专利名称:一种交联草酸脱羧酶聚集体的制备方法
技术领域：
本发明属于生物化工领域，具体的提供了一种交联草酸脱羧酶聚集体(oxdc-CLEAs)的制备方法。
背景技术：
草酸(H00C-C00H)以草酸盐的形式广泛的分布在植物、微生物和人在内的生物体内。人体内没有降解草酸盐的相关酶，人们在食用某些高草酸含量的食物如菠菜，苋菜，草莓，橘子，李子，花生酱，高粱和茶叶等会容易造成草酸盐在人体内积累，从而引发如尿结石、肾结石、高草酸尿、低血钙症等多种病理状态。泌尿性系统结石病严重影响着人类的健康，根据地理环境的不同其发病率在3% 15%，而且还呈上升到趋势，结石病治疗后易复发，治愈后复发率高达60% 80% (董婷婷等，利用乳酸菌降解草酸预防结石的研究进展，中国微生态学杂志，2011，23 (3):266)。对部分病人的结石成分进行分析，发现难溶的草酸.丐高达 80% (Fredric L.Coe 等，Kidney stone disease, The Journal of ClinicalInvestigation, 2005,115(10):2598-2608)，可见草酸盐是导致结石症的重要原因。目前对高草酸盐水平引起结石症的治疗方法都不是非常理想，主要通过限制草酸的摄入量来预防结石，而且许多原发性的高草酸尿患者需要密集的透析和器官移植，这大大增加了患者的痛苦和经济压力，因此需要寻求一种安全的从体内去除草酸盐的方法。通过服用某种酶制剂降解摄入体内的草酸盐，是缓解泌尿性系统草酸盐结石病症，降低患者痛苦的有效方法。
草酸脱羧酶(EC 4.1.1.2)催化转化草酸为甲酸和C02，是生物体内催化降解草酸及草酸盐的主要催化酶之一，对底物草酸具有较强的专一性。草酸脱羧酶主要存在于木材腐败真菌中，如漆斑菌(Myrothecium Verrucari)、金针燕(Flammulina velutipes)、黑曲霉(Aspergillus niger)、双抱蘑燕(Agaricus bisporus)等，细菌中枯草杆菌(Bacillussubtilis)的草酸脱羧酶研究报道较多。草酸脱羧酶在医疗，食品，工业生产和生物监测等领域都有非常大的应用潜力(曹茂新等，草酸脱羧酶及其应用，中国生物工程杂志，2005(增)170-175)。针对草酸盐结晶引起的结石症，目前已有一些使用草酸脱羧酶进行预防与治疗的报道，其中较有实用价值的是对草酸脱羧酶纯品进行结晶交联固定化，制备交联草酸脱羧酶结晶体制剂(oxdc-CLECs)(结晶化的草酸脱羧酶和使用方法，中国专利公开号:CN 101583375A)，但oxdc-CLECs的制备必须首先经过酶蛋白的结晶操作，所需的酶纯化程度和结晶条件都很高，操作困难，费用较高。2000年荷兰Delft大学的Sheldon小组提出了交联酶聚集体(CLEAs)的制备方法(Linqiu Cao等，Cross-Linked EnzymeAggregates:A Simple and Effective Method for the Immobilization of PenicillinAcylase, Org.Lett.,2000,2(10): 1361-1364)，该方法经过聚集和交联两个过程。其中，酶聚集过程是非共价的结合，没有造成酶三级结构的破坏，再通过双功能试剂的交联制备固定化酶聚集体，使其保持有效结构和催化活性。此外，酶聚集体的形成的过程中还可以去除粗酶中大部分杂蛋白，实现酶的初步纯化，因此CLEAs实质上可将酶的纯化与固定化合并为一个单兀操作。(Burcu Selin Aytar Preparation of cross-linked tyrosinaseaggregates, Proeess Bioehemistry, 2008,43:125-131)。与交联酶结晶体(CLECs)的制备方法相比，交联酶聚集体(CLEAs)方法具有对酶的纯化度要求不高，操作简单，成本低廉，设备简单，单位体积活性大，固定化酶空间效率高等优点。
