专利名称：一种肾脏病及糖尿病人专用稻米品种的选育方法
技术领域：
本发明为一种肾脏病及糖尿病人专用稻米品种的选育方法，属于低水溶性蛋白水稻新品种的育种方法，专用于适合肾脏病及糖尿病人食用稻米品种的选育。
二、技术背景近年来由于我国城乡居民生活习惯和生态环境等的改变，我国肾脏病和糖尿病患者的人数在不断增加，据统计，近年来全国糖尿病患者总人数超过1亿人，其中有近600万人因糖尿病并发肾脏病而接受住院治疗。肾脏病及糖尿病(并发肾脏病)患者的蛋白质代谢机能障碍，在治疗期间不能食用可吸收蛋白含量超过4％的大米，因此采用低蛋白的饮食配合治疗是一种有效的措施，而目前我国尚无专用的低蛋白质大米品种，而以代用品进行饮食配合治疗，这无疑增加了患者的经济和精神负担，降低了医疗效果。
众所周知，通常稻米中的主要蛋白质可以分为清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白四大类，其中谷蛋白占整个蛋白质含量的60％，是稻米中可为人体吸收蛋白的主要成分；醇溶蛋白则不能被人体所吸收。因此，对于肾脏病和糖尿病患者来讲，所需要的是低水溶性蛋白(低可吸收蛋白)含量的大米。目前我国各稻区尚无低水溶性蛋白水稻品种在生产上大面积推广种植。
有益效果 与现有技术相比，本发明所提供的一种肾脏病及糖尿病人专用稻米品种的选育方法，具有如下优点1、本发明提供的方法选育了产量略高于越光，品质优良，特别是水溶性蛋白含量低于4％的低水溶性蛋白水稻新品种W3660。与传统育种方法相比，利用本方法培育低水溶性蛋白水稻品种的年限缩短，从而提高了育种效率。
2、选育的新品种W3360与日本低水溶性蛋白品种LGC-1相比，农艺性状有较大的改善。(见表1)表1. W3360与LGC-1农艺性状比较(2000-2001年平均)
3、育成品种W3660的主要优点生育期短、早熟W3660属中熟中粳，在南京地区于5月15日左右播种，6月15日左右移栽，8月19日左右齐穗，9月下旬成熟。
综合性状好株高90.2cm，主茎总叶片16张，地上伸长5节。株型稍松散，叶略长，叶色稍淡，转色快，熟相好，穗颈节稍长，每亩成穗约21万左右，每穗总粒数63，实粒数59，千粒重28g，亩产400kg左右。可留种繁殖。抗稻瘟病，抗纹枯病，较抗倒伏。
水溶性蛋白含量低该品系稻米的水溶性蛋白低于4％，适合肾脏病病人食用(表3)。
2、进行与低水溶性蛋白紧密连锁的分子标记的筛选，获得与低水溶性蛋白共分离的简单重复序列(SSR)标记RM424，SSR标记RM424的低水溶性蛋白特征谱带详见
图1。
3、以LGC-1为母本、日本主栽优良品种越光为父本进行杂交，从杂种F2代开始，根据各植株主穗12粒稻米中贮藏蛋白的含量、组分，对杂交后代群体进行系统选育，结合紧密连锁的分子标记RM424的辅助选择，获得水溶性蛋白含量介于3.1％～4％的适合肾脏病、糖尿病患者食用的水稻新品种W3660，其选育过程详见图5。其中蛋白含量及组分的测定方法①单粒糙米总蛋白的提取每粒米(糙米)加0.5ml溶剂A，研磨匀浆，在冰浴上，超声波处理数分钟，离心，15000rpm(或7000g)，5min，上清10ul用于SDS-PAGE，胶浓度为15％。然后用光密度仪检测各色带的密度(Beckman DU-8 Spectrimetre)。算出稻米中总蛋白质含量。
②各蛋白组分的分离100mg精米粉，加1.0ml试剂B离心管，超声波处理数分钟(冰浴)，微型匀浆机匀浆1min，离心(10000g，15min，4℃)重复三次，每次隔6h，上清置一试管中(清-球蛋白组分)，沉淀加1.0ml试剂C，超声波处理数分钟(冰浴)，离心(10000g，15min，4℃)重复三次，每次隔6h，上清置一试管中(醇溶蛋白组分)，沉淀加1.0ml试剂D，超声波处理数分钟(冰浴)，离心(10000g，15min，4℃)重复三次，每次隔6h，上清置一试管中(谷蛋白组分)，弃沉淀。
