新积雪草酸衍生物的制备及在抗肿瘤药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于天然药物化学领域，涉及化学结构通式为式(1)所示的两种新化合物1和2的制备；本发明还涉及该新化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。其制备方法是利用发明人筛选的对积雪草酸具有结构修饰能力的蓝色犁头霉(Absidia?coerulea)菌种，在优化条件下发酵培养，对积雪草酸进行转化7～10天，转化产物用有机溶剂萃取，分离纯化得到两个新的积雪草酸衍生物。
【专利说明】新积雪草酸衍生物的制备及在抗肿瘤药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于天然药物化学领域，涉及新的积雪草酸衍生物及其制备方法，以及新化合物在抗肿瘤方面的应用。
【背景技术】
[0002]积雪草酸(asiatic acid)，又名亚细亚酸，是药用伞形科植物积雪草中提取的三萜酸，属于乌苏烷型五环三萜类化合物。由于积雪草酸的化学结构中存在活泼的双键、羟基、羧基官能团，因而具有广泛的生物学活性，如保肝、抗肿瘤、改善神经认知障碍、抗抑郁、抗2型糖尿病、抗氧化、抗炎、抑菌等作用。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供了一类新的积雪草酸衍生物。
[0004]本发明的另一个目的是提供了新积雪草酸衍生物的制备和抗肿瘤用途。
[0005]本发明是通过如下技术方案完成的，具体内容包括:积雪草酸的微生物转化反应、产物提取分离及结构鉴定、体外抗肿瘤活性评价。
[0006](I)积雪草酸的植物悬浮培养细胞转化反应
[0007]将积雪草酸溶于乙醇溶液中，配成浓度为10~20g / L的底物溶液，加入到在25~28°C，150~200rpm / min条件下培养了 I~3天的微生物中，转化反应条件为:25~280C，150 ~200rpm / min, 7 ~10 天。
[0008](2)产物的提取分离纯化
[0009]转化结束后，用乙酸乙酯等有机溶剂萃取，减压浓缩，经硅胶柱色谱、凝胶柱色谱分离纯化得到化合物1、化合物2。
[0010](3)新化合物体外抗肿瘤活性评价
[0011]将新化合物作用于人肺癌细胞A-549、人结肠癌细胞SW480、人肝癌细胞H印G2，评价其抗肿瘤效果。
【具体实施方式】
[0012]以下通过实施例对本发明作进一步说明，但其并不限制本发明的保护范围。
[0013]实施例1
[0014]新化合物1、2的制备及提取分离
[0015]在15瓶IOOOml (每瓶400mL培养基)的三角瓶中以2%的接种量接入蓝色犁头霉Absidia coerulea CGMCC3.2462 菌种，置于恒温振荡器中，180rpm / min，27°C培养 72h 后加入300mg底物积雪草酸(溶于20ml乙醇中，每瓶加入2ml)，继续培养10天。发酵完成后，过滤菌丝体，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取三次，菌丝体干燥后粉碎，用500mL乙酸乙酯超声提取三次，每次30min，合并乙酸乙酯萃取液与提取液，置旋转蒸发仪上浓缩至小体积，干燥，得转化反应提取物(3.12g)。[0016]将提取物用少量乙醇溶解，3g硅胶(200-300目)拌样，40g硅胶(300-400目)分离，氯仿/甲醇梯度洗脱(从100:0到90:10，共3000ml)，收集到五个流分:A(2547.lmg)，B (260.3mg)，C (121.3mg)为未反应的积雪草酸，D (24.0mg)，E (48.6mg)，流分D用凝胶柱分离，无水乙醇洗脱(IOml —个流分，共430ml)，得到化合物I (13.8mg)，流分E用凝胶柱分离，无水乙醇洗脱(IOml —个流分，共480ml)，得到化合物2 (27.8mg)。
[0017]实施例2
[0018]新化合物I结构鉴定
[0019]化合物I为白色无定型粉末，HR-ES1-MS给出503.3391 ([M-H] O，结合1H-NMR和13C-NMR推断确定分子式为C3tlH48O6。1H-Nmr^oomHz, pyridine-d5)中，显示该化合物有六组甲基氢信号 δ 0.82 (3Η, d,6.0) ,0.95 (3H, d, 6.6), 1.06 (3H, s), 1.07 (3H, s), 1.09 (3H,s)，1.23 (3H，s);低场处有两个活泼氢信号:δ 5.64 (dd，3.0,10.2), δ 6.14 (d，10.2)，推测是双键上的氢。13C-NMR中显示两个不饱和碳原子δ 129.8和δ 134.0，一个羧基碳原子δ 179.8。综合以上信息可以推断该化合物为乌苏烷型五环三萜酸类化合物。
[0020]依据HSQC、HMBC谱可以对化合物I的碳氢作进一步的归属。
[0021]与积雪草酸比较，13C-NMR谱中，化合物I在δ 89.7处出现一个连氧碳信号，同时C-12和C-18分别向低场位移8.4ppm和7.4ppm,以上数据说明C-13位连有羟基，C / D环为反式构型，确定13位羟基为β型。综上，确定化合物I的结构为:2 α，3β，13β，23_四羟基乌苏烷-11-烯-28-酸，为一新化合物，其1H-NMR谱、13C-NMR谱信号归属见表1。
[0022]表1.化合物I的1H NMR和13C NMR数据
【权利要求】
1.新的积雪草酸衍生物，其特征在于该化合物具有化学通式(I)所示的化学结构:
2.根据权利要求1所述的新的积雪草酸衍生物的制备方法是通过微生物酶对积雪草酸进行结构修饰。
3.根据权利要求2所述的新的积雪草酸衍生物的制备方法为:以积雪草酸为底物，利用微生物酶对底物进行生物转化，利用乙酸乙酯对发酵液中的转化产物进行萃取，利用硅胶柱层析、凝胶柱色谱进行转化产物的制备分离。
4.根据权利要求2所述的对积雪草酸进行结构修饰的微生物为蓝色犁头霉Absidiacoerulea CGMCC3.2462。
5.根据权利要求1所述的新的积雪草酸衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途。
【文档编号】A61K31/56GK103467560SQ201310431858
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月18日 优先权日:2013年9月18日
【发明者】陈松, 储智勇, 冯旭, 邹赢锌, 栾洁, 张术, 黄宝康, 高超, 周意 申请人:中国人民解放军海军医学研究所