发明内容
本发明的目的是针对目前制备交联草酸脱羧酶结晶体酶制剂存在的不足，提供了一种交联草酸脱羧酶聚集体(oxdc-CLEAs)的制备方法。该方法用乙醇、丙酮或硫酸铵对草酸脱羧酶进行沉淀分离，并使用交联试剂制备交联草酸脱羧酶聚集体，酶活力回收在90%以上。本发明方法使用设备简单，操作简单，成本低廉。对比游离草酸脱羧酶，oxdc-CLEAs的耐酸性、耐热性、耐胰蛋白酶的降解能力均有较大提高，可用于制备预防和治疗草酸盐洁净引起结石病的酶制剂。
本发明的技术方案:一种交联草酸脱羧酶聚集体的制备方法。包括重组草酸脱羧酶的诱导表达，草酸脱羧酶的沉淀分离，交联草酸脱羧酶聚集体的制备三部分。工艺步骤如下:
(I)重组草酸脱羧酶的诱导表达
将产草酸脱羧酶基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET32a/YvrK进行发酵培养。当细菌生长至0D_为0.8时，加入MnCl2及IPTG诱导草酸脱羧酶表达，离心收集菌体，磷酸盐缓冲液重悬菌体后进行超声破碎细菌，离心收集上清为粗酶液。
(2)草酸脱羧酶的沉淀分离
向草酸脱羧酶粗酶液缓慢加入适当浓度的预冷硫酸铵、乙醇或丙酮，置于冰箱过夜，离心收集沉淀，用磷酸盐缓冲液重新溶解，获得纯化草酸脱羧酶。纯化酶液利用SDS-PAGE进行鉴定分析。
`[0010](3)交联草酸脱羧酶聚集体的制备
取分离纯化酶液加入10% 50%乙醇于4°C冰箱沉淀过夜，得到草酸脱羧酶聚集体悬浮液。添加BSA0.lmg/L 1.50mg/L,加入交联剂戍二醒溶液,在pH3 9,4°C条件下于交联反应0.5 3.5h。离心弃上清并用磷酸盐缓冲液反复清洗沉淀，直至清洗液检测不出任何活力即得到交联草酸脱羧酶聚集体，重悬于磷酸盐缓冲液4°C冰箱保存。
草酸脱羧酶的活力检测:反应液含76mmol/L草酸钾,50mmol/L pH 4.0朽1檬酸缓冲液，37°C水浴2min，加入草酸脱羧酶液开始反应，IOmin后加入等体积的0.2mol/L磷酸氢二钾使体系PH上升至中性终止反应。终止反应液体系加入辅酶NAD+以及甲酸脱氢酶，分光光度法340nm检测分析甲酸脱羧酶催化反应速度，计算甲酸的生成量。酶活力单位定义为:每分钟催化转化草酸产生I μ mo I甲酸的酶量。
交联草酸脱羧酶聚集体活性测定方法同游离草酸脱羧酶酶活力测定方法，反应在120rpm震荡条件下进行。
交联固定化酶活回收率:回收的交联固定化酶的酶活力与用于交联固定化的酶的总活力之比。
蛋白浓度采用考马斯亮蓝法测定，以牛血清白蛋白作为标准。
本发明的优点在于:
①采用硫酸铵或有机溶剂沉淀法沉淀分离草酸脱羧酶，分离效率高，操作简单，成本低，获得草酸脱羧酶纯度较高。
②利用交联酶聚集体法(CLEAs)交联固定草酸脱羧酶，把酶的纯化和固定化合并成一个单元操作，不需要制备高纯度酶交联用酶，操作简单，节约成本。
③交联酶聚集体法制备得到交联草酸脱羧酶聚集体，耐酸性，耐热性，耐胰蛋白酶降解能力均有提高，可作为酶制剂应用于防治草酸盐结晶导致的结石病。
图1不同沉淀剂沉淀分级草酸脱羧酶的SDS-PAGE，图中泳道1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分别为粗酶液、25%乙醇、30%乙醇、25%丙酮、30%丙酮、蛋白质marker、30%硫酸铵、40 %硫酸铵、60 %硫酸铵、粗酶液。
图2游离草酸脱羧酶与交联草酸脱羧酶聚集体的最适pH
图3游离草酸脱羧酶与交联草酸脱羧酶聚集体的最适反应温度