③用SDS-PAGE法测定各蛋白组分含量(以牛血清白蛋白为标准)300ul清-球蛋白组，300ul谷蛋白组，各加1.0ml 10％TCA(三氯乙酸)；300ul醇溶蛋白组，80℃干燥至100ul，加1.0ml 10％TCA，上述成分分别离心，10000g，15min，去上清，沉淀加100ul SDS-尿素，进行SDS-PAGE，然后用光密度仪检测535nm下各色带的密度(Beckman DU-8Spectrimetre)。算出稻米中清-球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白分别占总蛋白中的百分比。
④用Bradford法测定各蛋白组分含量(以牛血清白蛋白为标准)清-球蛋白组分，谷蛋白组分；醇溶蛋白组分(80℃干燥)，上述成分分别加蒸馏水定容至4.0ml，各加33ul 2％脱氧胆酸，作用15min，各加1.3ml 24％TCA，4℃过夜，离心3000rpm，15min，2℃，弃上清，沉淀，1.0ml 1NaOH(溶解各蛋白)，用Bradford法测蛋白含量(以牛血清白蛋白为标准)。
⑤各试剂的配方试剂A50mM KH2PO4-NaOH pH 6.8(或50mM Tris-HCl pH 6.8)+gM尿素+4％SDS+20％甘油+5％β-巯基乙醇试剂B50mM KH2PO4-NaOH pH 6.8(或50mM Tris-HCl pH 6.8)+0.SM NaCl试剂C60％正丙醇+1mM EDTA-2Na试剂D1％乳酸+1mM EDTA-2Na低水溶性蛋白指纹图谱的建立，可作为3660的鉴定标准
水稻基因组DNA的分离采用CTAB法。水稻孕穗期收取6～8克新鲜叶片(-80℃保存的叶片)，在-20℃预冷研钵中用液氮研磨成粉末；转移到-20℃预冷的三角瓶中，放入-20℃冰箱保存待用(过夜)；加入20ml 96℃ 1.5％CTAB缓冲液，迅速搅匀后，置于56℃水浴中，50rpm，水浴30min；转入50ml离心管中，加入等体积氯仿-异戊醇(24∶1)，室温下120rpm，40min充分混匀；室温下300rpm离心20min，取上清液；加入1/10体积56℃预热的10％CTAB缓冲液，混匀；加入等体积的氯仿-异戊醇(24∶1)，慢慢混匀；室温下3000rpm离心20min，取上清液；加等体积的CTAB沉淀缓冲液，轻轻颠倒数次直至DNA沉淀形成；室温下3000rpm离心20min，弃上清液，离心管倒置在吸水纸上干燥数分钟；加5ml 1M NaCl和5ul 10mg/ml RNaseA，56℃溶解DNA；加2倍体积的预冷(-20℃)无水乙醇，沉淀10min；弃上清，沉淀用等体积70％乙醇洗涤10min；弃70％乙醇，加等体积预冷(-20℃)无水乙醇脱水10min；DNA沉淀风干后，溶解于TE中备用。
微卫星的PCR扩增PCR反应体系10ul(1ul 10ng/ul DNA，0.7ul2pmol/ul引物，1ul 10×Buffer(free MgCl2)，0.2ul 2.5mM dNTP，0.6ul25mMMgCl2，0.1ul 5u/ul Taq，6.4ul ddH2O)，反应程序为95℃变性5min，95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，共进行35次循环，72℃延伸7min。PCR反应在PE-9600热循环仪中进行。
扩增产物的PAGE和银染检测扩增产物经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶浓度为8％，凝胶大小180×120×2mm，电泳缓冲液为0.5×TBE，以50bp的DNA Ladder为对照比较扩增产物的分子量大小，200V恒压电泳。电泳结束后，凝胶用蒸馏水稍微冲洗。银染方法如下含10％酒精，0.5％冰乙酸固定液固定2次，6分钟/次，然后0.2％AgNO3溶液渗透10～12分钟，ddH2O清洗2次，0.002％硫代硫酸钠溶液置代30s，用含NaOH1.5％、甲醛0.4％的溶液染色，最后用0.75％Na2CO3溶液终止显色反应。
