专利名称：沉默赤霉素2-氧化酶的表达的组合物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及分离的编码红麻(/7Awa^ c朋"Wm^)赤霉素2-氧化酶(GA 2-氧化酶)的核酸序列。本发明进一步涉及沉默GA 2-氧化酶基因的表达以 增加才直物中的纤维的方法。
背景技术：
植物纤维是具有锥形末端和非常厚的、高度木质化的细胞壁的细长细 胞。许多具有重要经济价值的产品如纸、绳索(绳和索)和纺织品都是由植 物纤维衍生而来。纤维细胞充当植物茎和根的支持组织。纤维是厚壁组织
的组分，厚壁组织还含有较短的、厚壁硬化细胞(石细胞)。纤维经常发现 于单子叶植物和双子叶植物茎和根的木质部(木材)和韧皮部(树皮)组织。
在树木的主要商业产品中，纤维是一项重大的经济指标。1997年时曾 预测造纸纤维的全球总消费量将从1998年的约3亿吨增加至2010年的约 4.25亿p屯。
纤维形成的诱导受叶中产生的植物激素生长素和赤霉素，以及根中产 生的细胞分裂素(cytokinine)的控制。生长素和赤霉素还控制纤维细胞壁中 木质素的形成和结构。已显示在木质部和韧皮部中赤霉素均是诱导纤维的 特异性信号(Aloni， Plant Physiol. 63: 609-614， 1979; Aloni等，Plant Physiol. 94: 1743-1747， 1990)。
生长緩慢的障碍。
赤霉素(GA)是一组多于100个的四环二萜，其中一些是在整个植物生 命周期中影响生长和发育过程的必要的内源调节剂，所述生长和发育过程
9包括芽的伸长、叶的扩展和成形、开花和种子萌发。GA在控制芽的伸长
中的重要性得到了拟南芥(/1ra/H^/xTO)、玉米和豌豆的GA-缺陷型突变体 的证明。这些突变体具有与野生型(wt)植物相比降低的活性GA水平和更 短的节间，造成矮化表型。所述GA-缺陷型突变体的表型可通过施加活性 GA得到完全恢复。植物中GA的生物合成是通过从曱羟戊酸开始的类异 戊二烯途径发生的。赤霉素水平主要受赤霉素生物合成基因的转录控制的 调节。
多功能酶GA20-氧化酶是控制GA生物合成的关键酶。它催化C20赤 霉素GA12/GA53通过三个连续的氧化反应逐步转化成GA9/GA20，它们 分别是生物活性赤霉素GA4和GA1的直接前体。GA 20-氧化酶基因的表 达受GAl/4作用的下调，暗示直接终产物抑制参与该基因的调节。生物活 性GA降解的第一步包括GA 2-氧化酶，该酶使活性GA的C-2羟基化。 已从几个物种中克隆了 GA2-氧化酶基因(Thomas等.Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.， 96 (1999) 4698-4703)。
已显示具有高水平GA的纤细突变体表现出过度伸长。编码GA 2-氧 化酶的SLENDER基因揭示了 GA 2-氧化酶在控制GA水平中的作用。事 实上，GA2-氧化酶在拟南芥中的过表达导致GA水平降低，产生具有GA 缺陷的突变体"典型的矮化表型。
迄今为止，大多数关于增加纤维产量的遗传研究都集中于GA-20氧化 酶的过表达。在过表达GA-20氧化酶的转基因植物中，叶和节间中均测量 到了高水平的GA，证实GA生物合成得到增强。这些转基因植物显示增 加的纤维长度(Eriksson等.Planta， 214: 920-930, 2002; Huang等，Plant Physiol. 118: 773-781， 1998;和Biemelt等，Plant Physiol. 135: 254-265, 2004)，并且由于GA2-氧化酶的催化，显示非常高的非活性GA的水平。
第6,670,527号美国专利(Thomas等)公开了编码红花菜豆(i^o^o/M c6)cc/we^)牙口扣乂南芥(v4raZ)z'(iop^s1 Aa/z'crw")的GA-2 fU匕酶的斗亥酉臾序歹'J ，牙口这 些GA2-氧化酶的氨基酸序列。第6,670,527号美国专利涉及抑制植物生长 的方法，所述方法包括用表达具有GA 2-氧化酶活性的植物多肽的核酸转 化植物细胞。第6,670,527号美国专利进一步教导编码核酶的反义核酸序
10列和核酸序列，所述核酶可通过阻止GA 2-氧化酶灭活赤霉素而用于促进 植物生长。
第6,723,897号美国专利(Brown等)公开了通过生产转基因植物降低 植物中的GA水平的方法，所述转基因植物具有包含编码GA 2-氧化酶的 序列的转基因，GA2-氧化酶灭活内源GA。
第4,507,144号美国专利(Aloni)公开了增加植物的纤维产量的过程， 所述过程包括多次向植物施加生长素和赤霉素的组合，和在所述植物达到 需要的生长阶段后收获纤维(crop)。
红麻(Kenaf, //A/scws ccr朋aZ)w i/力是一种与棉花((7aw)^/ww /^n^wm L.) 近缘的生长迅速的一年生植物，6个月内高度可达4-6米，每英亩可产5-10 吨干纤维。红麻是一种环境友好的植物，长期以来一直用作生产绳索和索 的来源。美国对红麻(kenaf)的研究主要涉及作物生产(yield production)。 20 世纪70年代和80年代的一些研究涉及在新闻用纸中使用红麻，而将红麻 商业化制成各种产品成为近年来的主要焦点。红麻是优良的纤维来源，因 为它几乎不需要养护，而且由于其快速的萌发和出土，只需很少或不需要 使用除草剂。植物顶部叶片的致密冠层阻止杂草的生长。此外，红麻需要 的肥料量大致与陆地棉相同而少于玉米。大多数害虫都不会攻击此含纤维 的植物茎，因而无需使用杀虫剂。
考虑到软木材不足以供应日益增加的纸浆和纸制品的需求，红麻是很 有前途的纸浆替代品。由于红麻生长迅速，因而此植物是比美国目前用于 制浆的南方松(Southern pine tree)更好的纤维来源，南方松达到可收获尺寸 需要的时间从7到40年不等。
存在对有效和改良的方法的未满足的需求，以增加一般的植物和特别 的红麻植物的树皮(韧皮部)和木材(木质部)的纤维。
发明概述
本发明提供分离的编码红麻赤霉素2-氧化酶(GA 2-氧化酶)的核酸序 列和该酶的氨基酸序列。本发明进一步提供用于沉默才直物GA 2-氧化酶的基因表达的核酸序列，和通过沉默GA 2-氧化酶的基因表达增加植物纤维
产量的方法。
本文首次公开了使用设计用于产生靶向拟南芥植物GA 2-氧化酶基因 的siRNA的DNA构建体转化拟南芥植物，导致产生了其中GA 2-氧化酶 基因表达被RNA千扰(RNAi)沉默的转基因植物。发现所述转基因拟南芥 植物高于非转基因野生型拟南芥植物，它们的节间更长，并且它们比其野 生型对应植物开花更快。此外，所述转基因拟南芥植物茎中的纤维细胞数 量高于野生型植物的数量。
本文进一步公开使用设计用于产生靶向烟草植物GA 2-氧化酶基因的 siRNA的DNA构建体转化烟草植物，导致产生了其中GA2-氧化酶基因表 达被沉默的转基因植物。发现所述转基因烟草植物高于非转基因野生型烟 草植物。所述转基因烟草植物的叶长于野生型植物的叶。
本文公开了其中GA 2-氧化酶被沉默的转基因拟南芥和烟草植物表现 出与其中过表达GA 20-氧化酶的转基因拟南芥和烟草植物相似的表型特 性。因此，本发明令人惊讶地公开了沉默GA 2-氧化酶基因的表达引起的 植物赤霉素水平的增加，使植物生长更快和更高，所述植物的韧皮部和/ 或木质部纤维含量高于非转基因野生型植物。
本发明进一步公开了如SEQ ID NO: 1所述的编码红麻GA 2-氧化酶 的DNA序列、如SEQ ID NO: 2所述的红麻GA2-氧化酶的氨基酸序列和 如SEQ ID NO: 3所述的红麻GA 2-氧化酶基因组序列。本发明进一步公 开了能够产生RNA分子的DNA序列，所述RNA分子能够抑制各种植物 的GA 2-氧化酶基因的表达。所述DNA序列可用于转化植物以沉默GA 2-氧化酶基因的表达，以便降低这些植物中的赤霉素水平，并且所述转化植 物的纤维量和密度高于对照植物的纤维量和密度。所述转化植物可以是纸 浆和纤维的宝贵来源。本发明DNA序列特别适用于转化红麻植物。
本发明在本文是以拟南芥和烟草植物为例。但是，任何用作商业纤维 来源的植物在使用能够产生靶向所述植物的GA2-氧化酶基因的siRNA的 DNA构建体转化之后，均可成为更好和更富集的纤维来源，并因此属于本 发明范围。根据第一个方面，本发明提供分离的包含如SEQIDNO: 1所述的编 码红麻赤霉素2-氧化酶(GA2-氧化酶)的核苷酸序列、其片段、互补链或同 源序列的核酸分子，其中所述同源序列与SEQIDNO: 1具有至少80%序 列同 一性。根据一些实施方案，所述同源序列与SEQ ID NO: 1具有至少 90%、可选地至少95%、可选地100%序列同一性。根据某个实施方案， 所述分离的核酸分子具有如SEQ ID NO: 1所述的编码红麻GA 2-氧化酶 的核苷酸序列。根据另一个实施方案，所述分离的核包含如SEQIDNO: 4所述的核苷酸。