图4游离草酸脱羧酶与交联草酸脱羧酶聚集体的耐热性
图5 65°C游离草酸脱羧酶与交联草酸脱羧酶聚集体的热稳定性
图6游离草酸脱羧酶与交联草酸脱羧酶聚集体对胰蛋白酶的耐受性
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合实施例子对本发明做进一步的描述。
实例1:
(I)重组草酸脱羧酶的诱导表达
将基因工程菌E.coli BL21 (DE3)/pET32a/YvrK接于含氨苄青霉素(0.lmg/ml)的LB培养基中37°C，250r/min进行培养。细菌生长至OD6tltl为0.8时，加人6mmol/L的MnCl2,0.4mmol/L的IPTG，30°C诱导表达8h，离心收集细菌沉淀，按每克湿重菌体加IOmL磷酸盐缓冲液(50mmol/L，pH8.0)重悬菌体，超声破碎细菌后，离心收集上清为粗酶液。
(2)草酸脱羧酶的沉淀分离
在IOml的试管中加入5ml粗酶液，逐滴滴加预冷无水乙醇至乙醇浓度为10% 50%，置于4°C冰箱过夜，离心收集沉淀，用50mmol/L pH8.0磷酸盐缓冲液重溶，获得纯化
草酸脱羧酶。
酶活力检测及蛋白浓度分析表明，乙醇沉淀可除去粗酶液中66.2%的蛋白，酶活回收达91.2%，纯化倍数为2.7倍。
(3)交联草酸脱羧酶聚集体的制备
-在IOml离心管加入5ml纯化酶液，逐滴滴加无水乙醇至乙醇浓度为20% 50 %，置于4 °C冰箱过夜，添加BSA至0.25mg/L 1.25mg/L,逐滴滴加戊二醛溶液至0.01% 0.15%，在pH3 9，4°C条件下交联反应0.5 3.5h，离心弃上清，用50mmol/LpH8.0磷酸盐缓冲液洗涤至上清无酶活性，即得交联草酸脱羧酶聚集体。
测定该交联酶聚集体的活力为780U/g，酶活力回收为65.7%。
实例2:
(I)重组草酸脱羧酶的诱导表 达同实例I
(2)草酸脱羧酶的沉淀分离[0039]在IOml的试管中加入5ml粗酶液，逐滴滴加预冷丙酮至浓度10% 50%，置于4°C冰箱过夜，离心收集沉淀，用50mmol/L pH8.0磷酸盐缓冲液重溶，获得纯化草酸脱羧酶。
酶活力检测及蛋白浓度分析表明，丙酮沉淀可除去粗酶液中73.6%的蛋白，酶活回收达79.2%，纯化倍数为2.84倍。
(3)交联草酸脱羧酶聚集体的制备
在IOml离心管加入5ml纯化酶液，逐滴滴加无水乙醇至乙醇浓度为20% 50%，置于4 °C冰箱过夜，添加BSA至0.lmg/L 1.0mg/L,逐滴滴加戊二醛溶液至0.05 % 0.12%,在pH3 9,4°C条件下交联反应0.5 3.5h,离心弃上清,用50mmol/L pH8.0磷酸盐缓冲液洗涤至上清无酶活性，即得交联草酸脱羧酶聚集体。
测定该交联酶聚集体的活力为650U/g，酶活力回收为52.8%。
实例3:
(I)重组草酸脱羧酶的诱导表达同实例I
(2)草酸脱羧酶的沉淀分离
在IOml的试管中加入5ml粗酶液，逐滴滴加预冷饱和硫酸铵至浓度20% 80%，置于4°C冰箱过夜，离心收集沉淀，用50mmol/L pH8.0磷酸盐缓冲液重溶，获得去纯化酸脱羧酶。
(3)交联草酸脱羧酶聚集体的制备
在IOml离心管加入5ml纯化酶液，逐滴滴加无水乙醇至乙醇浓度为10% 50%，置于4 °C冰箱过夜，添加BSA至1.0mg/L 1.5mg/L,逐滴滴加戊二醛溶液至0.01 % 0.08%,在pH3 9,4°C条件下交联反应0.5 3.5h,离心弃上清,用50mmol/L pH8.0磷酸盐缓冲液洗涤至上清无酶活性，即得交联草酸脱羧酶聚集体。
实例4:
(I)重组草酸脱羧酶的诱导表达同实例I
(2)草酸脱羧酶的沉淀分离同实例I
(3)交联草酸脱羧酶聚集体的制备同实例I
(4)游离酶与交联酶聚集体的性质比较
①最适pH