低水溶性蛋白水稻的SSR指纹图谱W3660及其亲本的SSR指纹图谱见
图1，SSR标记RM242可将水溶性蛋白纯合基因型和杂合基因型区分开，因而可用于低水溶性蛋白纯合基因型水稻品种的选育。这是低水溶性蛋白水稻特有的分子检测特征，可作为W3660的鉴定标准。W3660的主要特点株高90.2cm，主茎总叶片16张，地上伸长5节。株型稍松散，叶略长，叶色稍淡，转色快，熟相好，穗颈节稍长，每亩成穗约21万左右，每穗总粒数63，实粒数59，干粒重28g，亩产400kg左右。可留种繁殖。抗稻瘟病，抗纹枯病，较抗倒伏。选育的新品种W3360与日本主栽水稻品种越光相比，农艺性状有一定的改善(见表2)。
表2.W3360与越光农艺性状比较(1998-2001年多年多点试验汇总资料)
生育期短、早熟W3660属中熟中粳，在南京地区于5月15日左右播种，6月15日左右移栽，8月19日左右齐穗，9月下旬成熟。
水溶性蛋白含量低该品系稻米的水溶性蛋白低于4％，适合肾脏病病人食用(表3)。
表3低水溶性蛋白大米W3660的蛋白质测定结果(2000～2001年)
注总蛋白含量指单粒稻米中蛋白质总量占整粒稻米总量的百分比。
以蛋白质含量为100％，其中清-球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白分别占总蛋白中的百分比。
权利要求
1.一种肾脏病及糖尿病人专用稻米品种的选育方法，包括1)以从日本生物资源研究所放射育种场引进的低水溶性蛋白的突变品种LGC-1为母本，以惊人糯为父本，杂交，杂种后代自交，从F1开始，后代种子总蛋白进行十二烷基磺酸钠变性-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析显示，谷蛋白含量为3.1～4％(M/M，下文同)的低谷蛋白性状和醇溶蛋白含量60-65％的高醇溶蛋白性状总是相伴出现；F1种子全部呈现低谷蛋白含量和高醇溶蛋白含量特性；F2种子中呈现低谷蛋白和正常蛋白性状的比例约为3∶1；测定F3种子蛋白，其低谷蛋白纯合型，杂合型和正常型的分离比例符合F2植株基因型1∶2∶1，表明低谷蛋白和高醇溶蛋白性状是由单显性基因控制，而且能稳定地遗传给后代；2)进行与低水溶性蛋白紧密连锁的分子标记的筛选，获得与低水溶性蛋白共分离的简单重复序列(SSR)标记RM424，SSR标记RM424具有低水溶性蛋白特征谱带；3)以LGC-1为母本、日本主栽优良品种越光为父本进行杂交，从杂种F2代开始，根据各植株主穗稻米中贮藏蛋白的含量、组分，对杂交后代群体进行系统选育，结合紧密连锁的分子标记RM424的辅助选择，获得水溶性蛋白含量为3.1％～4％的水稻新品种W3660。
2.据权利要求1所述的一种肾脏病及糖尿病人专用稻米品种的选育方法，其特征在于，以上述方法育成的W3660水溶性蛋白含量低于4％，简单重复序列(SSR)指纹图谱具有RM424标记的低水溶性蛋白特征谱带特征谱带。
全文摘要
本发明为一种肾脏病及糖尿病人专用稻米品种的选育方法，属于水稻新品种的选育。对稻米的贮藏蛋白含量、蛋白质成分、SDS－PAGE、SSR标记等分析，利用分子标记辅助选择结合SDS－PAGE、蛋白质含量测定等方法选育出水溶性蛋白含量低于4％的水稻新品种W3660，产量与越光持平。
图1为W3660及其亲本的简单重复序列(SSR)指纹图谱。
文档编号A01H1/02GK1421123SQ02157240
公开日2003年6月4日 申请日期2002年12月25日 优先权日2002年12月25日
发明者万建民, 江铃, 王春明, 朱速松, 江绍玫, 苏昌潮, 王益华, 翟虎渠, 刘世家, 陈亮明, 刘喜, 杨世湖 申请人:南京农业大学