根据进一步的方面，本发明提供分离的包含如SEQIDNO: 2所述的 氨基酸序列的红麻GA 2-氧化酶多肽或其类似物或片段，其中所述类似物 与SEQ ID NO: 2具有至少80%、可选地至少90%、可选地至少95%或100% 氨基酸序列同源性。根据某个实施方案，所迷分离的红麻GA 2-氧化酶多 肽具有如SEQ ID NO: 2所述的氨基酸序列。
根据进一步的方面，本发明提供具有如SEQ ID NO: 3所迷的核苷酸 序列的编码红麻GA 2-氧化酶的核酸分子。
根据另一方面，本发明提供下调红麻GA 2-氧化酶基因的表达的双链 RNA分子，所述双链RNA分子包含
a) 包含与红麻GA2-氧化酶基因转录的RNA或其片段具有至少90% 序列同一性的至少20个连续核苷酸的所述双链RNA的第一个 RNA链；和
b) 包含与红麻GA 2-氧化酶基因转录的RNA的互补序列或其片段 具有至少90%序列同一性的至少20个连续核苷酸的所述双链 RNA的第二个RNA链，
其中所述第一个和第二个RNA链能够彼此杂交以形成所述双链 RNA分子。
根据一些实施方案，所述第一个和第二个RNA链各包含至少25个核 苷酸、可选地至少50个核普酸、可选地至少100个核苷酸、可选地至少 400个核苷酸。根据进一步的实施方案，所迷第一个RNA链与红麻GAS-氧化酶基因转录的RNA或其片段具有至少95%序列同一性、可选地100%序列同一性。根据进一步的实施方案，所述第二个RNA链与红麻GA 2-氧化酶基因转录的RNA的互补序列或其片段具有至少95%序列同一性、可选地100%序列同一性。才艮据进一步的实施方案，所述GA2-氧化酶基因转录的RNA包含如SEQ ID NO: 1所述的核苷酸序列。根据一个实施方案，所述第一个RNA链与由包含如SEQ ID NO: 4所述的核苷酸序列的核酸转录的RNA或其片段具有至少90%序列同一性。根据另一个实施方案，所述第二个RNA链与由包含如SEQ ID NO: 38所述的核苷酸序列的核酸转录的RNA或其片段具有至少90%序列同一性。
根据进一步的方面，本发明提供用于产生能够下调红麻GA 2-氧化酶基因表达的RNA分子的DNA构建体，该DNA构建体包含可操作地连接至编码形成双链RNA的RNA序列的多核苷酸序列的植物启动子，所述多核苷酸序列包含
(i) 包含与如SEQ ID NO: 1所述的核苷酸序列或其片段具有至少90%序列同一性的至少20个连续核苷酸的第一个核苷酸序列，和
(ii) 包含与如SEQ ID NO: 1所述的核苷酸序列的互补序列或其片段具有至少90%序列同一性的至少20个连续核苷酸的第二个核苷酸序列，
其中所述DNA构建体转录的RNA分子下调红麻GA 2-氧化酶基因的表达。
根据一些进一步的实施方案，所述第一个和第二个核苷酸序列各包含至少25个核苷酸、可选地至少50个核苷酸、可选地至少100个核苷酸。根据进一步的实施方案，所述第一个核苷酸序列与如SEQIDNO: 1所述的核苷酸序列或其片段具有至少95%序列同一性、可选地100%序列同源性。根据其它的实施方案，所述第二个核苷酸序列与如SEQIDNO: l所述的核苷酸序列的互补序列或其片段具有至少95%序列同一性、可选地100%序列同源性。
14根据一些实施方案，所述第一个核苷酸序列与如SEQIDNO: 4所述的核苷酸序列或其片段具有至少90%、可选地95%序列同一性。根据进一步的实施方案，所述第二个核苷酸序列与如SEQIDNO: 38所述的核苷酸序列或其片段具有至少90%、可选地95%序列同一性。
根据进一步的实施方案，所述植物启动子选自由组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子和发育阶段特异性启动子组成的组。
根据进一步的实施方案，所述DNA构建体进一步包含可选择的标记。根据某个实施方案，所述可选择的标记是编码赋予抗生素抗性的产物的多核苷酸序列。
根据进一步的实施方案，所述DNA构建体进一步包含选自由增强子、转录因子和转录终止子信号组成的组的表达控制序列。
根据进一步的实施方案，所述DNA构建体的第一个和第二个核苷酸序列可操作地连接至同一启动子。根据其它的实施方案，所述笫一个和第二个核苦酸序列被间隔子序列(spacer sequence )隔开。根据某些实施方案，所述间隔子序列产生自内含子。
根据另一方面，本发明提供耙向如SEQ ID NO: 3所述的核苷酸序列或其互补链的区域的寡核苷酸序列，其中所述寡核普酸序列能够与所述核苷酸序列或其互补链的区域特异性杂交，从而抑制GA2-氧化酶的表达。
根据一些实施方案，所述核苷酸序列的区域选自由5'-非翻译区、编码区、终止密码子区和3'-非翻译区组成的组。根据某些实施方案，所述寡核苷酸序列包含至少20个核苷酸。
根据进一步的实施方案，所述寡核苷酸序列包含至少一个修饰的核苷酸间键合。可选地，所迷寡核苷酸序列包含至少一个修饰的糖。优选地，所述寡核苷酸序列连接至植物启动子，其中所述植物启动子可操作地连接至所述反义寡核普酸序列。
根据另一方面，本发明提供靶向如SEQIDNO: 3所述的核苦酸序列或其互补链的区域的反义寡核苷酸序列，其中所述反义寡核香酸序列能够与所述核苷酸序列或其互补链的区域特异性杂交，从而抑制GA 2-氧化酶的表达。
根据一些实施方案，所述核苷酸序列的区域选自由5'-非翻译区、编码区、终止密码子区和3'-非翻译区组成的组。根据某些实施方案，所述反义
寡核苷酸序列包含至少20个核苷酸。应理解，所述寡核苷酸序列可由长达500个核香酸组成。
根据进一步的实施方案，所述反义寡核苷酸序列包含至少一个修饰的核苷酸间键合。可选地，所述寡核苷酸序列包含至少一个修饰的糖。优选
地，所述寡核苷酸序列连接至植物启动子，其中所述^i物启动子可操作地
连接至所述反义寡核苷酸序列。
根据进一步的方面，本发明提供编码核酶的核苷酸序列，所述核酶能
够特异性切割由包含如SEQ ID NO: 1所述的核苷酸序列的核酸分子转录的RNA序列。
根据另一方面，本发明提供用本发明双链RNA;或用本发明DNA构建体；或用本发明反义寡核苷酸序列；或用本发明编码核酶的核苷酸序列转化的植物细胞，其中GA 2-氧化酶基因的表达被下调。根据一个实施方案，所述植物细胞是红麻植物细胞。
根据进一步的方面，本发明提供包含至少一个用本发明双链RNA;或用本发明用于产生RNA的DNA构建体；或用本发明反义寡核苷酸序列；或用本发明编码核酶的核苷酸序列转化的细胞的转基因植物，其中GA 2-氧化酶基因的表达被下调。根据一个实施方案，所述转基因植物是红麻植物。
根据进一步的方面，本发明提供根据本发明原理的转基因植物的种子。根据一个实施方案，所述转基因植物的种子是转基因红麻植物的种子。
根据另一方面，本发明提供根据本发明原理的转基因植物的茎。根据一个实施方案，所述转基因植物的茎是转基因红麻植物的茎。
根据进一步的方面，本发明提供通过下调GA 2-氧化酶生产具有降低的GA 2-氧化酶基因表达的转基因植物的方法，所述方法包括将包含可操作地连接至编码RNA序列的多核苷酸序列的植物启动子的DNA构建体导入至少一个植物细胞，所述多核苷酸序列包含
(i) 包含与编码所述植物GA 2-氧化酶的核酸分子或其片段具有至少90%序列同一性的至少20个连续核苷酸的第一个核苷酸序列；和
(ii) 包含与编码所述植物GA 2-氧化酶的核酸分子的互补序列或其片段具有至少90%序列同一性的至少20个连续核苷酸的第二个核香酸序列，
其中所述DNA构建体转录的RNA分子下调所述GA 2-氧化酶基因
的表达。
根据一些实施方案，所述转基因植物选自由被子植物家族和棵子植物家族组成的组。根据进一步的实施方案，所述转基因植物选自由木槿属(Hibiscus sp.)、片勿属(Populus sp.)、桉属(Eucalyptus sp.)、向曰葵属(Helianthussp.)、黄麻属(Corchorus sp.)和苎麻属(Boehemiera sp.)组成的组。冲艮据进一步的实施方案，所述转基因植物选自由红麻、向日葵(/^//朋^^ a朋m/s L.，sunflower)、 赤斗会(五wc"/z)^ms cama/dw/ew57X)、 大麻(C"m"aZ)^ sa"va L.)、 黄麻(Co r/2ontf o/Ztohzw L.)和苎麻C8oe/ eme"力m'vea L.)纟且成的纟且。才艮氺居某个实施方案，所述转基因植物是红麻植物。根据其它的实施方案，如果所述转基因植物是红麻植物，则所述DNA构建体符合本发明原理。
