区内的样品中的运一 种或多种分析物;将解析的分析物结合至磁珠 W形成分析物附连的珠;施加磁场W使分析 物附连的珠的至少一部分固定就位;将检测剂结合至分析物附连的珠;并且检测所述检测 剂。
[0017]结合附图，通过W下关于优选实施方式的描述，可W清楚地了解本发明的上述和 其它的特征和优点。详细说明和附图仅仅是示例性而非限制性的，本发明的范围由所附权 利要求书及其等同项所限定。
[001引附图的简要说明
[0019] 图1是按照本发明制成的具有多个样品孔、分开的脱色孔和珠孔，W及检测剂孔的 微流体Western印迹装置的一个实施方式的俯视图。
[0020] 图2是按照本发明制成的具有合并的脱色和珠孔的微流体Western印迹装置的一 个实施方式的俯视图。
[0021] 图3是按照本发明制成的具有多个样品孔W及合并的脱色和珠孔的微流体 Western印迹装置的一个实施方式的俯视图。
[0022] 图4是按照本发明制成的具有多个样品孔W及分开的脱色和珠孔的微流体 Western印迹装置的一个实施方式的俯视图。
[0023] 图5是按照本发明制成的具有多个样品孔、合并的脱色和珠孔，W及检测剂孔的微 流体Western印迹装置的一个实施方式的俯视图。
[0024] 图6是按照本发明制成的具有样品吸管的微流体Western印迹装置的一个实施方 式的俯视图。
[0025] 图7是按照本发明制成的具有抗体吸管的微流体Western印迹装置的一个实施方 式的俯视图。
[00%]图8是本发明的微流体Western印迹方法的流程图。
[0027]相似的元件在各图之间有相似的附图标记。
[002引发明详述
[0029] 图1是按照本发明制成的具有多个样品孔、分开的脱色孔和珠孔，W及检测剂孔的 微流体Western印迹装置的一个实施方式的俯视图。
[0030] 微流体忍片100具有限定用于进行免疫试验的Western印迹方法的多个孔和通道 的基材102。在该实施方式中，基材102限定样品孔110、与样品孔110可操作接合的分离区 120,和与分离区120可操作接合的磁性保持区130。
[0031] 样品孔110可通过样品通道111连接至分离区120。样品孔110也可通过穿过样品通 道111的注射通道117可操作地连接至注射电极116。操作中，包括蛋白质的样品可通过在样 品孔110和注射电极116之间施加差分电压通过样品通道111从样品孔110流入注射通道 117。注射通道117可操作地连接至第一分离电极通道119。样品可通过在注射电极116和可 操作地连接至第一分离电极通道119的第一分离电极118之间施加差分电压从注射通道117 流至第一分离电极通道119。在一个实施方式中，用于使蛋白质在忍片周围移动的差分电压 可W是高差分电压，运与可用于使免疫试验化学物移动通过磁性保持区的低差分电压相 反。
[0032] 在该示例中，微流体忍片100包括多个样品孔110、112、114。可依次处理来自样品 孔的样品，即，可首先处理来自样品孔110的样品，之后是来自样品孔112和样品孔114的样 品。本领域技术人员将理解微流体忍片100可根据特定应用的需要包括任意数量的样品孔。
[0033] 第一分离电极通道119可操作地连接至分离区120。用凝胶和染料探测分离区120， 从而可在分离区120中的样品上进行电泳。分离区120也可通过磁性保持区130和第二分离 电极通道141连接至第二分离电极140。
[0034] 可通过在第一分离电极118和第二分离电极140之间施加差分电压在样品上进行 电泳。由于低分子量蛋白质会比高分子量蛋白质更快地移动通过下游末端121和上游末端 123之间的分离区120的凝胶，电泳将样品中的蛋白质会分成一个或多个蛋白质峰。也可利 用第一分离电极118和第二分离电极140之间的差分电压来将样品从分离区120移至磁性保 持区130。
[0035] 脱色孔150可通过脱色通道151可操作地连接至分离区120的下游末端123, W向离 开分离区120的分离的样品添加脱色溶液。脱色溶液去除洗涂剂(SDS)胶束，从而允许观察 样品中的蛋白质峰并降低信号背景。可通过在与脱色孔150相关的电极和第二分离电极140 之间施加差分电压来使脱色溶液流入样品。
[0036] 可在分离区120和磁性保持区130之间提供峰检测区170。监测峰检测区170的峰光 学检测器(未显示）可检测移动通过峰检测区170的样品中的蛋白质峰，其可用于检测最后 的蛋白质峰何时进入磁性保持区130。
[0037] 珠孔160可通过珠通道161可操作地连接至峰检测区170的下游末端W向离开峰检 测区170的分离的样品添加珠。珠表面经官能化W附连至样品中的任意和全部蛋白质W形 成蛋白质附连的珠。此外，珠有磁性并且可在磁性保持区130内通过磁性方式被操作。在一 个实施方式中，珠可W是一抗附连的珠，即，在制造时并且在将珠引入至忍片上之前带有附 连至珠的一抗的珠。示例性的珠购自德国己斯韦勒的巧金埃尔默chemagen技术公司 (Perki址Imer chemagen Technologie GmbH)。在一个实施方式中，珠可W是纳米珠。可通 过在与珠孔160相关的电极和第二分离电极140之间施加差分电压来使珠流入样品。
[0038] 免疫试验通道181可附连珠通道161的下游并且在磁性保持区130之前W允许添加 免疫化学物。在该示例中，免疫试验通道181可操作地连接至封闭缓冲剂孔180、一抗孔190、 二抗孔200,和检测剂孔210。当使用第一分离电极118和第二分离电极140之间的差分电压 来将样品移入磁性保持区130时，可在加入免疫试验化学物之前关闭差分电压。
[0039] 在操作中，当最后的蛋白质峰进入磁性保持区130时，可关闭第一分离电极118和 第二分离电极140之间的差分电压，并且可使可操作地连接至磁性保持区130的电磁体(未 显示)通电，W使蛋白质附连的珠在磁性保持区130内固定就位。在一个示例中，通过环状电 磁体来产生磁场，所述环状电磁体将蛋白质附连的珠维持分散贯穿磁性保持区130内的毛 细管部分。
[0040] 各自来自封闭缓冲剂孔180、一抗孔190、二抗孔200，和检测剂孔210的免疫试验化 学物可通过在与各孔相关的电极和第二分离电极140之间施加差分电压来流过磁性保持区 130,进而接触蛋白质附连的珠。在按照具体应用的需要施加各免疫试验化学物之间可通过 在与脱色孔150相关的电极和第二分离电极140之间施加差分电压来洗涂磁性保持区130。 在免疫试验化学物之一已经流入磁性保持区130之后，可通过去除在与各孔相关的电极和 第二分离电极140之间的差分电压允许各免疫试验化学物在磁性保持区130内解育W提供 具体应用所需的解育时间和/或溫度。
[0041] 可通过在与封闭缓冲剂孔180相关的电极和第二分离电极140之间施加差分电压 来使封闭缓冲剂流入磁性保持区130。在蛋白质结合至珠之后使用封闭缓冲剂W使珠的所 有剩余蛋白质结合位点饱和并且防止非特异性免疫试验试剂结合至珠。本领域技术人员将 理解可按照具体应用的需要在不使用封闭缓冲剂的情况下进行免疫试验。可通过在与脱色 孔150相关的电极和第二分离电极140之间施加差分电压来从磁性保持区130中洗去任意未 结合的封闭缓冲剂。
[0042] 可通过在与一抗孔190相关的电极和第二分离电极140之间施加差分电压来使一 抗流入磁性保持区130。一抗与蛋白质附连的珠上的目标蛋白质结合。可通过在与脱色孔 150相关的电极和第二分离电极140之间施加差分电压来从磁性保持区130中洗去任意未结 合的一抗。在一个示例中，微流体忍片100包括可操作地连接至磁性保持区130的加热元件 (未显示）W在具体应用所需的溫度下在蛋白质附连的珠上解育一抗。
[0043] 可通过在与二抗孔200相关的电极和第二分离电极140之间施加差分电压来使二 抗流入磁性保持区130。二抗与结合至蛋白质附连的珠的一抗结合。可通过在与脱色孔150 相关的电极和第二分离电极140之间施加差分电压来从磁性保持区130中洗去任意未结合 的二抗。
[0044] 可通过在与检测剂孔10相关的电极和第二分离电极140之间施加差分电压来使检 测剂流入磁性保持区130。检测剂与结合至一抗的二抗发生反应，一抗结合至目标蛋白质。 在一个示例中，二抗包括偶联的酶(例如，辣根过氧化物酶HRP)并且检测剂是与偶联的酶发 生反应并生成光的酶底物(例如，辣根过氧化物酶酪酷胺信号放大HRP/TSA)。
[0045] 可使用免疫试验光学检测器(未显示)来检测来自二抗的光。在一个实施方式中， 当蛋白质附连的珠在磁性保持区130内固定就位时，可操作地连接免疫试验光学检测器来 接收来自磁性保持区130的光。可在测量光之后释放磁性保持区130中的磁场并且可从微流 体忍片100中去除样品。在另一个实施方式中，因为蛋白质附连的珠流过已被释放的磁性保 持区130中的磁场中的免疫试验光学检测器，并且在第一分离电极118和第二分离电极140 之间已经施加差分电压，免疫试验光学检测器经可操作地连接W接收来自蛋白质附连的珠 的光。
[0046] 废料孔可与第二分离电极140相关，使得可通过在第一分离电极118和第二分离电 极140之间施加差分电压来从微流体忍片100中去除样品。在一个实施方式中，另一样品，如 来自第二样品孔112的样品，可在从忍片中去除第一样品之后被测试。在另一个实施方式 中，另一样品，如来自第二样品孔112的样品，可在从忍片中去除第一样品的同时移入分离 区 120。
[0047] 本领域技术人员将理解微流体忍片100可适应具体应用的需要。在一个实施方式 中，分离区120、峰检测区170,和/或磁性保持区130中的一个或多个是通道。在另一个实施 方式中，分离区120、峰检测区170,和/或磁性保持区130中的一个或多个是腔室。使样品移 动通过微流体忍片100的驱动力可W是沿着通道的差分电压和/或差分压力。微流体忍片 100可适应用于进行其他类型的免疫试验。
[0048] 也可根据具体应用的需要选择免疫试验化学物。在一个实施方式中，一抗与单一 目标蛋白质结合并且免疫试验光学检测器接收单一波长的光W鉴定并定量单一目标蛋白 质。在另一个实施方式中，可在单个忍片上进行多重化，其中一抗是与不同目标蛋白质结合 并且与不同二抗结合的抗体的混合物。不同二抗可生成不同波长的光，使得在免疫试验光 学检测器上接收来自磁性保持区的光时可同时鉴定并定量超过一种目标蛋白质。
[0049] 图2-7显示不同微流体Western印迹装置的元件的各种组合。本领域技术人员将理 解可根据具体应用的需要提供不同组合的各种元件。
[0050] 图2是按照本发明制成的具有合并的脱色和珠孔的微流体Western印迹装置的一 个实施方式的俯视图。在该实施方式中，微流体忍片300具有基材302,其形成通过脱色/珠 通道351可操作地连接至分离区120的下游末端123的脱色/珠孔350, W向离开分离区120的 分离的样品中添加脱色溶液和珠的混合物。可使用脱色溶液和珠的混合物从磁性保持区中 洗涂免疫试验化学物(封闭缓冲剂、一抗、二抗）。该实施方式包括单个样品孔110而不是多 个样品孔并且省略了与免疫试验通道181连接的检测剂孔。
[0051] 图3是按照本发明制成的具有多个样品孔W及合并的脱色和珠孔的微流体 Western印迹装置的一个实施方式的俯视图。在该实施方式中，微流体忍片400具有基材 402,其形成通过脱色/珠通道351可操作地连接至分离区120的下游末端123的脱色/珠孔 350 W向离开分离区120的分离的样品中添加脱色溶液和珠的混合物。该实施方式包括多个 样品孔110、112、114并且省略了与免疫试验通道181连接的检测剂孔。
[0052] 图4是按照本发明制成的具有多个样品孔W及分开的脱色和珠孔的微流体 Western印迹装置的一个实施方式的俯视图。在该实施方式中，微流体忍片500具有基材 502，其形成多个样品孔110、112、114。该实施方式包括分开的脱色孔150和珠孔160，W使峰 检测区170中的珠和用于洗涂免疫试验化学物(封闭缓冲剂、一抗、二抗)的脱色溶液中的珠 避开磁性保持区。该实施方式也省略了与免疫试验通道181连接的检测剂孔。
[0053] 图5是按照本发明制成的具有多个样品孔、合并的脱色和珠孔、W及检测剂孔的微 流体Western印迹装置的一个实施方式的俯视图。在该实施方式中，微流体忍片600具有基 材602,其形成多个样品孔110、112、114。该实施方式包括通过脱色/珠通道351可操作地连 接至分离区120的下游末端123的脱色/珠孔350, W向离开分离区120的分离的样品中添加 脱色溶液和珠的混合物。该实施方式也包括与免疫试验通道181可操作地连接的检测剂孔 10。
[0054] 图6是按照本发明制成的具有样品吸管的微流体Western印迹装置的一个实施方 式的俯视图。在该实施方式中，微流体忍片700具有基材702,其形成通过低压端口通道711 可操作地连接至样品通道111的低压端口 710和通过吸管端口通道721可操作地连接至样品 通道111的吸管端口720。在操作中，低压端口710保持在比吸管端口720低的压力下，其已经 引入孔板(未显示)如96孔板等的样品孔。孔板中含有的样品通过吸管端口 720抽入样品通 道111。在该示例中，来自孔板的多个样品可通过微流体忍片700利用来自封闭缓冲剂孔 180、一抗孔190,和二抗孔200的相同免疫试验化学物处理。
[0055] 图7是按照本发明制成的具有抗体吸管的微流体Western印迹装置的一个实施方 式的俯视图。在该实施方式中，微流体忍片800具有基材802,其形成通过低压端口通道811 可操作地连接至免疫试验通道181的低压端口 810和通过吸管端口通道821可操作地连接至 免疫试验通道181的吸管端口820。在操作中，低压端口810保持在比吸管端口820低的压力 下，其已经引入孔板(未显示)如96孔板等的抗体孔。孔板中含有的抗体通过吸管端口 820抽 入免疫试验通道181。在该示例中，来自孔板的多种抗体可通过微流体忍片800利用来自样 品孔110的相同样品处理。
[0056] 图8是本发明的微流体Western印迹方法的流程图。用于蛋白质的免疫试验的微流 体Western印迹方法900包括将包含蛋白质的样品引入至忍片上910;电泳分离蛋白质920; 将分离的蛋白质结合至珠 W形成蛋白质附连的珠930,该珠有磁性;使蛋白质附连的珠流入 磁性保持区940;向该磁性保持区施加磁场W使蛋白质附连的珠在磁性保持区内固定就位 950;将一抗结合至蛋白质附连的珠上的目标蛋白质960;将二抗结合至结合的一抗970;并 且检测结合的二抗980。可使用如图1-7所示具有限定样品孔、与样品孔可操作地接合的分 离区，和与分离区可操作地接合的磁性保持区的基材的微流体忍片来进行方法900。
[0化7] 参考图8,将包含蛋白质的样品910引入至忍片上将样品移入位置W进行Western 印迹方法。在一个实施方式中，可通过在忍片上的电极之间施加差分电压来加载样品。在另 一个实施方式中，可通过在忍片上的端口之间施加差分压力来加载样品。本领域技术人员 将理解可W具体应用所需的任意方式加载样品。在一个实施方式中，方法900可包括在引入 910之前用凝胶和染料预置(priming)忍片。
[0058] 由于较低分子量的蛋白质比较高分子量的蛋白质更快地移动通过忍片上分离区 的凝胶，电泳分离蛋白质920可包括施加差分电压W将样品中的蛋白质分成一个或多个蛋 白质峰。
[0059] 将分离的蛋白质结合至珠 W形成蛋白质附连的珠930基本将样品中所有分离的蛋 白质附连至珠。该珠有磁性，使得可通过磁场来移动蛋白质附连的珠。在一个实施方式中， 将分离的蛋白质结合至珠930可包括在将分离的蛋白质结合至珠之前使蛋白质脱色。电泳 分离蛋白质920然后还可包括检测脱色的蛋白质中的迁移峰。使蛋白质附连的珠流入磁性 保持区940然后还包括使蛋白质附连的珠流入磁性保持区直至检测到迁移峰中的至少一 个，此时所有的蛋白质附连的珠将在磁性保持区中。
[0060] 使蛋白质附连的珠流入磁性保持区940将蛋白质附连的珠置于磁性保持区中的位 置上，用于免疫试验。在一个实施方式中，可通过在忍片上的电极之间施加差分电压来使蛋 白质附连的珠流动。在另一个实施方式中，可通过在忍片上的端口之间施加差分压力来使 蛋白质附连的珠流动。本领域技术人员将理解可使蛋白质附连的珠 W具体应用所需的任何 方式流入磁性保持区。
[0061] 向磁性保持区施加磁场950W使蛋白质附连的珠在磁性保持区内固定就位使蛋白 质附连的珠在免疫试验期间保持就位。在一个示例中，来自电磁体的磁场可将蛋白质附连 的珠保持在磁性保持区的基部。磁场也可保持磁性保持区内样品的蛋白质峰的相对位置。
[0062] 将一抗结合至蛋白质附连的珠上的目标蛋白质960对用于检测的目标蛋白质加标 记，而不对不感兴趣的其余蛋白质加标记。在一个实施方式中，将一抗结合至目标蛋白质 960可包括解育蛋白质附连的珠上的一抗并且从磁性保持区洗去未结合的一抗。在另一个 实施方式中，方法900可包括在结合一抗之前，使封闭缓冲剂在蛋白质附连的珠上流过磁性 保持区。方法900然后还可包括解育蛋白质附连的珠上的封闭缓冲剂并且从磁性保持区洗 去未结合的封闭缓冲剂。
[0063] 将二抗结合至结合的一抗970用二抗对结合的一抗加标记，该二抗用于鉴定附连 至目标蛋白质的结合的一抗。在一个实施方式中，将二抗结合至结合的一抗970可包括从磁 性保持区洗去未结合的二抗。
[0064] 检测结合的二抗980可提供对样品中目标蛋白质的指示，运是由于结合的二抗附 连至结合的一抗，结合的一抗附连至目标蛋白质。在一个实施方式中，方法900包括在检测 980之前使检测剂在蛋白质附连的珠上流过磁性保持区，并且，检测结合的二抗980包括检 测从检测剂与结合的二抗的反应发出的光。
[0065] 可用磁性保持区中的样品或在样品从磁性保持区流出时进行对结合的二抗的检 测980。在一个实施方式中，检测980可包括检测具有向磁性保持区施加的磁场的磁性保持 区中结合的二抗。在另一个实施方式中，方法900可包括释放磁性保持区中的磁场W释放蛋 白质附连的珠。检测980然后可包括检测流动通过固定检测器的结合的二抗。
[0066] 方法900可通过排空磁性保持区和/或引入用于分析的新样品来持续。在一个实施 方式中，方法900可包括释放磁性保持区中的磁场W释放蛋白质附连的珠。方法900还可包 括将第二样品引入至忍片上并且根据需要在第二样品上进行Western印迹分析。在一个实 施方式中，可在从忍片上去除第一样品之后测试第二样品。在另一个实施方式中，可在从忍 片上去除第一样品的同时电泳分离第二样品。可在顺序样品之间提供忍片的洗涂W根据具 体应用所需防止交叉污染。
[0067] 重要的是，应注意图1-8显示本发明的具体应用和实施方式，并且不旨在显示本发 明或本文所述的权利要求的范围。在阅读说明书并且看过其附图之后，各种本发明的其他 实施方式对本领域技术人员而言将变得显而易见，并且运些实施方式被考虑并且落在本发 明的范围内。上述实施例主要设及使用纳米珠的在忍片上的蛋白质Western印迹免疫试验， 但是本领域技术人员将理解使用磁珠的微流体免疫试验的方法和系统可同等应用于使用 磁珠的忍片上任意分析物的免疫试验。
[0068] 虽然本文所述的本发明实施方式目前认为是优选的，但可进行各种变化和修改而 不背离本发明的精神和范围。本发明的范围由所附权利要求书限定，在等同形式的含义和 范围内的所有变化包括在本发明范围内。
【主权项】
1. 一种用于蛋白质免疫试验的微流体Western印迹方法，所述方法包括： 将包含所述蛋白质的样品引入至芯片上； 电泳分离所述蛋白质； 将所述分离的蛋白质结合至珠，以形成蛋白质附连的珠，所述珠有磁性； 使所述蛋白质附连的珠流入磁性保持区； 向所述磁性保持区施加磁场，以使所述蛋白质附连的珠在所述磁性保持区内固定就 位； 将一抗结合至所述蛋白质附连的珠上的目标蛋白质； 将二抗结合至结合的一抗;并且 检测结合的二抗。2. 如权利要求1所述的方法，还包括在引入之前用凝胶和染料预置所述芯片。3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将分离的蛋白质结合至珠还包括在将所 述分离的蛋白质结合至珠之前使所述蛋白质脱色。4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述电泳分离还包括检测脱色的蛋白质中的 迀移峰。5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述流动还包括使所述蛋白质附连的珠流入 所述磁性保持区直至检测到所述迀移峰中的最后一个。6. 如权利要求1所述的方法，还包括在结合一抗之前，使封闭缓冲剂在所述蛋白质附连 的珠上流过所述磁性保持区。7. 如权利要求6所述的方法，还包括孵育所述蛋白质附连的珠上的封闭缓冲剂，和，从 所述磁性保持区洗去未结合的封闭缓冲剂。8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，结合一抗还包括孵育所述蛋白质附连的珠上 的一抗，和，从所述磁性保持区洗去未结合的一抗。9. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，结合二抗还包括从所述磁性保持区洗去未结 合的二抗。10. 如权利要求1所述的方法，还包括在所述检测之前使检测剂在所述蛋白质附连的珠 上流过所述磁性保持区，所述检测还包括检测从所述检测剂与所述结合的二抗的反应发出 的光。11. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测包括检测具有向所述磁性保持区 施加的磁场的所述磁性保持区中结合的二抗。12. 如权利要求1所述的方法，还包括释放所述磁性保持区中的磁场，以释放所述蛋白 质附连的珠。13. 如权利要求12所述的方法，还包括使所述蛋白质附连的珠流出所述磁性保持区。14. 如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述检测包括检测流动通过固定检测器的 结合的二抗。15. 如权利要求12所述的方法，还包括将第二样品引入至芯片上。16. -种用于蛋白质免疫试验的微流体Western印迹方法，所述方法包括： 提供微流体芯片，所述微流体芯片具有限定样品孔、与所述样品孔可操作接合的分离 区，和与所述分离区可操作接合的磁性保持区的基材； 将包含所述蛋白质的样品引入所述样品孔； 使所述样品流入所述分离区； 施加贯穿分离区的电压，以电泳分离所述分离区中的蛋白质； 将所述电泳分离的蛋白质结合至珠，以形成蛋白质附连的珠，所述珠有磁性； 使所述蛋白质附连的珠流入所述磁性保持区； 向所述磁性保持区施加磁场，以使所述蛋白质附连的珠在所述磁性保持区内固定就 位； 将一抗结合至所述蛋白质附连的珠上的目标蛋白质； 将二抗结合至结合的一抗;并且 检测结合的二抗。17. -种用珠进行蛋白质免疫试验的微流体Western印迹系统，所述系统包括： 具有基材的微流体芯片，所述基材限定： 样品孔； 可操作接合至所述样品孔的分离区；和 可操作接合至所述分离区的磁性保持区；和 经可操作连接以向所述磁性保持区提供磁场的电磁体，可操作所述磁场以使所述珠在 所述磁性保持区内固定就位。18. 如权利要求17所述的系统，还包括可操作连接至所述磁性保持区以控制所述磁性 保持区内的孵育温度的加热元件。19. 如权利要求17所述的系统，其特征在于，所述基材还限定所述分离区和所述磁性保 持区之间的峰检测区，并且所述系统还包括可操作来检测所述峰检测区中的蛋白质峰的峰 光学检测器。20. 如权利要求17所述的系统，还包括可操作连接以接收来自所述磁性保持区的光的 免疫试验光学检测器。21. -种用于分析物的免疫试验的微流体方法，所述方法包括： 基于一种或多种分析物的尺寸和电荷，在第一流体区中解析置于所述第一流体区内的 样品中的所述一种或多种分析物； 将解析的分析物结合至磁珠以形成分析物附连的珠； 施加磁场以使所述分析物附连的磁珠的至少一部分固定就位； 将检测剂结合至所述分析物附连的珠;并且 检测所述检测剂。22. 如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述一种或多种分析物包含蛋白质。23. 如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述解析包括电泳分离所述蛋白质。24. 如权利要求21所述的方法，还包括将包含所述一种或多种分析物的样品引入所述 第一流体区。25. 如权利要求21所述的方法，其特征在于，施加所述磁场还包括使所述分析物附连的 珠流入第二流体区。26. 如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述第二流体区包括磁性保持区。27. 如权利要求21所述的方法，其特征在于： 结合所述检测剂还包括将一抗结合至所述分析物附连的珠;并且将二抗结合至结合的 一抗;并且 检测所述检测剂还包括检测结合的二抗。28. 如权利要求27所述的方法，还包括使所述分析物附连的珠流至第二流体区。29. 如权利要求21所述的方法，其特征在于： 所述珠包括一抗附连的珠;并且 结合所述检测剂还包括将二抗结合至一抗附连的珠。
【文档编号】G01N33/53GK105992948SQ201580004767
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年1月15日
【发明人】A·巴里, L·普罗文彻, S·科恩, I-J·陈, J·严, J·王
【申请人】卡钳生命科学股份有限公司