专利名称：CD147-5A12MAb复合物晶体结构及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种⑶147-5A12MAb复合物的晶体，还涉及用结晶通过X射线衍射确定的立体结构及其用途，更具体的，涉及利用复合物立体结构确定5A12MAb的抗原表位以及与表位结合相关的CDR区，通过计算机分子模建方法确定其与其它抗体HAbl8MAb、6H8MAb、配体和相互作用分子复合物的三维结构和活性作用位点，以及利用计算机分子模建的方法识别能与CD147胞外区结合的蛋白、肽类物质和化学物质。还涉及鉴别CD147抑制物及其医用价值。
背景技术：
⑶147是一种 广泛表达的细胞跨膜糖蛋白，分子量为50_60Kd，具有广泛的生理学及病理学意义。其最主要的功能是诱导细胞外基质金属蛋白酶(EMMPRIN)的分泌、与cypA相互作用，介导炎症发生、易化病毒及寄生虫(如疟原虫等)入侵宿主细胞等。与胚胎发育、肿瘤侵袭、转移，炎症发生、发展，病毒及寄生虫感染扩增等密切相关。⑶147分子广泛表达于造血及非造血细胞系，如造血细胞、上皮细胞、内皮细胞和淋巴细胞。HAbl8G/CD147是CD147家族新成员，是一种新的肝癌相关膜抗原，为一高度糖基化的跨膜蛋白分子。利用我室制备、纯化的肝癌单抗HAblS筛选人肝癌细胞cDNA文库，克隆出其相应抗原HAbl8G的cDNA片段(长度约1.6kb)。查询GenBank，发现HAbl8G cDNA序列与人CD147分子碱基序列高度同源，进一步分析开放读框，表明两者由相同基因编码。在此基础上，本研究中心又从蛋白水平的不同角度证实了这两种分子的一致性。进一步研究发现，CD147是一个肿瘤细胞表面的基质金属蛋白酶诱导因子，可通过成纤维细胞刺激合成基质金属蛋白酶(Marix Metalloproteinases, MMPs)。在既往的研究中，我们通过荷瘤小鼠模型证明不同剂量的碘[131I]美妥昔单抗注射液有不同的抑瘤效果，中、高组剂量的肿瘤抑制率均和阴性对照组有显著性差异；随后将该单抗标记同位素131I制成碘[mI]美妥昔单抗注射液(LICARTIN)治疗原发性肝癌安全、有效。另一个临床研究表明LICARTIN可作为肝癌肝移植后的抗复发药物。随访I年后，治疗组与对照组相比的肝移植术后患者的肝癌复发率下降、生存率提高。以上研究表明，CD147分子是一个治疗肝癌等肿瘤药物的新靶点。我们用HAblSG/⑶147抗体进行广泛的组织谱鉴定，表明该分子高表达于上皮来源的癌组织出9.47%)，良性瘤不表达，胚胎组织及正常组织低表达(分别为2.67%，
10.62%)。是一个广谱的癌型特异性的肿瘤标志物。人⑶147是由269个氨基酸组成的蛋白质，属于I型跨膜蛋白家族。从克隆的cDNA序列可知CD147分子的mRNA长度大约1.7Kb，在转录起始位点的相关区域未发现TATA或CAAT盒，但发现转录起始位点位于CpG岛中，尤其在-247-+6核苷酸处较多。N端起始码之前有约115个核苷酸为非编码区，编码区编码269个氨基酸，21个氨基酸为信号肽，中间185个氨基酸构成胞外结构域，从206-229共24个氨基酸为跨膜区，C端39个氨基酸为胞内结构域。胞外4个半胱氨酸形成2个二硫键构成IgSF典型的半球型结构域(C41，C87，C126，C185)。此外，胞膜外区还有三个相似的N-糖基化天冬酰氨序列，糖基化作用决定了 CD147分子刺激MMP的活性，纯化的去糖基化CD147分子不能诱导MMP的活性且具有拮抗其天然分子的活性的特点，用Endo-F糖苷酶消化可使CD147分子量减少大约30KD，表明CD147分子的糖基化主要以N-连接的寡聚糖方式存在。跨膜区的24个氨基酸残基在人、鼠、鸡中CD147分子中高度保守，提示CD147分子的跨膜片段扮演着重要的功能角色，在不同种属中体现出功能的相似性。在跨膜区的中间部位存在有带电荷的谷氨酸残基，这在其它的膜蛋白分子中是不常见的，揭示CD147分子可以与其它的跨膜蛋白相互联系。跨膜区包括3个亮氨酸残基(L2°6、L213、L22tl)和I个苯丙氨酸残基(F227)，且每隔7个氨基酸残基出现一次，为典型的亮氨酸拉链结构。跨膜区的带电残基及亮氨酸拉链结构是一个潜在的蛋白相互作用基序，很可能介导CD147分子参与形成信号转导多肽链或膜转运蛋白成份。对胞内结构域的研究，目前尚无全面的分析，Schlosshauer-B等曾用双标记实验检测到CD147与F-肌动蛋白(actin)共同存在，发现膜表面CD147的表达与细胞骨架中微丝蛋白有关。而是否有磷酸化位点，如何传递信号等功能尚为未知。CD147基因由8个外显子编码，总长度10.8Kb。Exonl (aal 23，107bp)与Exon2 (aa2 75， 154bp)被Intronl (约6.5Kb)隔开，该内含子是EMMPRIN基因中最大的内含子序列。Intron2大约700bp,是基因中第二大干扰序列。Exon3 (aa76 102，83bp)与 Exon4(aal03 148， 138bp)被 300bp 的 Intron3 所分隔开。Intron4 大约 650bp ；Exon5 (aal49 240，276bp) ；Intron5 约 550bp ;Exon6 (aa241 249，25bp)非常短；Intron6 约250bp ；Exon7 (aa250 269，69bp) ；Intron7 约 300bp,最后一个外显子是 Exon8,为 736bp。Exonl编码5’非翻译区(5’-UTR)和信号肽。Exon2和Exon3编码第一个Igl结构域:Exon2编码52个密码子，约占Igl的66%，Exon3编码27个密码子，约占Ig的34%。Exon4和Exon5编码第二个Ig结构域:Exon4编码46个密码子，约为45%，Εχοηδ是“结合”外显子，编码剩余55%的Ig结构域，以及跨膜结构域的24氨基酸残基和一小部分胞内结构域。Εχοη6和7编码胞内结构域，Εχοη7也编码终止密码子和3’ -UTR的5个核苷酸残基。Εχοη8编码剩余的 3， UTR0⑶147分子是一个潜在的粘附分子，⑶147与N-CAM、1-CAM及其他相关IgSF亚群分子在功能上有相似的特性，参与细胞与细胞、细胞与基质的粘附。已有实验证明CD147分子可与Integrin家族α3β1、α 6 β I形成蛋白复合物,但关于复合物的功能目前还不清楚，可能与肿瘤细胞与细胞外基质及肿瘤细胞与间质细胞之间的粘附有关；另有实验表明:某些CD147单抗可抑制雌激素依赖的乳腺癌细胞系MCF-7及MDA-435的同型聚集，以及MCF-7细胞对IV型胶原、FN、LN的粘附。CD147分子是一个新的细胞表面粘附分子，介导细胞粘附作用。这类分子的表达及其在炎-癌疾病中的作用是目前研究的一个重点。5A12MAL.是我中心制备的Habl8Gedomabl杂交瘤细胞株(中国，武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心保藏编号=CCTCC N0:C200408,2004年5月29日)产生的鼠源性单克隆抗体，其表位位于CD147分子胞外段C2结构域，研究表明:⑶147参与了 APC-T细胞相互作用的免疫突触形成，促进T细胞活化，与RA的病变发生发展密切相关。采用5A12MAb可以抑制上述病理过程。研究还发现，T细胞活化后，⑶147、⑶48与GMl在脂筏中的表达显著上升；共聚焦显微镜观察Jurket细胞与CMAC标记的Raji细胞共培养体系，发现HAbl8G/⑶147分别与CD48和GMl在免疫突触中共定位，参与T细胞免疫突触形成。其单抗5A12MAb可抑制T细胞活化和增殖，该单抗交联CD147能够显著抑制CD3刺激以及CD3+CD28协同刺激所介导的免疫突触形成、T细胞活化及增殖。细胞凋亡分析发现，5A12MAb所介导的协同信号还促进了 T细胞凋亡的发生。研究还发现:TCR激发的活化T细胞IL-2以及IL-2受体⑶25的分泌与表达，也因为5A12MAb交联⑶147而被下调。5A12MAb交联⑶147能够干扰脂筏结构的形成，同时5A12MAb能够抑制T细胞活化过程中的同型细胞聚集现象，从而抑制T细胞的活化。蛋白质的生物学功能在很大程度上取决于其空间结构，蛋白质结构构象多样性导致了不同的生物学功能。蛋白质结构与功能关系研究是进行蛋白质功能预测及蛋白质设计的基础。蛋白质分子只有处于它自己特定的三维空间结构情况下，才能获得它特定的生物活性；三维空间结构稍有破坏，就很可能会导致蛋白质生物活性的降低甚至丧失。例如，血红蛋白与氧分子的结合、酶与其底物的结合、激素与受体的结合以及抗体与抗原的结合等。知道了基因密码，科学家们可以推演出组成某种蛋白质的氨基酸序列，却无法绘制蛋白质空间结构。随着近年来在结构生物学方面的进展，用X射线衍射或NMR分析，使用立体结构和分子设计技术，已揭示了许多蛋白质以及蛋白质复合物的立体结构。对于蛋白质以及蛋白复合物空间结构的了解，将有助于明确蛋白质的功能机制。同时，蛋白质是药物作用的靶标，联合运用基因密码知识和蛋白质结构信息，药物设计者可以设计出小分子化合物，抑制与疾病相关的蛋白质以及蛋白质复合物，进而达到治疗疾病的目的。CD147_5A12MAb抗原抗体复合物结构的阐明，在为疾病的治疗或诊断试剂的设计中具有重要作用。在本发明之前，CD147促进肿瘤进展、调节肿瘤细胞浸润转移、介导炎症发生、易化病毒及寄生虫入侵宿主细胞等的机制并不十分明确，5A12MAb的抗原表位及其抑制T细胞活化的分子机制并不十分清楚。因此，尽管有关于CD147及其单抗5A12MAb的一般功能与作用的知识，但是为治疗或诊断疾病(例如类风湿关节炎)而进行的试剂研发、抗体改造则因为缺乏相应的结构信息而受到限制。因此，有必要阐 明⑶147分子与其单克隆抗体5A12MAb形成的复合物的三维结构并建立其模型，这将明确CD147分子与5A12MAb单抗的结合位点，有助于确定CD147分子与整合素、CyPA, Annexin II等作用分子相互作用的活性位点，以便利用结构和模型来辅助疾病治疗策略，譬如基于结构的药物设计。本文所用的术语“蛋白质的立体结构”指某些条件下蛋白质氨基酸序列确定的蛋白质的三维结构，即具有氨基酸序列的蛋白质在某些条件下折叠而成的三维结构。可用X射线衍射的方法或NMR确定蛋白质的结构。
发明内容
本发明的一个目的是，为确定⑶147_5A12MAb复合物的三维结构提供足够质量的晶体。本发明也包括培养⑶147-5A12MAb复合物晶体的方法。本发明的第二个目的是提供了关于⑶147_5A12MAb复合物晶体的结构信息。这些信息为设计和生产在动物体内(包括人)调节炎-癌疾病的发生、发展等方面的抗体、肽类物质、蛋白物质、小分子物质(包括化学物质)提供了一种方式(即基于结构的药物设计)。譬如，通过各种计算机软件和模型，可以设计上述物质来抑制CD147分子的生物学活性，从而达到抑制肿瘤进展、炎症发生、病毒及寄生虫入侵宿主细胞等。相应地，本发明的第三个目的是提供一种方法，其利用所获得的⑶147_5A12MAb复合物晶体的结构信息，结合定点突变和功能实验等手段确定CD147分子胞外区的活性位点，及由该活性位点的氨基酸序列、结构等信息来设计用于治疗和诊断疾病的试剂。相应地，本发明的第四个目的是提供利用CD147_5A12MAb复合物晶体的结构信息来设计、制备能与CD147胞外区结合并抑制或刺激CD147生物学活性的抗体、蛋白物质、肽类物质或小分子物质(化学物质)等。该抑制性或刺激性物质由以下几点的方法确定:(a)提供⑶147-5A12MAb复合物的三维结构；(b)明确⑶147分子胞外区的活性位点；(c)使用活性位点结构信息设计抗体、蛋白类物质、肽类物质或小分子物质(化学物质)等；(d)合成该种物质；(e)评估合成的所述物质改变CD147介导的胚胎发育、肿瘤侵袭、转移，炎症发生、发展，病毒及寄生虫感染扩增等。本发明包括一种⑶147胞外区与鼠源抗⑶147单克隆抗体5A12MAbFab段的复合物CD147-5A12MAb的晶体，该晶体具有单斜晶系中的空间群P2JPSEQ ID NO: USEQ ID NO:
2、SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列；所述晶体具有符合下表的三维结构。表I
权利要求
1.一种⑶147胞外区与鼠源抗⑶147单克隆抗体5A12MAb Fab段的复合物⑶147-5A12MAb的晶体，其特征在于，该晶体具有单斜晶系中的空间群P21和SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列；所述晶体具有符合下表的三维结构:
2.如权利要求1所述的复合物⑶147-5A12MAb晶体，其特征在于:(1)该晶体具有四棱柱形的晶胞，在一个不对称单位内有6个⑶147分子，6个单抗5A12MAb的Fab段，分子量之和约为446.4±0.5kD，溶剂含量约54±1% ；(2)⑶147_5A12MAb晶体的三维空间结构特点:该复合物晶体⑶147靠近N端的C2-set结构域与单抗5A12MAb的Fab段形成了抗原抗体复合物；(3)⑶147胞外区序列来源于人，5A12MAb是鼠源性抗⑶147单克隆抗体。
3.如权利要求1所述的复合物⑶147-5A12MAb晶体，其特征在于:⑶147胞外区与5A12MAb Fab段相互作用的位点位于⑶147胞外区N端C2_set结构域，参与表位的残基为:Val61-Asp65，Gly69，Glu73，Lys75 ;抗体5A12MAb上参与识别抗原表位的残基包括重链上的 Asn50, Tyr51, Trp52, Ser74, Tyr120, Aspl21, Glul23,以及轻链上的 Thr51, Tyr52,Tyr69, Tyrll2。
4.一种鉴别能与⑶147胞外区结合的物质的方法，其特征在于:包括用⑶147晶体浸泡可能的小分子化合物并共结晶、以及采用测定分子间相互作用的方法筛选可能的配体或拮抗剂及通过计算机模建方法利用CD147晶体结构与可能的配体进行三维结构比对、设计、对接。
5.一种利用计算机辅助三维模建、分子对接技术选择及确定CD147胞外区抗体、配体及其它相互作用分子的方法，其特征在于:包括如下步骤:(I)通过计算机三维模建CD147胞外区与可能的抗体、配体及其它作用分子的三维结构；(2)CD147胞外区三维结构和抗体、配体及其它相互作用分子三维结构的对接；(3)评估抗体、配体及其它作用分子的三维结构是否能与CD147功能性表位的三维结构结合；(4)CD147胞外区生物活性位点的分析。
6.如权利要求5所述的一种利用计算机辅助三维模建、分子对接技术选择及确定⑶147胞外区抗体、配体及其它相互作用分子的方法，其特征在于:基于⑶147-5A12MAb复合物晶体结构设计、研发、改造的抗体、配体及其它作用分子作为试剂、拮抗物、模拟物或药物。
7.一种基于结构的生物活性物质的药物设计的计算机辅助方法，其特征在于:该方法包括: a.提供一种⑶147-5A12MAb复合物晶体,其中所述晶体表现为一种符合表I的三维结构； b.用所述晶体的结构信息设计 一种抗体、肽类物质、蛋白类物质、小分子物质； c.合成所述的抗体、肽类物质、蛋白类物质、小分子物质； d.评估上述的合成的抗体、肽类物质、蛋白类物质、小分子物质的生物活性。
8.如权利要求7所述的一种基于结构的生物活性物质的药物设计的计算机辅助的方法，其特征在于:其中所述的设计步骤包括计算机筛选一个或多个化学化合物数据库，其中所述化合物的三维结构是已知的。
9.如权利要求8所述的一种基于结构的生物活性物质的药物设计的计算机辅助的方法，其特征在于:该方法进一步包括让所述筛选步骤鉴定出的化合物与所述计算机模型相互作用。
10.如权利要求7所述的一种基于结构的生物活性物质的药物设计的计算机辅助的方法，其特征在于:(1)其中所述的设计步骤包括定向药物设计或随机药物设计；(2)其中所述的设计步骤包括筛选出那些被预测为能够结合所述CD147胞外区功能性表位三维结构的化合物；(3)其中所述的生物活性指:与所述CD147蛋白结合，抑制或激活所述CD147蛋白活性。
全文摘要
本发明涉及了CD147-5A12MAb复合物晶体结构及应用。本发明包括5A12MAb抗体识别的抗原表位信息和5A12MAb抗体上参与识别抗原表位的氨基酸残基。本发明也包括制备所述晶体、解析所述晶体结构的方法。本发明还包括计算机模建、分子对接的方法确定CD147胞外区活性位点的方法及相应的活性位点。另外还公开了所述晶体的用途，包括基于结构的药物设计，抗体、配体及相互作用分子的筛选和鉴定以及抗体的改造和修饰。
文档编号G06F19/16GK103204940SQ20131000301
公开日2013年7月17日 申请日期2013年1月5日 优先权日2013年1月5日
发明者陈志南, 余晓玲, 朱平, 崔洪勇, 张征, 汪莉, 张阳, 汪世婕 申请人:陈志南