根据其它的实施方案，如果所述转基因植物是拟南芥，则所述第一个核苷酸序列与如SEQ 1DNO:35所述的核苷酸序列或其片段具有至少90%序列同一性，并且所述第二个核苷酸序列与如SEQIDNO: 39所述的核苷酸序列或其片段具有至少90%序列同一性。根据进一步的实施方案，如果所述转基因植物是烟草，则所迷第一个核苷酸序列与如SEQ ID NO: 36所述的核苷酸序列或其片段具有至少90%序列同一性，并且所述第二个核苷酸序列与如SEQ ID NO: 40所述的核苷酸序列或其片段具有至少90%序列同一性。根据进一步的实施方案，如果所述植物是番茄，则所述第一个核苷酸序列与如SEQ ID NO: 37所述的核苷酸序列或其片段具有至少90%序列同 一性，并且所述笫二个核苷酸序列与如SEQ ID NO: 41所述的核苷酸序列或其片段具有至少90%序列同一性。
17根据进一步的方面，本发明提供通过下调GA 2-氧化酶生产具有降低的GA 2-氧化酶基因表达的转基因植物的方法，所述方法包括向至少一个植物细胞导入本发明双链RNA;或本发明反义寡核苷酸序列；或本发明编码核酶的核香酸序列，从而生产具有比非转基因植物更高的赤霉素水平和更低的GA 2-氧化酶基因表达水平的转基因植物。根据一些实施方案，所述生产转基因植物的方法进一 步包括向所述转基因植物导入有效增加纤维量的赤霉素或/和生长素的步骤。根据其它的实施方案，所述生产转基因植物的方法进一步包括向至少一个植物细胞导入编码赤霉素20-氧化酶的核酸分子的步骤。根据一个实施方案，所述转基因植物是红麻。
根据一些实施方案，引入本发明双链RNA;或本发明DNA构建体；或本发明反义寡核苷酸序列；或本发明编码核酶的核苷酸序列是通过选自下述组的方法执行的农杆菌04gra/^ctehMW)介导的转化、基因枪法(microprojectile bombardment )、花4分介导的转化、才直物RNA病毒介导的转化、脂质体介导的转化、直接基因转移和致密胚性愈伤组织的电穿孔。
根据进一步方面，本发明提供增加植物纤维产量的方法，所述方法包括向至少一个植物细胞导入包含可操作地连接至编码RNA序列的多核苷酸序列的植物启动子的DNA构建体，所述多核苷酸序列包含
(i) 包含与编码所述植物GA 2-氧化酶的核酸分子或其片段具有至少90。/。序列同一性的至少20个连续核苷酸的第一个核苷酸序列，和
(ii) 包含与编码所述植物GA 2-氧化酶的核酸分子的互补序列或其片段具有至少90%序列同一性的至少20个连续核苷酸的第二个核苷酸序列，
其中所述DNA构建体转录的RNA下调GA2-氧化酶基因的表达。
根据一些实施方案，所述第一个(fist)核苷酸序列与编码所述GA 2-氧化酶的核酸分子或其片段具有至少95%、可选地100%序列同一性。根据其它的实施方案，所述第二个核苷酸序列与编码所述GA 2-氧化酶的核酸分子的互补序列或其片段具有至少95%、可选地100%序列同一性或100%
18同源性。
根据进一步的实施方案，所述植物选自由被子植物家族和棵子植物家族组成的组。根据其它的实施方案，所述被子植物家族包括但不限于木槿属、杨属、桉属、向日葵属、黄麻属和苎麻属。根据其它的实施方案，所述植物选自由红麻、向日葵、赤桉、大麻、黄麻和苎麻组成的组。根据某个实施方案，所述植物是红麻植物。根据其它的实施方案，如果所述转基
因植物是红麻植物，则所述DNA构建体符合本发明原理。
根据其它的实施方案，如果所述转基因植物是拟南芥，则所述第一个
核香酸序列与如SEQ IDNO:35所述的核苷酸序列或其片段具有至少90%序列同一性，并且所述第二个核苷酸序列与如SEQIDNO: 39所述的核苷酸序列或其片段具有至少90%序列同一性。根据进一步的实施方案，如果所述转基因植物是烟草，则所述第一个核苷酸序列与如SEQ ID NO: 36所述的核苷酸序列或其片段具有至少90%序列同一性，并且所述第二个核苷酸序列与如SEQ ID NO: 40所述的核苷酸序列或其片段具有至少90%序列同一性。根据进一步的实施方案，如果所述植物是番茄，则所述第一个核苷酸序列与如SEQ ID NO: 37所述的核香酸序列或其片段具有至少90%序列同一性，所述第二个核苷酸序列与如SEQIDNO: 41所述的核苷酸序列或其片段具有至少90%序列同一性。
根据另一方面，本发明提供包含分离的包含如SEQIDNO: 1所述的编码红麻GA 2-氧化酶核普酸序列、或其互补链或同源序列的核酸分子的表达载体，其中所述同源序列与SEQIDNO: 1具有至少80%序列同一性。根据一些实施方案，所述表达载体内的同源序列与SEQIDNO: 1具有至少90%、可选地至少95%、可选地100%序列同一性。根据某个实施方案，所述表达载体包含分离的具有如SEQ TD NO: 1所述的编码红麻GA 2-氧化酶的核苷酸序列的核酸分子。
根据进一步的方面，本发明提供过表达红麻GA 2-氧化酶基因的植物细胞，所述植物细胞用包含分离的包含如SEQ ID NO: 1所述的编码红麻GA2-氧化酶的核普酸序列、或其互补链或同源序列的核酸分子的表达载体进行转化，其中所述同源序列与SEQIDNO: 1具有至少80%序列同一性。根据一些实施方案，所述表达载体内的同源序列与SEQIDNO: 1具有至 少90%、可选地至少95%、可选地100%序列同一性。根据某个实施方案， 所述植物细胞用包含分离的包含如SEQ ID NO: 1所述的编码红麻GA 2-氧化酶的核普酸序列的核酸分子的表达载体进行转化。根据一个实施方 案，所迷植物细胞是红麻植物细胞。
根据进一步的方面，本发明提供包含至少 一个用包含分离的包含如 SEQ ID NO: 1所述的编码红麻GA2-氧化酶的核苷酸序列、或其互补链或 同源序列的核酸分子的表达载体转化的植物细胞的转基因植物，其中所述 同源序列与SEQ ID NO: 1具有至少80%序列同一性。根据一些实施方案， 所述同源序列与SEQIDNO: 1具有至少90%、可选地至少95%、可选地 100%序列同一性。根据某个实施方案，所述转基因植物包含至少一个用包 含分离的包含如SEQ ID NO: 1所述的编码红麻GA 2-氧化酶的核苷酸序 列的核酸分子的表达载体转化的植物细胞。根据一个实施方案，所述转基 因植物是红麻植物。
根据另一方面，本发明提供生产过表达红麻GA 2-氧化酶的转基因植 物的方法，所述方法包括向植物的至少 一个细胞导入包含分离的包含如 SEQ ID NO: 1所述的编码红麻GA2-氧化酶的核芬酸序列、或其互补链或 同源序列的核酸分子的表达载体，其中所述同源序列与SEQIDNO: l具 有至少80%、可选地至少90%、可选地至少95%、可选地100%序列同一 性，进而生产赤霉素(GA)水平低于非转基因植物的转基因植物。根据某个 实施方案，所述生产转基因植物的方法包括向至少一个细胞导入包含分离 的包含如SEQ ID NO: 1所述的编码红麻GA 2-氧化酶的核苷酸序列的核 酸分子的表达载体的步骤。根据一个实施方案，所述转基因植物是红麻植 物。
根据下面的图、说明、实施例和权利要求将能更好地理解本发明的这 些和其它实施方案。
附图简述
20
图1A-B显示在长日或短日条件下生长的拟南芥植物的照片。
图1A显 示在长日条件下生长的拟南芥植物；左野生型(wt)对照；中转基因过 表达GA 20-氧化酶的植物；右转基因沉默GA 2-氧化酶的植物。
图1B 显示在短日条件下生长的拟南芥植物。左wt对照；右转基因过表达 GA 20-氧化酶的拟南芥。
图2显示野生型和转基因拟南芥植物的茎的横切片(cross section)。在 转基因过表达GA 20-氧化酶的植物中，观察到维管束中和维管束之间的纤 维细胞数增加，以及纤维细胞壁木质化的降低。
图3显示烟草植物的照片。显示了野生型烟草植物和转基因过表达GA 20-氧化酶的植物。
图4A-C显示野生型和转基因GA20-氧化酶植物的茎的横切片。过表 达GA-20氧化酶的植物的内层韧皮部岛含有纤维(图4A和4B)，而wt植 物的节间则未观察到纤维(图4C)。
图5A-C显示野生型和GA 2-氧化酶沉默的烟草植物的照片。左转 基因沉默GA2-氧化酶的植物；右野生型植物。转基因沉默GA2-氧化酶 的植物长于野生型植物。
图6A-B显示GA 2-氧化酶沉默的抹系与wt对照之间的比较。图6A 显示GA2-氧化酶沉默的林系与wt对照之间平均节间数、最长叶的平均长 度和平均高度的比较。图6B显示每种GA 2-氧化酶沉默植物和wt植物的 平均、最短和最长高度(厘米)。
图7显示红麻GA 2-氧化酶的基因组序列。
图8显示编码红麻GA 2-氧化酶的cDNA的核苷酸序列和该酶的氨基 酸序列。
优选实施方案详述 定义
术语"基因"指编码肽、多肽、蛋白质或RNA分子的染色体DNA、
21质粒DNA、 cDNA、合成DNA或其它DNA，和所述编码序列侧翼参与表 达调节的区域。
术语"核酸"指脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。所述核酸可 以是单、双或多链，并可包含修饰或未修饰的核苷酸。
术语"植物"在本文使用其最广泛的涵义。它包括但不限于木本、草 本、多年生或一年生植物的任何物种。它还指主要分化为植物发育的任何 阶段存在的结构的多个植物细胞。所述结构包括但不限于根、茎、芽、 叶、花、花瓣、果实等。
术语"杂交"指核酸链通过碱基配对与互补链结合的能力。当两个核 酸链中的互补序列彼此结合时，即发生杂交。
如本文所用，当用于核酸序列时，术语"同源性"指至少两个核普酸 序列之间的相似性或同一性程度。可能存在部分同源性或完全同源性(即， 同一性)。"序列同一性"指两个或多个核苷酸序列之间相关性的量度，表 示为占总比较长度的百分比。同一性计算考虑那些一致的和位于各自序列 同一相对位置的核苷酸残基。缺口，即比对中残基存在于一个序列而不存 在于另一序列的位置，被认为是具有不同残基的位置。 一个广泛使用和接 受的用来执行序列比对的计算机程序是CLUSTALW 1.6版(Thompson等. Nucl. Acids Res.， 22: 4673-4680， 1994)。相似地，当用于蛋白质序列时， 术语"同源性"指至少两个蛋白质序列之间的相似性或同一性程度。可能 存在部分同源性或完全同源性(即，同一性)。
术语"启动子"或"启动子区"指通常发现于编码序列上游(5')的核酸 序列，其通过为RNA聚合酶和/或在正确位点起始转录所必需的其它因子 提供识别位点控制信使RNA(mRNA)的产生，进而控制所述编码序列的表 达。如本文所预期，启动子或启动子区包括通过连接至各种调节序列、随 机或控制的诱变和增强子序列的添加或复制产生的启动子的变体。当作为 合适的重组载体的一部分导入宿主时，本文公开的启动子区和其生物功能 同等物负责驱动处于其控制的编码序列的转录，这可通过其产生mRNA的 能力证明。术语"DNA构建体"或"表达载体"指产生自任何来源的，能够进行
基因组整合或自主复制的、包含其中已以功能上可操作方式连接了一个或
多个DNA序列的DNA分子的任何物质，如质粒、粘粒、病毒、自主复制 序列、噬菌体或线状或环状单链或双链DNA或RNA核苷酸序列。所述 DNA构建体或载体能够将5'调节序列或启动子区和所选基因产物的DNA 序列导入细胞，其导入方式能使所述DNA序列转录成有功能的mRNA， 所述mRNA被翻译，从而进行表达。DNA构建体或表达载体可构建为能 够表达双链RNA或反义RNA，以抑制所关注的特定RNA的翻译。
术语"异源基因，，指编码不在其天然环境的(即，已被人为改变的)多 肽或蛋白质的基因。例如，异源基因包括来自一个物种而被导入另一物种 的基因。异源基因还包括生物体本身的以某种方式改变(例如，突变、以多 个拷贝加入、连接至非天然启动子或增强子序列等)的基因。异源基因可包 含包含植物基因的cDNA形式的植物基因序列；所述cDNA序列可以正 义(产生mRNA)或反义方向(产生与所述mRNA转录物互补的反义RNA转 录物)表达。
当用于植物或果实或种子时，术语"转基因"(即，"转基因植物"或 "转基因果实，，或"转基因种子")指在其一个或多个细胞中含有至少一个 异源基因的植物或果实或种子。
术语"反义寡核苷酸"指通过RNA-RNA或RNA-DNA或RNA-PNA(蛋 白质核酸)相互作用与靶RNA结合，并改变所述靶RNA的活性的寡核香 酸(有关综述，参见Stein和Cheng， 1993 Science 261， 1004)。典型地，反 义分子与靶序列在所述反义分子的一段连续序列上互补。但是，在某些实 施方案中，反义寡核苷酸可与两个(或甚至多个)不连续靶序列互补。
术语"转化"指外源核酸序列(例如，载体、表达载体)导入细胞或原 生质体的过程，在所述细胞或原生质体中，所述外源核酸掺入染色体或能 够自主复制。
术语"再生"指从植物细胞(例如，植物原生质体或外植体)培养植物 的过程。术语"基因表达"指基因内编码的遗传信息通过所述基因的"转录"
(即，通过RNA聚合酶的酶促作用)转化为RNA(例如，mRNA 、 rRNA、 tRNA 或snRNA)，和通过mRNA的"翻译"转化为蛋白质的过程。基因表达可 在所述过程的许多阶段被调节。"上调"或"激活"指增加基因表达产物(即， RNA或蛋白质)的产生的调节，而"下调"或"抑制"指降低基因表达产 物(即，RNA或蛋白质)的产生的调节。参与上调或下调的分子(例如，转录 因子)通常分别被称为"激活子"和"抑制子"。
术语"片段"指分别是全长核酸分子或全长蛋白质的一部分的多核苷 酸或多肽。
如本文所用，术语"类似物"指包含通过氨基酸置换、添加或化学修 饰改变的SEQTDNO: 2红麻GA2-氧化酶的序列的蛋白质。通过使用"氨 基酸置换"，即表明将序列内的残基置换为具有相同功能的氨基酸残基， 造成沉默变化。例如，所述序列内的一个或多个氨基酸残基可被置换为具 有相似极性的另一氨基酸，所述另一氨基酸充当功能同等物，造成沉默变 化。此类置换被称为保守置换。此外，只要所述类似物的酶促活性得到保 留(如果与完整红麻GA2-氧化酶的活性相比)，也可进行非保守置换。
本发明提供如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所述的红麻GA 2-氧 化酶的cDNA和氨基酸序列(图8)。本发明进一步提供如SEQ ID NO: 3 所迷的红麻GA2-氧化酶的基因组序列(图7)和如SEQ ID NO: 4所述的用 于沉默GA2-氧化酶表达的DNA序列。
本发明提供包含所关注的核酸的DNA构建体或表达载体，其可进一 步包含植物启动子。
文献中已经描述了许多在植物细胞中具有活性的启动子。这些启动子 包括胭脂碱合成酶(NOS)启动子(Ebert等，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 5745-5749, 1987)、章鱼碱合成酶(OCS)启动子、花椰菜花叶病毒启动子如 花椰菜花叶病毒(CaMV) 19S启动子(Lawton等，Plant Mol. Biol. 9: 315-324， 1987)和CaMV35S启动子(Odell等，Nature 313: 810-812, 1985)、玄参花 叶病毒35S-启动子；来自核酮糖-l,5-二磷酸羧化酶小亚基(ssRUBISCO)的 光诱导型启动子、Adh启动子(Walker等，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:
246624-6628, 1987)、蔗糖合成酶启动子(Yang等，Proc. Natl. Acad. Sd. USA. 87: 4144-4148， 1990)、 R基因复合体启动子(Chandler等，The Plant Celll: 1175-1183， 1989)和叶绿素ap结合蛋白基因启动子和类似启动子。这些启 动子已用于构建在植物中表达的DNA构建体。
为了在所述植物的源组织如叶、种子、根或茎中进行表达，优选的是，
本发明使用的启动子在这些特异性组织中具有相对高的表达。为此，可以 从许多具有组织或细胞特异性或增强型表达的基因启动子中进行选择。文
献中已报道的所述启动子的实例包括豌豆叶绿体谷氨酰胺合成酶GS2启 动子(Edwards等，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 3459-3463， 1990)、小 麦叶绿体果糖-l,6-二磷酸酶(FBP酶)启动子(Lloyd等，Mol. Gen. Genet. 225: 209-216， 1991)、马铃薯核光合成ST-LS1启动子(Stockhaus等，EMBO 丄8: 2445-2451， 1989)、拟南芥丝氨酸/苏氨酸激酶(PAL)启动子和葡糖淀 粉酶(CHS)启动子。
特异性启动子的表达可通过使用克隆在所述启动子的下游并瞬时或 稳定转化至植物细胞的报告基因进行监控，所述报告基因如(3-葡糖醛酸糖 苷酶(Jefferson等，E廳OJ. 6: 3901-3907， 1987)、萸光素酶(LUC， Ow等， Science 234: 856-859， 1986)、绿色荧光蛋白(GFP， Sheen等，Plant J. 8: 777-784， 1995)或任何其他报告基因。报告基因活性的检测指示所述启动 子在组织内的转录活性。
所述DNA构建体或载体还可包括与所关注的编码区一起的，完全或 部分作用以终止所述区域的转录的核酸序列。例如，已分离的此类序列包 括Tr7 3'序列和NOS 3'序列(Ingelbrecht等，The Plant Cell 1: 671-680， 1989; Bevan等，NucleicAcidsRes.il: 369-385, 1983)或类似序列。
所述DNA构建体或栽体还可包括调节元件。所述调节元件的实例包 括Adh内含子1 (Callis等，Genes and Develop. 1: 1183-1200， 1987)、蔗 糖合成酶内含子(Vasil等，Plant Physiol. 91: 1575-1579， 1989)、玉米hsp70 基因的第 一个内含子(第5,362,865号美国专利)和TMV Q元件(Gallie等， The Plant Celll: 301-311， 1989)。适当时可包括这些和其它调节元件。
所述DNA构建体或载体还可包括可选择的标记。可选择的标记可用
25于选择含有外源遗传物质的植物或植物细胞。所述可选择的标记的实例包
括编码卡那霉素抗性，并可使用卡那霉素G418进行选择的neo基因 (Potrykus等，Mol. Gen. Genet. 199: 183-188, 1985);编码双丙氨磷抗性 的bar基因；编码草甘膦抗性的突变的EPSP合成酶基因；赋予溴苯腈抗 性的腈水解酶基因(Stalker等，J. Biol. Chem. 263: 6310-6314、 1988);和 抗甲氨蝶呤的DHFR基因(Thillet等，J. Biol. Chem. 263: 12500-12508， 1988)。
所述DNA构建体或表达载体还可包括翻译增强子。DNA构建体可包 含一个或多个5'非翻译的先导序列，其可增强所述基因产物从得到的 mRNA转录物的表达。所述序列可获自病毒RNA、合适的真核基因或合 成基因序列和类似序列。
植物转化
本发明DNA构建体可用于稳定或瞬时转化植物细胞。在稳定转化中， 所述核酸分子整合至植物基因组，如此其代表稳定的和遗传的性状。在瞬 时转化中，所述核酸分子在转化的细胞中表达，但其不整合至基因组，如 此其代表瞬时性状。
外源DNA稳定整合至植物基因组DNA的主要方法包括(i)农杆菌介 导的基因转移(参见例如Klee等(1987). Annu Rev Plant Physiol 3S， 467-486; 和Gatenby, A. A. Plant Biotechnology,第93-112页(1989) S. Kung和C. J. Arntzen编，Butterworth Publishers, Boston, Mass);禾口(ii)直4妄DNA 4争牙多， 包括微注射、电穿孔和基因枪法(U.S. 6,723,897和其中的参考文献，其通 过引用结合入本文，如同完全在本文中进行描述一样)。
农杆菌介导的转移是一种广泛适用的将基因导入植物细胞的系统，原 因是DNA可以导入完整的植物组织，从而无需从原生质体再生完整植物。 农杆菌介导的系统包括使用含有确定的整合至植物基因组DNA的DNA区 段的质粒载体。接种植物组织的方法因植物物种和农杆菌递送系统而有所 不同。 一种广泛使用的方法是叶盘法，其可使用任何组织的外植体执行， 为启动完整植物的分化提供了良好来源。 一种补充方法将农杆菌递送系统 与真空渗透结合使用。农杆菌系统特别适合用于生成转基因双子叶植物。在电穿孔中，原生质体短暂接受强电场，打开微孔以允许DNA进入。
在微注射中，则使用微吸管将DNA直接机械注入细胞。在基因枪法中， DNA被吸附至微射弹(microprojectile)如硫酸镁晶体或钨颗粒，然后所述微 射弹;故物理加速至细胞或植物组织。
稳定转化之后，植物即进行繁殖。植物繁殖最普通的方法是通过种子。 但是，通过种子繁殖进行再生的缺点是由于杂合性而使作物不一致，因为 植物是根据孟德尔原则的遗传变异产生种子的。换言之，每粒种子在遗传 上都是不同的，每粒种子将按其自身的特异性性状生长。因此，优选的再 生应使再生的植物与亲本转基因植物具有同 一的性状和特性。再生转化植 物的优选方法是微繁殖，该方法提供快速、 一致的转化植物繁殖。
养二代植物的过程。此过程允许大量繁殖具有优选的组织和表达融合蛋白 的植物。新生的植物与原始植物在遗传上相同并具有所述原始植物的全部 特性。微繁殖允许在短时间内大量生产优质植物材料，快速增殖所选的栽 培植物并保留原始转基因或转化植物的特性。此植物克隆方法的优点包括 植物增殖的速度和产生的植物的质量和一致性。
微繁殖是需要改变不同阶段的培养基或生长条件的多阶段程序。微繁 殖过程包括四个基本的阶段阶段一，初始组织培养；阶段二，组织培养 物增殖；阶段三，分化和植物形成；和阶段四，温室培养和锻炼。阶段一 建立组织培养并鉴定无污染物。阶段二增殖初始组织培养物，直至产生符 合生产目标的足够数量的组织样品。阶段三切割新生的组织样品并将其培 养成独立的小植物。阶段四将转化的小植物转移至温室进行锻炼，其中植 物对光的耐受性逐渐增加，以便它们可以在自然环境下继续生长。
虽然目前优选稳定的转化，但是本发明也正视，例如叶细胞、分生组 织细胞或完整植物的瞬时转化。
瞬时转化可通过上述任何直接DNA转移方法或使用改良的植物病毒 通过病毒感染实现。
已显示可用于转化植物宿主的病毒包括花椰菜花叶病毒(CaMV)、烟草花叶病毒(TMV)和杆状病毒(BV)。使用植物病毒的植物转化参见，例如，
Communications in Molecular Biology: Viral Vectors (分子生物学通讯病毒 载体)，Cold Spring Harbor Laboratory, New York,第172-189页。
构建植物RNA病毒以在植物中导入和表达非病毒外源核酸序列在本 领域为已知，并参见上述参考文献以及Dawson等(1989) Virology 〃么 285-292。
如果转化病毒是DNA病毒，本领域技术人员可对所述病毒本身进行 合适的修饰。可选地，所述病毒可首先克隆至细菌质粒以便构建需要的含 有外来DNA的病毒载体。然后可将病毒从所述质粒上切下。如果所述病 毒是DNA病毒，则可将细菌复制起点连接至所述病毒DNA,然后细菌可 复制所述病毒DNA。所述DNA的转录和翻译将产生包壳所述病毒DNA 的外壳蛋白。如果所述病毒是RNA病毒，所述病毒一般以cDNA克隆和 插入到质粒。然后使用所述质粒制备所有的植物基因构建体。然后从所述 质粒的病毒序列转录所述RNA病毒，然后翻译所述病毒基因以产生包壳 所述病毒RNA的外壳蛋白。
已使用基于磷酸钙沉淀、聚乙二醇处理、电穿孔和这些处理的组合的 方法报告了植物原生质体的转化(参见，例如，Marcotte等，Nature 335: 454-457, 1988)。
从单个植物原生质体转化子或从各种转化外植体再生、发育和培养植 物在本领域为公知。此再生和生长过程典型地包括如下步骤选择转化的 细胞，将所述各个独立的细胞经胚胎发育的通常阶段、经小植物生根阶段 进行培养。转基因胚胎和种子的再生方式相似。然后将得到的转基因生根 芽种植于适当的植物生长培养基如土壤。
含有编码感兴趣的蛋白质的外来的、外源基因的植物的发育或再生在 本领域为公知。优选地，所述再生植物进行自花授粉，以提供纯合的转基 因植物。否则，将获自所述再生植物的花粉与农艺学重要系的实生植物杂 交。相反地，用这些重要系的植物的花粉对所述再生植物授粉。使用本领 域技术人员公知的方法培育本发明含有所需多肽的转基因植物。
28沉默GA 2-氧化酶的表达
可使用各种干扰转录和/或翻译的分子(例如，反义、siRNA、核酶或 DNA核酶)在基因組和/或转录物水平实现GA2-氧化酶的沉默。
一种能够下调或沉默GA 2-氧化酶的物质是RNA千扰(RNAi)过程中 的小干扰RNA (siRNA)分子。RNAi是一个两步骤过程。在第一个起始步 骤中，输入的双链(dsRNA)被消化为21-至23-核苷酸(nt)的小干扰RNA (siRNA)，这很可能是通过dsRNA-特异性核糖核酸酶RNA酶III家族成员 Dicer的作用，其以依赖ATP的方式加工(切割)dsRNA(直接或通过转基因 或病毒引入)。连续的切割事件将所述RNA降解为19-至21-bp的双链体 (siRNA)，每个双链体均具有2个核苷酸的3'突出端。
在第二个步骤(称为效应步骤)中，所述siRNA双链体与核酸酶复合 体结合形成RNA诱导的沉默复合体(RISC)。 RISC的激活需要所述siRNA 双链体依赖ATP的解旋。活性RISC然后通过碱基配对相互作用靶向同源 转录物并从所述siRNA的3'端将所述mRNA切割成12个核苷酸的片段。 虽然切割的机制仍未得到阐明，但是研究表明每个RISC均含有一个siRNA 和RNA酶。
由于RNAi非凡的力量，因此推测所述RNAi途径中存在扩增步骤。 扩增可通过复制所述输入dsRNA生产更多siRNA，或通过复制形成的 siRNA发生。可选地或附加地，扩增可通过^L大RISC的周转事件实现。 有关RNAi的更多信息，参见下列综述Cullen, B. R. (2002). RNA interference: antiviral defense and genetic tool (RNA干扰抗病毒防御和遗 传工具).Nat Immunol 3， 597-599;和Brantl, S. (2002). Antisense隱RNA regulation and RNA interference (反义RNA调节和RNA干扰).Biochim Biophys Acta 1575, 15-25。
