检测蛋白质乙酰化水平的蛋白芯片及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本实用新型公开一种检测蛋白质乙酰化水平的蛋白芯片及试剂盒，可以检测蛋白质翻译后乙酰化水平，所述蛋白芯片包括基片和阵列式分布于基片上的捕获抗体，所述基片为包被有琼脂糖膜三维材料的玻璃基片，该基片的蛋白固定效率高，且性能稳定，所述捕获抗体包括至少68种特异性抗体。所述试剂盒包含蛋白芯片，还包括抗乙酰化信号检测试剂及蛋白收集和标记试剂。使用本实用新型的蛋白芯片及试剂盒，蛋白固定效率高，且性能稳定，并可以同时检测样品中多个蛋白质翻译后乙酰化修饰水平。
【专利说明】
检测蛋白质乙酰化水平的蛋白芯片及试剂盒
技术领域
[0001]本实用新型涉及蛋白芯片及试剂盒，特别是涉及一种能够检测蛋白质翻译后乙酰化修饰水平的蛋白芯片以及包含该蛋白芯片的试剂盒。
【背景技术】
[0002]随着在上世纪60年代Phi 11 ips、Al If rey等科学家对组蛋白乙酰化的首次发现，在过去的50年中，人类对蛋白质乙酰化的了解有了长足的进步。蛋白质乙酰化修饰分为两种，一种为蛋白翻译时N端的乙酰化修饰，对蛋白的合成、定位以及稳定性都有影响。另一种为蛋白翻译后在赖氨酸残基ε-氨基上的乙酰化修饰，在乙酰基转移酶(HAT)催化下，乙酰辅酶A的乙酰基团被转移到目的蛋白的赖氨酸，这一过程同时也受到组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的可逆调节。乙酰化是蛋白质翻译后修饰的重要组成部分，组蛋白乙酰化可以促使染色体打开超螺旋结构，促进基因转录。通过蛋白质组学的研究发现，除了组蛋白外，在细胞质和线粒体中均存在大量的蛋白质乙酰化，参与到了 RNA剪切、细胞周期、DNA复制、转录、细胞核转运等多种生物过程中。另外大量中间代谢酶都能够被乙酰化修饰，其动态调节过程对控制细胞代谢具有重要作用。乙酰化水平的调节失控能够导致多种疾病，多种转录因子的乙酰化水平(包括P53、STAT3、HIF-la等)都影响着癌症的发生和发展，目前已有多种以HDAC为靶点的临床药物如SAHA(伏立诺他)被用于癌症相关疾病的治疗。因此，如何高效的检测出样本中蛋白质的乙酰化水平在科研、医疗诊断和医药开发领域都有重要意义。
[0003]尽管赖氨酸乙酰化作为一种常见的翻译后修饰具有重要作用，但是由于相对较低的丰度水平，乙酰化水平的检测需要在总蛋白中对乙酰化蛋白进行富集。然而乙酰化抗体对乙酰化蛋白的亲和性较低，不能满足直接对乙酰化蛋白进行富集，而是需要将蛋白消化成肽段后，再使用抗体富集乙酰化肽段，经过质谱分析的手段来检测。众所周知的是，质谱分析需要对样本进行片段化处理，这个预处理过程非常复杂，需要耗费大量的时间和人力，成本高昂，同时质谱分析对样本的需求量也较高，而临床上的少量样本也限制了质谱技术的运用。
[0004]蛋白芯片是一种高通量的蛋白功能分析技术，是近年发展起来的一项生物检测技术。利用这项技术，通过将大量抗体或抗原密集地点制在固相载体上，具有可同时检测多种蛋白质且样本需求量小的特点，对于高通量基因表达的研究具有非常重要的意义。但是，目前尚没有关于用于检测蛋白质翻译后乙酰化修饰水平的蛋白芯片及试剂盒等相关技术的公开。
[0005]本案发明人依据在蛋白芯片领域的多年研究经验，开发出了一种蛋白芯片，能够用于检测蛋白质翻译后乙酰化修饰水平，同时还公开了该蛋白芯片的制备方法、应用、试剂盒及检测方法等相关技术，发明人开发的上述技术填补了用于检测蛋白质翻译后乙酰化修饰水平的蛋白芯片领域的技术空白。
【实用新型内容】