在pH2.5至pH7.0的不同柠檬酸缓冲液反应体系中分别测定游离酶与交联酶聚集体的酶活力，以活性最高数据为100%酶活力，计算相对酶活力。
结果表明:交联草酸脱羧酶聚集体的反应pH范围比草酸脱羧酶宽泛，在pH2.5的时候交联草酸脱羧酶聚集体还有80%的酶活力，而游离草酸脱羧酶的酶活力不到10 %，说明交联聚集后的酶对酸性环境耐受能力更强。
②最适反应温度
反应柠檬酸缓冲液ρΗ4.0，在不同温度下分别测定酶活力，以活性最高数据为100%酶活力，计算不同温度下的相对酶活力。
结果表 明:游离草酸脱羧酶和交联草酸脱羧酶聚集体的最适反应温度均在47°C左右。
③耐热性
游离酶与交联酶聚集体在不同温度下热处理30min后测酶活力，观察处理后酶活力的变化。将游离酶和交联酶聚集体置于65°C水浴，每半小时取样检测残余酶活。
结果表明:游离草酸脱羧酶的变性失活温度低于65°C，交联草酸脱羧酶聚集体的变性失活温度高于70°C ;将游离草酸脱羧酶与交联酶聚集体分别置于65°C水浴，每隔半小时测酶活力，3.5h内，交联草酸脱羧酶聚集体酶活基本无损失，游离草酸脱羧酶在65°C下逐渐发生变性失活，半衰期tl/2为2h。
④对胰蛋白酶的耐受性
分别取4.5ml游离酶和交联酶聚集体，加入2.5g/L的胰蛋白酶溶液0.5ml，37°C水浴，定时取样检测剩余酶活力，以原始活性数据为100%酶活力，观察游离酶和交联酶聚集体对抗胰蛋白酶消化的能力。
结果表明:交联草酸脱羧酶聚集体对胰蛋白酶消化的耐受能力显著高于游离草酸脱羧酶，其中，使用胰蛋白酶处理48h后，交联草酸脱羧酶残余酶活力仍大于80%，而游离草酸脱羧酶残余酶活力低于50%。通 过制备交联酶聚集体，可提高草酸脱羧酶抵抗胰蛋白酶消化的能力，适用于开发药用酶制剂。
权利要求
1.一种交联草酸脱羧酶聚集体的制备方法，包括:重组草酸脱羧酶的诱导表达，草酸脱羧酶的分离纯化，制备交联草酸脱羧酶聚集体的步骤；其特征在于:使用乙醇、丙酮或硫酸铵对粗酶液中的草酸脱羧酶进行沉淀分离，使用乙醇制备草酸脱羧酶聚集体悬浮液，使用交联酶聚集体方法对草酸脱羧酶聚集体进行交联固定化；其中，交联固定化反应条件为:使用戊二醛浓度0.01% 0.15%, pH3 9，添加BSA浓度0.lmg/L 1.5mg/L，反应温度40C，交联反应时间0.5 3.5h。
2.如权利要求
1所述的方法，其特征在于:使用乙醇、丙酮或硫酸铵对粗酶液中的草酸脱羧酶进行沉淀分离，乙醇浓度为10% 50%、丙酮浓度为10% 50%，硫酸铵浓度为20% 80%。
3.如权利要求
1所述的方法 ，其特征在于:使用10% 50%乙醇制备草酸脱羧酶聚集体悬浮液。
专利摘要
本发明提供了一种交联酶聚集体法(CLEAs)交联固定草酸脱羧酶的方法，属于生物化工技术领域：
。本发明包括重组草酸脱羧酶的诱导表达，草酸脱羧酶的分离纯化和交联草酸脱羧酶聚集体的制备三部分。本发明的特点在于用乙醇、丙酮或硫酸铵对粗酶液中的草酸脱羧酶进行沉淀分离，使用乙醇制备草酸脱羧酶聚集体，使用0.01％～0.15％的戊二醛在添加BSA0.1mg/L～1.5mg/L、pH3～9、4℃条件下交联反应0.5～3.5h，制备交联草酸脱羧酶聚集体，交联固定化酶的酶活力回收达90％以上。本发明实验操作简单，成本低廉，获得的交联草酸脱羧酶聚集体稳定性比游离草酸脱羧酶明显提高，可应用于开发针对草酸盐结石病的酶制剂。
文档编号C12R1/19GKCN102492683 B发布类型授权 专利申请号CN 201110390880
公开日2013年6月12日 申请日期2011年12月1日
发明者林日辉, 梁跃, 黄文勤 申请人:南宁奕德环境科技有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan