一种对荧光物质进行成像的超分辨显微镜的制作方法
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及显微成像领域，特别涉及一种在医用生物领域对荧光物质进行成像的超分辨显微镜。
【背景技术】
[0002]细胞作为生命活动的基本单元，是深入研宄生命过程的关键。了解各种大分子在活细胞中构象改变和精确定位，揭示生物分子相互作用关系，对于研宄疾病机理、促进生物医药科学和相关产业的发展具有重大意义。而实现这些的关键在于细胞的观察及检测。
[0003]目前，激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscopy)是细胞原位观察的重要工具，然而，受到光学衍射限制，激光扫描共聚焦显微镜的成像分辨率在200?300nm，随着观察和原位检测的深入，需要对尺寸在20?200nm的病毒、单链或双链DNA实现观察和检测，在这些情况下，共聚焦显微镜就无法分辨。为了突破光学衍射极限，近年来涌现出了不少超分辨光学显微成像方法，如光激活定位法(Photoactivat1nLocalizat1n Microscopy，PALM)、随机光学重构法(Stochastic Optical Reconstruct1nMicroscopy，STORM)、结构光照明法(Structured Illuminat1n Microscopy, SIM)以及受激发射损耗法(Stimulated Emiss1n Deplet1n，STED)等。相比其他的方法，STED方法是一种更为直观的方法，它以传统共聚焦显微光学技术为基础，通过把被激发的荧光物质限制在小于衍射极限的范围内，从而实现超高分辨率，其成像方式无需复杂的后期图像处理，因此STED技术被认为是下一代显微光学发展的核心技术，是光学最前沿理论与技术实践的结合。
[0004]STED显微成像系统有多种实现方法，但大部分STED系统十分复杂，这些STED系统多采用两组激光光源，且该类系统通过增加反射镜的数量来增加光行进的距离，这带来两方面的问题，一是系统裝校过程十分复杂，每个反射镜在每次使用时都必须精确调校，耗时费力，即使是对从事STED显微镜系统开发的科研人员来说也是一项十分具有挑战性的工作；二是系统的可靠性非常低，用户在使用时经常遇到系统需要重新校准，这在很大程度上限制了 STED超分辨显微镜的推广应用。
【实用新型内容】
[0005]为减小STED系统的复杂性，本实用新型采用超连续谱脉冲光源同时作为激发光光源和损耗光光源，此外，为使得激发光和损耗光在时间上保持严格的同步关系，本实用新型在损耗光路中采用双光楔对光程进行补偿，使得激发光和损耗光先后进入物镜，两路光在时间上保持几皮秒的延时，以获得对荧光最佳的损耗效果。同时，采用脉冲光作为激发光和损耗光也减小了光照对荧光物质的漂白。
[0006]为了实现上述目的，本实用新型采用以下技术方案:
[0007]—种对焚光物质进行成像的超分辨显微镜，它包括:第一光路，其中的光线的波长选择为适于激发该待成像的荧光物质产生处于激发态的荧光粒子的波长；
[0008]第二光路，其中设置有相位板，以使所述第二光路的照射面形成为环形光斑，且所述第二光路中光线的波长选择为不能激发该待成像的荧光物质产生处于激发态的荧光粒子的波长；
[0009]双光楔光程补偿装置，其设置在所述第二光路中，所述双光楔光程补偿装置由折射率大于空气折射率的透光材料制成，且所述光程调节器包括两个含斜边的光楔，两个光楔的斜边彼此可滑动移动地贴合，所述第二光路中的光线穿过两个光楔的贴合部分。
[0010]优选的是，所述的对荧光物质进行成像的超分辨显微镜，包括:
[0011]光源，其为超连续谱脉冲激光源，用于发射波长范围较宽的脉冲光；
[0012]第一二色镜，其用于将所述波长范围较宽的脉冲光分解为长波长和短波长两路光，其中短波长光波行进的光路为激发光光路，长波长光波行进的光路为损耗光光路；
[0013]第一滤光片，其位于所述激发光光路上，且只允许一个特定波长的激光透射，该透射出的特定波长的激光为激发光；
[0014]第二滤光片，其位于所述损耗光光路上，且只允许一个特定波长的激光透射，该透射出的特定波长的激光为损耗光；
[0015]所述激发光和损耗光均垂直照射于荧光物质上的同一位置；
[0016]相位板，其位于所述损耗光的光路上，具有O?2 的涡旋相位分布，用于将所述损耗光的照射面由实心的光斑转变为中间无光周圈有光的圆环空心光斑；
[0017]双光楔光程补偿装置，其位于所述损耗光的光路上，由折射率大于空气折射率的透光材料组成，当损耗光穿过所述双光楔光程补偿装置时，损耗光的传播速度小于它在空气中的传播速度，从而使得所述激发光和损耗光产生一个时间差先后到达荧光物质，且激发光先于损耗光到达荧光物质，所述双光楔光程补偿装置通过自由调节损耗光在双光楔光程补偿装置中的传播距离，来控制所述时间差的大小；
[0018]荧光探测系统，其用于检测荧光及其强度；
[0019]分析控制系统，其与所述荧光探测系统电连接，用于记录和分析荧光强度，并最终实现显微成像；
[0020]其中，通过调节所述双光楔光程补偿装置来改变时间差的大小，以使得所述激发光先照射荧光物质，待荧光物质中的荧光粒子从基态跃迀至激发态之后，且在该处于激发态的荧光粒子发出荧光之前，损耗光刚好照射到荧光物质，使荧光物质受激辐射，以迫使已经处于激发态的荧光粒子跃迀至其他能级，从而通过后续光学器件以滤除损耗区域的荧光信号。
[0021]优选的是，所述的对荧光物质进行成像的超分辨显微镜，所述光楔呈直角梯形或直角三角形。
[0022]优选的是，所述的对荧光物质进行成像的超分辨显微镜，还包括:
[0023]三维纳米位移台，其与所述分析控制系统电连接，用于承载荧光物质，并在X、Y、Z方向自由地进行以纳米为单位的移动；
[0024]物镜，其位于荧光物质上方，用于聚焦激发光和损耗光，并收集由荧光物质发出的荧光；
[0025]第三滤光片，其位于荧光光路上，用于滤除干扰光，透射荧光；
[0026]透镜，其位于所述第三滤光片和荧光探测系统之间，用于聚焦荧光；
[0027]针孔，其位于所述透镜和荧光探测系统之间，用于滤除干扰光。
[0028]优选的是，所述的对荧光物质进行成像的超分辨显微镜，还包括:
[0029]反射镜，其位于所述第二滤光片和相位板之间，用于反射损耗光；
[0030]第二二色镜，其位于所述第三滤光片和物镜之间，用于反射所述激发光和透射荧光;
[0031]第三二色镜，其位于所述第二二色镜和物镜之间，用于反射所述损耗光，透射激发光和荧光。
[0032]优选的是，所述的对荧光物质进行成像的超分辨显微镜，所述激发光从所述光源出发，依次经过第一二色镜、第一滤光片、第二二色镜、第三二色镜和物镜，最终到达荧光物质。
[0033]优选的是，所述的对荧光物质进行成像的超分辨显微镜，所述损耗光从所述光源出发，依次经过第一二色镜、第二滤光片、反射镜、相位板、双光楔光程补偿装置、第三二色镜和物镜，最终到达荧光物质。
[0034]优选的是，所述的对荧光物质进行成像的超分辨显微镜，所述荧光物质发出的荧光依次经过物镜、第三二色镜、第二二色镜、第三滤光片、透镜和针孔，最终到达荧光探测系统。
[0035]本