[0006]本实用新型所要解决的技术问题之一在于，提供一种蛋白芯片，能够同时检测样品中多种蛋白质翻译后乙酰化修饰水平，且蛋白固定效率高，检测灵敏度高。
[0007]本实用新型所要解决的技术问题之二在于，提供一种试剂盒，包含所述蛋白芯片，能够方便快捷的检测多种蛋白质翻译后乙酰化修饰水平。
[0008]为解决上述技术问题之一，本发明提供的蛋白芯片，包括基片和分布于基片上的捕获抗体，所述基片为包被有琼脂糖膜三维材料的玻璃基片，所述基片上固定有呈阵列式分布的所述捕获抗体，所述捕获抗体包括但不限于以下68种特异性抗体:AML1，AMPK，APE，AR，α-Tubulin，β-Catenin，Bcl_6，Becl in，BRAF，MYB，c-Myc，CREB，CTBP2，DEK，E2F1，E2F2，E2F3，EGFR，Her2，Her4，ER，EKLF，FENl，F0X01，F0X03，F0X04，GATAl，GATA2，GATA3，GATA4，GR,HIF-la,HMGAl,HMGBl,HSP90,IRF2,IRSl,KRAS,Ku70,MDM2,MEF2A,NEIL2,NFKB1Notchl,P21，P53，P65,PGCl,PTEN,RBI,KPNA2，RUNX2，SMAD2，SMAD4，SMAD7，S0X4，S0X9，SREBPl，SRY，STATl，STAT2，STAT3，TDG，VEGF，WRN，β-Actin，GAPDH，BSA。
[0009]所述捕获抗体为以下68种特异性抗体:AML1 ,AMPK’APE’AR’a-TubulinJ-Catenin ，Be1-6，Becl in，BRAFjMYB，c-Myc，CREB，CTBP2，DEK，E2F1，E2F2，E2F3，EGFR，Her2，Her4，ER，EKLF,FENl,FOXOI，F0X03，F0X04，GATAI，GATA2，GATA3，GATA4，GR，HIF-1a，HMGAI，HMGBl，HSP90，IRF2,IRSl,KRAS,Ku70,MDM2,MEF2A,NEIL2,NFkB,Notchl，P21，P53，P65,PGCl，PTEN，RBl，KPNA2，RUNX2，SMAD2，SMAD4，SMAD7，S0X4，S0X9，SREBPl，SRY，STATl，STAT2，STAT3，TDG，VEGF，WRN，β-Actin，GAPDH，BSA。
[0010]所述蛋白芯片，还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为生物素标记的BSA(BSA-生物素)和乙酰化BSA(Ac-BSA)，所述阴性对照为BSA(牛血清白蛋白)、mouSe IgG和rabbit normal IgG0
[0011]所述阳性对照、阴性对照和每一种捕获抗体在基片上均点制至少3个重复点。
[0012]上述基片为包被有琼脂糖膜三维材料的玻璃基片，这种三维材料具有多孔结构，可以结合更多的蛋白，蛋白固定效率高，且性能稳定，可提高芯片的检测灵敏度，可检测蛋白的浓度达到pg/ml级别。同时，使用这种三维材料的芯片在采用后续的光学检测时不会对芯片检测结果产生干扰及影响。
[0013]上述68种特异性抗体是经过精心挑选的。为实现高效率的同时检测多种蛋白质的乙酰化水平，发明人对大量的可能发生蛋白质乙酰化的抗体进行了深入研究，筛选出了上述68种可发生明显乙酰化修饰、反应特异性好、检测信号明显且信号与抗原浓度呈较好的线性关系的特异性抗体，本发明公开的68种特异性抗体可以很好的用于蛋白质乙酰化修饰水平的检测，其检测结果可以从整体上反应检测样品的蛋白质乙酰化修饰水平。同时依托上述68种特异性抗体，可以针对不同实验的需要，增加并点制潜在的能够发生蛋白质乙酰化或需要检验蛋白质乙酰化修饰水平是否发生变化的其他不同的抗体，能够满足个性化定制的要求。