适合用于本发明的RNAi分子的合成可按下述方法实现。首先，在GA 2-氧化酶mRNA序列AUG起始密码子下游扫描AA-双核苷酸序列。将出 现的每个AA和19个3'-邻近的核苷酸记录为潜在的siRNA耙位点。优选 地，siRNA耙位点选自开放阅读框(ORF)，因为非翻译区(UTR)更富含调节 蛋白结合位点。UTR-结合蛋白和/或翻译起始复合体可干扰siRNA内切核
29酸酶复合体的结合(Tusch1(2001))。但是，应理解，靶向非翻译区的siRNA 也可有效，这得到了 GAPDH的证实，其中靶向5' UTR的siRNA介导细 胞GAPDH mRNA下降约90%并完全消除了蛋白质水平。
第二，使用任何序列比对软件将潜在的靶位点与适当的基因组数据库 进行比较，所述序列比对软件如可获自NCBI服务器的BlastN软件 (www.ncbi.nhn.nih.gov/BLAST/)。过滤掉与其它编码序列具有显著同源性 的假定靶位点。
选择合格的耙序列作为siRNA合成的模板。优选的序列是包含低G/C 含量的序列，因为已证明与包含高于55%的G/C含量的序列相比，这些序 列可更有效地介导基因沉默。优选沿所述耙基因长度选择几个靶位点以供 评估。为了更好地评估所选的siRNA，优选同时使用阴性对照。阴性对照 siRNA优选地包括与所述siRNA相同的核苷酸组成，但是与基因组缺乏显 著的同源性。因此，优选地使用合成的siRNA核苷酸序列，条件是其未显 示出与任何其它基因具有任何显著的同源性。
本发明提供设计用于产生靶向红麻GA 2-氧化酶的siRNA的DNA构 建体。根据一个实施方案，所述DNA构建体包含
(a) 至少 一个可操作地连接至的植物启动子；
(b) 编码形成双链RNA的RNA序列的多核苷酸序列，其中所述多 核苷酸序列包含与所述GA2-氧化酶的正义核苷酸序列或其片 段具有至少90%序列同一性的至少20个连续核苷酸的第一个核 苷酸序列，和与所述GA2-氧化酶的正义核苷酸序列的互补序列 或其片段具有至少90%序列同一性的至少20个连续核香酸的第 二个核香酸序列；和任选地
(c) 转录终止信号。
根据一些实施方案，本发明所述的DNA构建体设计为表达茎环RNA， 其除了所述第一个(正义)和所述第二个(反义)核苷酸序列外，还进一步包含 间隔子多核苷酸序列，所述间隔子多核苷酸序列位于编码所述第一个和所 述第二个核苷酸序列的DNA区域之间。所述间隔子多核苷酸序列的长度可根据所述茎环RNA的特异性结构而有所不同。典型地，所述间隔子长
度与所述第一个和第二个核苷酸序列长度的比值在1:5至1:10范围内。
根据另一个实施方案，设计用于生产靶向红麻GA 2-氧化酶的siRNA的DNA构建体包含
(a) 至少 一个可操作地连接至的植物启动子；
(b) 编码以茎环形式形成双链RNA的RNA序列的多核苷酸序列，其中所述双链RNA包含与所述GA 2-氧化酶的正义核苷酸序列或其片段具有至少90%序列同一性的至少20个连续核苷酸的第一个核苷酸序列；与所述GA2-氧化酶的正义核苷酸序列的互补序列或其片段具有至少卯％同一性的至少20个连续核苷酸的第二个核苷酸序列；
(c) 连"t妄所述第一个和第二个核苷酸序列的间隔子序列；和任选地，
(d) 转录终止信号。
根据一个实施方案，所述间隔子包含产生自本领域已知的基因内含子的核苷酸序列，以增强siRNA的产生。
本发明双链RNA的第 一个和第二个核苷酸序列可以是所述GA 2-氧化酶基因的片段，可以是全长基因、非编码区或其部分或其组合。
如本文所用，RNA分子的核苷酸序列可通过参考序列表的DNA核苷酸序列鉴定。但是，本领域技术人员应理解，所指是RNA还是DNA取决于上下文。此外，除T-碱基在RNA分子中被置换为尿嘧啶(U)外，所述核普酸序列是相同的。
根据某些实施方案，设计用于生产靶向GA2-氧化酶的siRNA或其片段的DNA构建体、所述DNA构建体的第二个(反义)核苷酸序列的长度主要由所述第 一个(正义)核苷酸序列的长度确定，并可与后一序列的长度相符。但是，可以使用长度具有约10%差异的反义序列。
设计用于生产siRNA的DNA构建体的第一个和第二个核苷酸序列可以是任何长度，只要所述序列包含至少20个连续核苷酸。因此，所述第一个和所述第二个核普酸序列可包含GA 2-氧化酶基因的片段或全长的GA2-氧化酶基因。根据一些实施方案，所述核苷酸序列的长度是20个核苷酸至1,200个核苷酸。
根据一个实施方案，本发明DNA构建体产生的siRNA的目标是沉默GA 2-氧化酶基因的片4殳，包括GA 2-氧化酶的编码区。
根据一个优选的实施方案，所述第一个核苷酸序列包含与SEQ 1DNO: 1所述核苷酸序列或其片段具有90%同一性、合适地95%或100%同一性的核普酸序列。根据某个实施方案，所述第一个核苷酸序列由如SEQID NO: 4所述的序列组成。
根据另一优选的实施方案，所述第二个核苷酸序列包含与如SEQ IDNO: 1所述的核酸分子的互补链或其片段具有90%同一性、合适地95%或100%同一性的核苷酸序列。根据某个实施方案，所述第二个核苷酸序列与如SEQ ID NO: 4所述的序列互补。
根据某些实施方案，所述第一个和所述第二个核苷酸序列可操作地连接至同一启动子。所转录的链至少是部分互补的，其能够形成dsRNA。根据其它的实施方案，所述第一个和所述第二个核苷酸序列转录为两个单独的链。当由此产生dsRNA时，待转录的DNA序列的侧翼具有两个启动子，一个控制所述第一个核苷酸序列的转录，而另一个控制所述第二个，即互补核苷酸序列的转录。这两个启动子可相同或不同。根据一个实施方案，所述第 一个和所述第二个核香酸序列可操作地连接至同 一启动子。
能够沉默GA 2-氧化酶的另一物质是能够特异性切割GA 2-氧化酶的mRNA转录物或DNA序列的DNA核酶分子。DNA核酶是能够同时切割单链和双链靶序列的单链多核苷酸(Breaker等(1995) Curr Biol 2, 655-660;Santoro等(1997) Proc Natl Acad Sci USA 94， 4262-4266)。已提出了 DNA核酶的通用才莫型("10-23"模型)。"10-23" DNA核酶具有15个脱氧核糖核苷酸的催化结构域，所述催化结构域侧翼是两个各自为7至9个脱氧核糖核普酸的底物识别结构域。此类DNA核酶可在噪呤:嘧啶连接点有效切割其底物RNA(有关DNA核酶的综述，参见Khachigian (2002) Curr OpinMolTher4, 119-121)。
32构建和扩增合成的、加工的识别单链和双链靶切割位点的DNA核酶
的实例参见第6,326,174号美国专利(Joyce等)。
沉默GA 2-氧化酶也可通过使用能够与编码所述GA 2-氧化酶的mRNA转录物特异性杂交的反义寡核苷酸来实现。
应理解，存在根据热力学周期鉴定与其靶mRNA具有最高预测结合亲和力的那些序列的算法，所述热力学周期同时考虑所述耙mRNA和所述寡核香酸的结构变化能量学(参见，例如，Walton等(l999) BiotechnolBioeng65， 1-9)。
此外，还公布了使用体外系统设计和预测特异性寡核苷酸的效力的几种方法(Matveeva等(1998). Nature Biotechnology 16, 1374-1375)。
因此，目前的共识是，如上所述，反义技术领域最近的发展导致了高度精确的反义设计算法和多种寡核苷酸递送系统的产生，使得普通的技术人员能够设计和实现适合下调基因序列的表达的反义方法，而无需执行过量试验和误差实验。
能够下调GA 2-氧化酶的另一物质是能够特异性切割编码GA 2-氧化酶的mRNA转录物的核酶分子。核酶越来越多地用于通过切割编码感兴趣的蛋白质的mRNA序列特异性地抑制基因表达(Welch等(1998) Curr OpinBiotechno19, 486-496)。可以设计切割任何特异性靶RNA的核酶，这使得核酶同时成为基础研究和治疗应用的宝贵工具。
调节细胞中GA 2-氧化酶基因的表达的另一方法是通过三链结构寡核苷酸(TFO)。近期的研究显示，可设计以序列特异性方式识别和结合双链螺旋DNA中的多聚噪呤或多聚嘧咬区域的TFO。这些识別原则列于Maher III等(1989) Science 245， 725-730; Cooney等(1988) Science 241，456-459)。寡核苷酸修饰(如引入嵌入剂和主链置换)和结合条件(例如，
p_tl ，口「t)丙"n乂叉)ET"7L1L^1貝7J丁凡/J艮丄fU ^S"'f王日3阁,1'早*于,7口吧^R，斤，口不稳定，最近显示，合成的寡核苷酸可以靶向特异性序列(有关近期的综述，
参见Seidman等(2003) J Clin Invest 112, 487-494)。
因此，可设计针对GA 2-氧化酶调节区域中的任何给定序列的三链结构序列。三链结构寡核苷酸优选地长至少19、更优选地25、更优选地30 或更多个核苷酸，最高为50个碱基对。
应理解，任何本发明所述沉默核苦酸序列可包含至少一个2'-糖修饰、 至少 一个核酸碱基修饰和/或至少 一个磷酸主链修饰。
基因表达的下调指靶基因(即，GA 2-氧化酶基因)的蛋白质和/或 mRNA产物水平的下降或缺失。下调的结果可通过检查所述细胞或植物的 外在特性或通过生物化学方法确认，所述生物化学方法如RNA溶液杂交、 核酸酶保护、Northern杂交、反转录、使用微阵列监控基因表达、抗体结 合、酶联免疫吸附分析(ELISA)、蛋白质印迹法、放射免疫测定(RIA)和荧 光激活细胞分析(fluorescence activated cell analysis, FACS)。对于细胞中 RNA介导的抑制，可使用其蛋白质产物易于测定的报告或药物抗性基因方 便地测定基因表达。
本发明公开的包含沉默核苷酸序列的转基因植物可用于生产纸、纺织 品、索、麻袋(sack)、木材、家具和类似物品的各种行业。
实施例
材料和方法 植物
拟南齐^4raZ),tfo/w7's (L.))Heynh. Columbia生态型
烟草(7V7co"a"a toksrc扁L.) samsun NN栽培变种
红麻-报6/scMs c""朋6/湖51 L Tainung 2栽培变种
农才干菌(y4groZx3cfen."ffl g/^de"5p菌才朱
GV3101 -用于转化红麻、拟南齐和烟草(Hellens等(2000) Trends Plant Sci 5: 446-451)。抗生素抗性利福平和庆大霉素。
细菌生长培养基
细菌生长培养基按前述方法配制(Sambrook等(1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual (分子克隆实验手册).Cold Spring Harbor:
34Cold Spring Harbor Laboratory Press)。对于固体培养基，添加1,5% w/v琼 脂。添加的抗生素终浓度为氨节青霉素]00叱/ml、卡那霉素50昭/ml (用 于细菌)和100-250 pg/ml(用于植物)、壮观霉素100貼/ml、利福平100昭/ml 和庆大霉素10(Vg/ml。
植物生长培养基
Murashige & Skoog - MS
每升4.4g MS #M0222 (Duchefa Biochemic B. V., The Netherlands)培养基和 15g蔗糖。使用IN KOH将pH调节至5.8。对于固体培养基，添加0.6% w/v 植物琼脂弁P 1001 (DuchefaBiochemicB.V., TheNetherlands)。添加的抗生素 (如果需要)终浓度为卡那霉素100-250貼/ml、潮霉素15貼/ml和G418 15 (xg/ml。
引物
引物序列(5，+3，)目标用途
CaMV35S 启动子末端CAAGACCCTTCCTCTATATAAG SEQ ID NO:5鉴定CAMV35S 启动子的存在
NOS i冬止子反向TTATCCTAGTTTGCGCGCTA SEC ID NO:6鉴定NOS终止子 的存在
M13 -20TGTAAAACGACGGCCAGT SE(3IDNO:7通用引物
35M13-21AACAGCTATGACCATGATTACG SE<3 ID NO:8
GM035S反向GCTCCTACAAATGCCATCA SE<) ID NO:9鉴定CAMV35S启动子 阳性转基因植物
GM035S正向GATAGTGGGATTGTGCGTCA SEQIDNO:IOAT-GA20Hope5'ATGGATCCTATGGCCGTAAGTTTCGTA ACAAC SEQIDNO:llpBinPlus克隆(Bamffl和 EcoRI)
AT-GA20Hope3，ACGAATTCGGTTAGATGGGTTTGGTGAGCCAA TCTG SEQIDNO:12AT-GA20Over5'GGTCTAGAATGGCCGTAAGTTTCGTAACAAC SEQIDNO:13pBIN-GFP克隆(XbaI)
AT-GA20Over3' -stopCCTCTAGAGATGGGTTTGGTGAGCC SE()IDNO:14AT-gA20Over3' +stopCCTCTAGATTAGATGGGTTTGGTGAGCC SE(JIDNO:]5ATGA2ClaKpnCCATCGATGGTACCCCTGAAAGTTCCCGGGCT TTTG SEQIDNO:16pKannibal克隆
ATGA2BamHI-EcoRICGGGATCCCGGAATTCCGCAATGGCGGTATTG TCTAAACC SE(3IDNO:17GA2TABAC正义 5，ACTCGAGAGATTOGATTTGGTGAGC SEQIDNO:18pKamiibal克隆
GA2TABAC反义AATCGATAACCTGCAATGAGTCACC SE(3IDNO:19GA2TABAC正义 35AGGTACCAACCTGCAATGAGTCACC SEQIDNO:20GA2TABAC反义 3，GTCTAGAAGATTGGATTTGGTGAGC SEQIDNO:215'红麻反义GATCGATGCAGAGTCACTCTGCTCGTCC SEQ ID NO:22pKaimibal克隆
3'红麻正义CGGTACCCCAGAGTCACTCTGCTCGTCC SEQ ID NO:235'红麻反义GTCTAGAGGTGATCAACCATGGGGTTCCC SEQ ID NO:243'红;眛正义CCTCGAGGGTGATCAACCATGGGGTTCCC SEQIDNO:25GA2红麻巢式GGGCAGCCCAAACCTTATGG SEQ ID NO:26红麻GA2-氧化酶基因的 巢式引物
GA2红麻5，ATGGTGTTATTATCAAAACCTGGAATTG SE(JIDNO:27红麻GA2-氧化酶基因的 引物
GA2红麻3'GCCTAAAAGATAGAGAGATTATGAGGCAGC SE(J IDNO:28反向1红麻 GA2CCATGGGAACCCCATGGTTGATCAC SE(JIDNO:29反向PCR分离红麻 GA2-氧化酶的引物
反向2红麻 GA2GCGGCAAAGAGAAGAACTCGGTGGC SE( IDNO:30反向3红麻 GA2CAGGCTGAACCATTACCCTCCATGCCC SEQID戮31反1S7 4 EL淋 GA2CuAuAA i j i uA丄i utvjA 111 uuuuAvi。 SEQBDNO:32红麻简并5'TGYGARGARTTYGGYTTYTTYAARG SECJIDNO:33分离红麻GA2-氧化酶的 简并引物 5'有256个置换 3'有512个置换
红麻简并3'GGRTCDGTRTGYTCNCGRAANCC SEC ID NO:3436分子程序
标准DNA分子技术根据Sambrook等(如上)和Ausubel等(Protocols in Molecular Biology (分子生物学方案).(1987) New York, NY: John Wiley 和Sons)进行。
质粒DNA制备
根据Alkaline Lysis Miniprep (碱性裂解小量制备法)(Sambrook等， 如上)提取用于常规操作和测序的质粒DNA。
聚合酶链式反应(PCR)
PCR用于基因扩增、基因检测和克隆。除非另外指出，否则反应条件 如下5-100ng模板DNA、 0.05mMdNTP、 7.5(xM各个引物、lOmMTrispH 8.8、 50mMKCl、 0.08%诺乃洗涤剂(Nonidet )P40、 1.5mMMgCl2、 O.lmg/ml BSA和0.125-.05pl Taq DNA聚合酶，终体积25^1。反应条件为94。C保 持10分钟，然后是30个循环的94。C保持1分钟、54。-62。C保持1分钟和 72匸保持3分钟，最后一步是72。C保持10分钟。
测序和序列分析
DNA测序通过Sanger (Sanger F. (1981) Science 214:1205-1210)的双脱 氧核苷酸链终止法执行，使用焚光DNA自动测序仪。数据库的同源性搜 索使用美国国家生物技术信息中心的基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool)执行。使用Clustal W分析核苷酸和氨基酸序列。
才直物DNA分析
微量DNA分离
DNA提取緩沖液0.35M山梨醇、0.1M Tris-HCl pH画7.5、 5mMEDTA。 使用前加入0.02M亚硫酸氩钠。
核裂解緩冲液0.2MTrispH-7.5、 50mMEDTA、 2MNaCl、 2%CTAB。
提取緩沖液混合物-1体积DNA提取緩冲液、1体积核裂解緩冲液、 0.4体积5。/。十二烷基肌氨酸钠(w/v,溶于ddH20)。