[0014]为解决上述技术问题之二，本实用新型提供的试剂盒，包括前述的蛋白芯片。
[0015]具体的，所述试剂盒还包括乙酰化信号检测试剂、蛋白质收集标记试剂和超滤管，所述乙酰化信号检测试剂用以检测蛋白质样本中的乙酰化信号和蛋白质本地信号，所述蛋白收集标记试剂用以对组织或细胞进行裂解，并对裂解蛋白进行生物素标记。
[0016]进一步的，所述乙酰化信号检测试剂包括蛋白杂交缓冲液、乙酰化赖氨酸抗体、HRP标记的检测二抗、生物素标记的酪胺、信号扩增缓冲液、30%H202、焚光偶联链霉亲和素。
[0017]进一步的，所述蛋白收集标记试剂包括蛋白裂解液、NHS-生物素、生物素标记缓冲液、标记终止缓冲液O
[0018]本实用新型的蛋白芯片及试剂盒用于检测蛋白质乙酰化水平检测方法如下:
[0019]1、样品的准备
[0020]①检测样品:取细胞或组织样本，加入蛋白裂解液，充分反应后离心，收集上清液并进行定量，即得到检测样品(用于检测乙酰化信号)；
[0021 ]②本底样品:取部分检测样品，加入蛋白标记缓冲液混匀，加入NHS-生物素进行标记，再加入标记终止缓冲液终止标记，然后加入IxPBS (磷酸缓冲盐溶液)，放入超滤管，经离心后取超滤液保存，即得到本底样品(用于检测蛋白本底信号)。
[0022]2、蛋白芯片杂交
[0023]①先将蛋白芯片用BSA封闭，然后取用等量的检测样品和本底样品，在蛋白芯片的两个反应室中分别加入所取用的检测样品和本底样品，将其与蛋白芯片进行杂交孵育，清洗；
[0024]②检测组:在反应室中继续加入抗乙酰化赖氨酸抗体，孵育，清洗，加入HRP标记的检测二抗，孵育，清洗，加入信号扩增缓冲液和生物素标记的酪胺反应，最后再加入荧光偶联链霉亲和素，放置，清洗，甩干；
[0025]③本底组:在反应室中加入荧光偶联链霉亲和素，放置，清洗，甩干。
[0026]3、数据采集分析
[0027]使用芯片扫描仪读取检测组和本底组的荧光信号，用GenepixPro 6.0软件对获得的荧光信号进行分析，采集每个捕获抗体点上的荧光信号中位值并以此计算出重复点的平均值和CV值。反应室中加入未标记的蛋白样品及抗乙酰化赖氨酸抗体的，其扫描得到的信号即为乙酰化信号，而反应室中加入生物素标记的蛋白样品的，其扫描得到的信号即为蛋白本底信号。样品蛋白的乙酰化水平用乙酰化信号/本底信号的比值来表示，该比值越大则说明样品蛋白的乙酰化水平越高。
[0028]样本间乙酰化水平的差异根据乙酰化信号/本底信号的比值来加以分析。
[0029]本实用新型首次提供了一种能够同时检测样品中多个蛋白质乙酰化修饰水平的蛋白芯片及试剂盒，相较于现有技术中采用质谱分析检测蛋白质乙酰化水平的方法，本发明无需对蛋白质进行复杂的酶切纯化等预处理过程，可以解决目前检测蛋白质乙酰化修饰费时费力的问题，而且可同时检测样品中的多种蛋白质，检测更加全面，检测效率高，且样品需求量小，对于高通量基因表达的研究具有非常重要的意义，同时依托此平台，可以针对不同实验的需要点制不同的抗体，能够满足个性化定制的要求。
【附图说明】
[0030]图1为本实用新型的蛋白芯片一实施例的结构示意图。
[0031]图2为本实用新型的蛋白芯片及试剂盒的操作流程图。
[0032]图3为本实用新型的蛋白芯片及试剂盒检测TSA诱导细胞的乙酰化变化的部分检测结果。
[0033]图4为本实用新型的蛋白芯片及试剂盒检测P300过表达细胞的乙酰化变化的部分检测结果。
【具体实施方式】
[0034]下面将结合实验数据及附图对本实用新型的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本实用新型的一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本实用新型中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本实用新型保护的范围。
[0035]实施例一
[0036]本实用新型提供的一种检测蛋白质乙酰化水平的蛋白芯片，包括基片和分布于基片上的捕获抗体，所述基片为包被有琼脂糖膜三维材料的玻璃基片，所述基片上固定有呈阵列式分布的所述捕获抗体，所述捕获抗体包括但不限于以下68种特异性抗体:AML1，AMPK，APE，AR，α-Tubulin，β-Catenin，Be1-6，BecI in，BRAF，MYB，c-Myc，CREB，CTBP2，DEK，E2F1，E2F2，E2F3，EGFR，Her2，Her4，ER，EKLF，FENl，F0X01，F0X03，F0X04，GATAl，GATA2，GATA3,GATA4，GR,HIF-1a,HMGAl,HMGBl，HSP90，IRF2,IRSl,KRAS，Ku70，MDM2，MEF2A，NEIL2,NFkB，Notchl，P21，P53，P65,PGCl,PTEN,RBl,KPNA2，RUNX2，SMAD2，SMAD4，SMAD7，S0X4，S0X9，SREBPl，SRY，STATl，STAT2，STAT3，TDG，VEGF，WRN，β-Actin，GAPDH，BSA。
[0037]本实施例的蛋白芯片的基片为包被有琼脂糖膜三维材料的玻璃基片，蛋白芯片的检测效能依赖于蛋白质与载体平面的稳定性，传统的芯片载体上蛋白质固定效率低，且不稳定，这限制了蛋白芯片的应用。琼脂糖膜三维材料具有三维的多孔结构，这种三维结构与蛋白质的结合能力强且结合稳定，蛋白固定效率高，包被有琼脂糖膜三维材料的玻璃基片的蛋白芯片，可以结合更多的单边，提高了芯片的检测灵敏度，可检测蛋白的浓度低至Pg/ml级别。而且，这种化学单位材料对蛋白芯片在后续的光学检测时不会对芯片检测结果产生干扰和影响。
[0038]本实施例的蛋白芯片为长方体结构，该蛋白芯片上设置有多个反应室，每个反应室中设有多个点样孔(或点样点)，点样孔呈矩阵式分布，每个点样孔均点制上述68种特异性抗体中的一种，每种特异性抗体依次点制于三个连续的点样孔中，如图1所示，该基片上设置有I X4共4个反应室，每个反应室中设置有20列X 12行呈矩阵分布的点样孔，其中第一行从左至右一次分别点制阳性对照Al、A2及01至18号特异性抗体AMLl，AMPK，APE，AR，a-Tubulin，β-Catenin，Be1-6，Becl in，BRAF，MYB，c-Myc，CREB，CTBP2，DEK，E2F1，E2F2，E2F3，EGFR，第二行及第三行重复第一行的点样方式，这样每个特异性抗体重复点样3次。依次类推，采用同样的点样方式依次将19至38号特异性抗体Her2，Her4，ER，EKLF ,FENl,F0X01，F0X03，F0X04，GATAl，GATA2，GATA3，GATA4，GR，HIF-Ια，HMGAl，HMGBl，HSP90，IRF2，IRSl，KRAS点制于第4至6行，依次将39至58号特异性抗体Ku70，MDM2，MEF2A ,NEIL2 ,NFkB ,Notchl，P21，P53，P65，PGCl，PTEN,RBI,KPNA2，RUNX2，SMAD2，SMAD4，SMAD7，S0X4，S0X9，SREBPl点制于第7至9行，依次将59至68号特异性抗体SRY，STATl，STAT2，STAT3，TDG，VEGF，WRN，β-Act in ,GAPDH，BSA点制于第10至12行的前10列。
[0039 ] 于本实施例的优选实施方式中，第1至12行的第19和20列可以用于点制阳性对照生物素标记的BSA(BSA-生物素)和乙酰化BSA(Ac-BSA)，第10行至12行的第16、17、18列可以用于点制阴性对照BSA(牛血清白蛋白)、mouse IgG和rabbit normal IgG0
[0040]于本实施例的更优选实施方式中，第10行至12行的第11至15列还可以作为扩展模块，根据使用者的特殊需要点制其他抗体，能够满足个性化定制的要求。本实施例的基片上的点样孔还可以任意的设置成其他矩阵分布方式。
[0041 ] 实施例二
[0042]蛋白芯片的制备方法如下:
[0043]将68种特异性抗体用PBS-15%甘油稀释至0.5yg/yl，使用芯片点制平台将抗体逐一点制到基片上，基片为包被有琼脂糖膜三维材料的玻璃基片。每个点直径200μπι，点与点间距500μπι;使用生物素标记的BSA(BSA-生物素)、乙酰化BSA(Ac-BSA)作为阳性对照，使用BSA、mouse IgG、rabbit normal IgG作为阴性对照；阳参、阴参和捕获抗体均点制3个重复点，所有点呈矩阵分布，制备成蛋白质芯片。所述68种特异性抗体为:AMLl，AMPK，APE ,AR，α-Tubulin，β-Catenin，Be1-6，Becl in，BRAF，MYB，c-Myc，CREB，CTBP2，DEK，E2F1，E2F2，E2F3，EGFR，Her2，Her4，ER，EKLF，FENl，F0X01，F0X03，F0X04，GATAl，GATA2，GATA3，GATA4，GR，HIF-1α,HMGAl,HMGBl,HSP90，IRF2,IRSl，KRAS，Ku70，MDM2,MEF2A,NEIL2,NFkB，Notchl，P21，P53，P65,PGCl,PTEN,RBl,KPNA2，RUNX2，SMAD2，SMAD4，SMAD7，S0X4，S0X9，SREBPl，SRY，STATl，STAT2，STAT3，TDG，VEGF，WRN，β-Actin，GAPDH，BSA。
[0044]上述68中特异性抗体是经过精心挑选的，可以很好的用于蛋白质乙酰化修饰水平的检测，其检测结果可以从整体上反应检测样品的蛋白质乙酰化修饰水平。另外针对不同的实验目的，依托实施例一的蛋白芯片，点制具有针对性的不同的抗体，并用于检测样品的蛋白质乙酰化水平，能够满足个性化定制的要求。
[0045]实施例三
[0046]本实用新型的蛋白芯片及试剂盒的检测方法(如图2所示):
[0047]1、样品的准备
[0048]①检测样品:取106-5x 16细胞或10-40mg组织样本，加入100-200μ1蛋白裂解液，在4°C下放置30分钟并不时振荡，然后在4°C下1000g离心15分钟，收集上清液并进行定量，即得到检测样品(用于检测乙酰化信号);
[0049]②本底样品:取10yg检测样品，加入蛋白标记缓冲液混匀至50μ1，加入2μ1NHS-生物素在室温下反应2小时进行标记，再加入1.6μ1标记终止缓冲液于室温反应30分钟终止标记，然后加入450μ1 IrfBS，放入超滤管，经4°C 1000g离心30分钟后取超滤液于-20°C保存，即得到空白样品(用于检测蛋白本底信号)。
[0050]2、蛋白芯片杂交
[0051]①先将蛋白芯片用1%BSA室温封闭lh，然后取用等量的检测样品和空白样品，在蛋白芯片的两个反应室中分别加入所取用的检测样品和空白样品，将其与蛋白芯片在37°C进行杂交孵育I.5小时后清洗；
[0052]②检测组:在反应室中继续加入抗乙酰化赖氨酸抗体，37°C孵育I小时，PBST清洗，加入HRP标记的检测二抗，室温孵育I小时，PBST清洗后，加入含有0.0015%H202信号扩增缓冲液和生物素标记的酪胺室温反应10分钟，最后再加入0.lyg/ml荧光偶联链霉亲和素，室温放置30min，清洗，甩干；
[0053]③本底组:在反应室中加入0.lyg/ml荧光偶联链霉亲和素，室温放置30min，清洗，甩干；
[0054]所有清洗过程都使用PBST清洗3次，每次5分钟。两个反应室同时分别进行本底检测和样本检测，保证了样本检测和本底检测在同样条件下进行，提高了试验结果的有效性和可对比性。
[0055]3、数据采集分析
[0056]使用芯片扫描仪读取检测组和空白组的荧光信号，用GenepixPro 6.0软件对获得的荧光信号进行分析，采集每个捕获抗体点上的中位值并以此计算出重复点的平均值和CV值。反应室中加入未标记的蛋白样品及抗乙酰化赖氨酸抗体的，其扫描得到的信号即为乙酰化信号，而反应室中加入生物素标记的蛋白样品的，其扫描得到的信号即为蛋白本底信号。检测样品蛋白的乙酰化水平用乙酰化信号/本底信号的比值来表示，该比值越大则说明样品蛋白的乙酰化水平越高，不同样本之间乙酰化水平的差异可以通过比较不同样本的乙酰化信号/本底信号的比值来加以分析。
[0057]实施例四
[0058]TSA( Trichos tat in A)处理细胞模型
[0059]1、实验原理
[0060]TSA (Tricho s tat in A)是一种可逆的 HDAC(histone deacetylase，组蛋白去乙酰化酶)抑制剂，通过抑制蛋白去乙酰基团的过程，提高细胞中的乙酰化水平。用DMSO和TSA分别处理样本，DMSO处理为对照样本，用本发明的蛋白芯片及试剂盒检测经TSA处理后对比经DMSO处理后的细胞中乙酰化水平的变化，以说明本发明的检测效果。
[0061 ] 2、样本制备
[0062]胃癌细胞MKN45在含10%FBS(fetal calf serum，胎牛血清)的RAPI 1640培养基中培养至70%的密度，分别用DMSO和3μΜ TSA处理18小时后收集细胞蛋白。
[0063]3、试验方法
[0064]a、取16经DMSO和TSA处理的ΜΚΝ45细胞，加入ΙΟΟμΙ蛋白裂解液4°C裂解30min，1000g离心15min后收集上清，测定浓度，分别取其中10yg蛋白进行生物素标记，用于检测蛋白本底信号，其余用于检测乙酰化信号；
[0065]b、取出蛋白芯片用I %BSA室温封闭lh，分别取等量的DMSO处理组和TSA处理组的检测样品和本底样品加入到芯片的不同两个反应室中，在37°C进行杂交孵育1.5小时后清洗；
[0066]c、在检测组反应室中，继续加入抗乙酰化赖氨酸抗体，370C孵育I小时，PBST清洗，加入HRP标记的检测二抗，室温孵育I小时，PBST清洗后，加入含有0.0015%H202信号扩增缓冲液和生物素标记的酪胺室温反应10分钟，最后再加入0.lyg/ml荧光偶联链霉亲和素，室温放置30min，清洗，甩干;在本底组反应室中加入0.lyg/ml荧光偶联链霉亲和素，室温放置30min，清洗，用干；
[0067]d、使用芯片扫描仪读取DMSO处理组和TSA处理组样本荧光信号，用Genepix Pro6.0软件对其进行分析，比较DMSO处理和TSA处理组两组样本之间乙酰化信号/本底信号比值的差异。
[0068]4、实验结果
[0069]MKN45细胞经过TSA处理，通过WB可以发现乙酰化水平明显提高(图3中的a)。我们以此TSA诱导的细胞为模型，用本发明来检测对照样本(Control组)和TSA处理样本间的乙酰化差异，通过比对发现GATAl和Histone(组蛋白)蛋白的乙酰化水平有相对明显的上升，分别上调了 1.6倍和3.1倍(图3中的b、c)。实验结果与预期相符，说明本发明的蛋白芯片及试剂盒可以很好的用于检测蛋白质乙酰化修饰水平。
[0070]实施例五
[0071 ] P300过表达细胞模型检测
[0072]1、实验原理
[0073]P300是一种乙酰基转移酶(HAT)，其底物包括几乎所有组蛋白以及大量的非组蛋白，通过过表达P300可以从另一个方面检测细胞乙酰化水平的变化，从而对蛋白芯片加以验证。
[0074]2、样本制备
[0075]胃癌细胞AGS在含10%FBS的RAPI 1640培养基中培养至70 %的密度，使用Lipofectamine2000分别转染GFP(Green Fluorescent Protein，绿色焚光蛋白)和P300质粒，转染48小时后分别收集细胞RNA和蛋白质。RNA经反转录后用以检测细胞过表达P300水平，蛋白用以和本发明杂交检测乙酰化水平。
[0076]3、试验方法
[0077]a、RNA提取、反转录与定量:
[0078]分别取15空白和过表达P300的MKN45细胞，加入Iml Trizol裂解液，RNA提取过程按照Trizol说明书进行操作，反转录与焚光定量按照Takara反转录试剂盒和SYBR焚光定量试剂盒说明书进行操作。
[0079]b、蛋白质收集、芯片杂交检测:
[0080]bl.取15空白和过表达P300的MKN45细胞，加入裂解液4°C裂解30min，1000g离心15min后收集上清，进行生物素标记，用于检测蛋白本底信号，其余用于检测乙酰化信号；
[0081]b2.取出蛋白芯片，分别取等量检测样品和本底样品加入到芯片的反应室中，在37°C进行杂交孵育1.5小时后清洗；
[0082]b3.在检测组反应室中，继续加入抗乙酰化赖氨酸抗体，37°C孵育I小时，PBST清洗，加入HRP标记的检测二抗，室温孵育I小时，PBST清洗后，加入含有0.0015 ^H2O2信号扩增缓冲液和生物素标记的酪胺，室温反应10分钟，最后再加入0.lyg/ml荧光偶联链霉亲和素，室温放置30min，清洗，甩干;在本底组反应室中加入0.lyg/ml荧光偶联链霉亲和素，室温放置30min，清洗，甩干；
[0083]b4.使用芯片扫描仪读取空白细胞和过表达P300细胞样本的荧光信号，用GenepixPro6.0软件对其进行分析，比较空白细胞和过表达P300细胞之间乙酰化信号/本底信号比值的差异。
[0084]4、实验结果
[0085]细胞转染P300质粒48小时后P300mRNA显著上升(图4中的a)，用蛋白芯片检测后，发现与对照样本(Control组)相比，P300过表达细胞模型的包括Histone、GATAl、EKLF、Tubulin(微管蛋白)等多个蛋白都发生了乙酰化水平上调(图4中的b、c)，其中GATAl和Tubulin均上调了1.6倍，Histone和EKLF上调了1.3倍。实验结果与预期相符，说明本发明的蛋白芯片及试剂盒可以很好的用于检测蛋白质乙酰化修饰水平。
[0086]综上所述，上述各实施例及附图仅为本实用新型的部分较佳实施例而已，并不用以限定本实用新型的保护范围，凡在本实用新型的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本实用新型的保护范围内。
【主权项】
1.一种蛋白芯片，其特征在于，包括基片和分布于基片上的捕获抗体，所述基片为包被有琼脂糖膜三维材料的玻璃基片，所述基片上固定有呈阵列式分布的所述捕获抗体，所述捕获抗体包括至少以下68种特异性抗体:AMLl，AMPK，APE，AR，α-Tubul in，β-Catenin，Bcl-6，BecI in，BRAF，MYB，c-Myc，CREB，CTBP2，DEK，E2F1，E2F2，E2F3，EGFR，Her2，Her4，ER，EKLF，FENI，FOXOI，F0X03，F0X04，GATAI，GATA2，GATA3，GATA4，GR，HIF-1a，HMGAI，HMGBI，HSP90，IRF2，IRSl，KRAS，Ku70，MDM2，MEF2A，NEIL2，NFkB，NotchI，P21，P53，P65，PGCl，PTEN,RBI,KPNA2，RUNX2，SMAD2，SMAD4，SMAD7，S0X4，S0X9，SREBPl，SRY，STATl，STAT2，STAT3，TDG，VEGF，WRN，β-Actin，GAPDH，BSA。2.根据权利要求1所述的蛋白芯片，其特征在于，所述捕获抗体为以下68种特异性抗体:AMLl，AMPK，APE，AR，a-Tubulin，β-Catenin，Bcl_6，Becl in，BRAFjMYB，c-Myc，CREB，CTBP2，DEK，E2F1，E2F2，E2F3，EGFR，Her2，Her4，ER，EKLF，FENl，F0X01，F0X03，F0X04，GATAl，GATA2，GATA3，GATA4，GR，HIF-la，HMGAl，HMGBl，HSP90，IRF2，IRSI，KRAS，Ku70，MDM2，MEF2A，NEIL2，NFkB，Notchl，P21，P53，P65,PGCl,PTEN,RBI,KPNA2，RUNX2，SMAD2，SMAD4，SMAD7，S0X4，S0X9，SREBPl，SRY，STATl，STAT2，STAT3，TDG，VEGF，WRN，β-Actin，GAPDH，BSA。3.根据权利要求1或2所述的蛋白芯片，其特征在于，所述蛋白芯片还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为生物素标记的BSA和乙酰化BSA，所述阴性对照为BSA、moUse IgG和rabbit normal IgG04.根据权利要求3所述的蛋白芯片，其特征在于，所述阳性对照、阴性对照和每一种捕获抗体在基片上均点制至少3个重复点。5.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的蛋白芯片。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括乙酰化信号检测试剂、蛋白质收集标记试剂和超滤管，所述乙酰化信号检测试剂用以检测蛋白质样本中的乙酰化信号和蛋白质本地信号，所述蛋白收集标记试剂用以对组织或细胞进行裂解，并对裂解蛋白进行生物素标记。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述乙酰化信号检测试剂包括蛋白杂交缓冲液、乙酰化赖氨酸抗体、HRP标记的检测二抗、生物素标记的酪胺、信号扩增缓冲液、30 % H2O2、荧光偶联链霉亲和素。8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白收集标记试剂包括蛋白裂解液、NHS-生物素、生物素标记缓冲液、标记终止缓冲液。
【文档编号】G01N33/68GK205539001SQ201620101353
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年2月1日
【发明人】戚隽毅, 张春秀, 周佳菁, 肖华胜
【申请人】上海生物芯片有限公司, 上海伯豪生物技术有限公司