一百毫克取自顶端分生区的新鲜叶片冷冻，在液氮中用木制牙签研磨。然后将研磨后的组织与400 ^1提取緩冲液混合物匀浆，涡旋1分钟。
然后将匀浆的混合物在65。C孵育40分钟。溶胞产物用l:i体积比氯仿抽 提一次。将管涡旋5分钟，然后在Eppendorff离心机中15,000g离心5分 钟。向DNA沉淀的水相加入2/3体积的异丙醇和0.1体积的3MNaOAC pH 6。将管在-20。C下孵育30分钟，然后20,000g、 4。C离心30分钟。DNA沉 淀(pellets)用70%乙醇洗涤一次，用100^1 ddH20溶解。
DNA印迹分析
限制酶切消化、琼脂糖凝胶电泳、DNA印迹、杂交和放射自显影基本 根据Bernatzky和Tanksley (Plant Mol. Biol. Rep. 4: 37-41 ， 1986)和Sambrook
等(如上)执行。
引物标记混合物
TM-0.25MTrispH8、 0.025MMgC12、 0.005M DTT (储存于4°C)
OL -于TE中的90单位/ml的六脱氧核苷酸(Boehringer Mannheim)(储存 于画20。C)
DTM —于TM中的O.lmM dATP、 dGTP和dTTP (储存于-20。C) LS - 500jil HEPES 1M pH 6.6、 500^1 DTM、 140^1 OL (储存于-80。C)
40吗基因组DNA使用需要的限制酶消化，使用供应商推荐的緩冲液，
反应体积150[il,并加入终浓度4mM的亚精胺和终浓度100pg/ml的RNA
酶A。消化后的DNA片段使用NEB緩冲液(0.1M Tris碱、10mM EDTA
pH-8.1、 126 mM醋酸钠)在0.5吗/ml溴化乙锭预染色的1%琼脂糖凝胶上
分离。电泳后，凝胶在紫外灯下拍照。进行毛细管转移之前，紫外(254nm)
照射断裂DNA，持续3分钟。内含DNA的琼脂糖凝胶在变性液(lMNaCl、 n《A/f >j。r u、rb toi玄1《，kFkf 狄'isi ^盆d/ j-r ,:i、:夂2 、》 々i、 p^J^6fr;^ f古
脂糖凝胶在中和液(1.5MNaCl、 0.5MTrispH7)中孵育另外1.5小时，然后 用ddH20洗涤2次。使用20 X SSC将DNA印至Hybond W (Amersham-Biosciences, Sweden)膜上，保持20小时。用2XSSC洗涤印膜 (Blot)并千燥。使用下述方案用P"dCTP标记探针在加入llplLS、 5plBSA(lmg/ml)、 5^1 dCTP和l^il克列诺片段DNA聚合酶(总体积40 pl)之前，将约50ngDNA在18^1 ddH20中煮沸5分钟，立即在水上冷却。所述标记混合物在37 。C孵育1小时，使用ProbeQuant G50微量离心柱(Amersham)除去未掺入的核苷酸。
预杂交和杂交
预杂交和杂交使用塑料/玻璃管在回转式振荡培养箱(25rpm, 65°C )中执行。膜在含有0.263MNa2HPO4、 7% SDS、 lmM EDTA、 1% BSA的45ml杂交緩沖液中预杂交2小时(20ml预杂交緩冲液足够用于一块20cm x10cm的印膜)。探针在沸水中变性10分钟，然后将其加入30ml杂交緩沖液中。杂交在回转式振荡仪、65。C下过夜执行。然后将膜在0.263MNa2HP04、1%SDS中，20分钟，65°C洗涤一次，然后用2 X SSC、 0.1% SDS，20分钟洗涤一次，第三次用IX SSC、 0.1% SDS洗涤20分钟。然后轻轻干燥膜，用塑料包装，使用Kodak增强屏(intensifier screen)在-80。C对Kodak Bio max-MS X射线胶片曝光24-72小时。
才直物RNA分析
小量制备RNA分离
叶片或种子使用研钵和研杵在液氮中研磨。最多150mg样品使用SV总RNA分离试剂盒#23200 (Promega, USA)根据制造商的方案进行总RNA分离。
沉默质粒的构建
使用pKannibal载体(Wesley等Plant J. 27: 581-590， 2001)沉默拟南芥、烟草和红麻的GA2-氧化酶。使用Kannibal引物从各个植物中PCR克隆两个互补片段。正义片段使用Kpnl和Xhol克隆，反义片段使用Clal和Xbal克隆。将所迷正义和反义方向克隆至pKannibal载体。使用Wort消化含有正义和反义片段的pKannibal,然后将其亚克隆至双元载体pArt27 (Gleave,A.P. Plant MolBiol 20: 1203-1207， 1992)。将得到的构建体通过电穿孔导入农杆菌GV3101。
过表达质粒的构建
39因组拟南芥GA20-氧化酶基因分别克隆至pBinPlus和pNoga (后者是含有GFP基因的pBinl9+变体)的3SSQ启动子和Nos终止子之间，所述35SQ启动子含有翻译增强子信号，所述Nos终止子分别加有N末端Myc和C末端GFP标签。将得到的构建体电穿孔导入农杆菌GV3101。使用这些农杆菌菌抹转化拟南芥、烟草和红麻植物。
植物转化
拟南芥稳定转化
转化通过浸蕾法(floral dip) (Clough等，Plant Journal 16: 735-743、1998)执行。简单而言培养植物至开花。在转化日剪去角果和花。将携带所述双元载体的农杆菌培养物用5%蔗糖溶液重悬至OD600=0.5。浸蘸之前，加入浓度为0.05%的Silweet L-77并充分混合。将植物的地上部分在农杆菌溶液中浸2-3秒并轻轻摇动。将浸过的植物置于覆盖的盘中24小时，以保持生长室的湿度并避免接触过多的光。正常培养植物至种子成熟。收获干燥的种子，在含有5(Vg/ml卡那霉素的MS平板上选择转化子。将假定的转化子转移至土壤。
烟草稳定转化
烟草samsun NN栽培变种植物按前人方法转化(Horsh等Cold SpringHarb Symp Quant Biol 50: 433-437， 1985)。简单而言，在含有固体(0.6%植物琼脂，Duchefa， The Netherlands) MS培养基的Magenta盒中在无菌条件下培养烟草植物。将叶片剪成小的长方形，切口对着主脉。含有所需载体的农杆菌的过夜培养物用MS液体培养基稀释至终OD600为0.5,将所述叶片在其中孵育20分钟。用无菌纸吸干后，将所述叶片在添加2mg/ml激动素和0.8mg/ml IAA(Sigma)的固体MS培养基上共培养2-3天。然后将
所述叶片转移至含有2mg/ml激动素、0.8mg/ml IAA、 400 mg/L凯福隆和inomff/mi "^刃i5雪妄frft f5W太ivrs这1A 在新阁；I泉会^;紐纽產^^玄S ^f刍芏士吞l
基，直至芽再生。然后将再生芽转移至添加100mg/L卡那霉素和400 mg/Lclaforn的固体MS培养基。将在存在100mg/L卡那霉素下生根的再生芽进行盆栽，转移至25"C生长室。通过PCR或DNA印迹分析检验阳性的卡那霉素抗性植物中的插入基因的存在。
40瞬时表达分析
双元载体克隆通过电穿孔导入农杆菌菌林GV3101。农杆菌细胞在LB培养基中28。C培养过夜，用VIR诱导培养基(50mM MES pH 5,6、 0.5% (w/v)葡萄糖、1.7mM NaH2P04 、 20mM NH4Cl 、 1.2mM MgS04 、 2mM KC1 、 1 7jliMFeS04、 70^M CaCl2和200nM乙酰丁香酮)稀释，另外培养6小时至OD600达到0.4-0.5。然后将所述农杆菌培养物稀释至终OD60Q为0.2,将所述悬浮物用无针(needless)注射器注入烟草和红麻植物的叶片。在共聚焦显微镜下观察叶片的GFP表达。
组织制备和显微镜检查
手动将茎组织切为1至3 mm厚的切片。所述切片在室温下用于90%乳酸中的0.4。/。的间苯二酚蓝溶液(PolyScience, Niles， IL)染色约2秒，然后用自来水漂洗至洗去残留颜色。随后，将所述切片转移至50%乳酸钠在透射白光下进行显微分析(Aloni和Barnett， Planta 198: 595-603， 1996)。
红麻GA 2-氧化酶和部分番茄GA 2-氧化酶基因分离
简并引物
对四种不同植物GA 2-氧化酶氨基酸序列进行比对(NCBl登录号Q8LEA2、 Q9XFR9、 BAD17856.1和AAQ93035.1)。使用ClustalW鉴定高度保守的区域。使用Mac Vector软件(Accelrys Software Inc.)反向翻译最长的最保守的区域。根据植物密码子使用(Murray E.等，1999)减少置换。得到的筒并引物序列为
5'正向5'-TGYGARGARTTYGGYTTYTTYAARG-3'
3'反向5'陽GGRTCDGTRTGYTCNCGRAANCC-3'
反向PCR
使用简并引物(上文列出)对提耳又的红麻和番茄基因組DNA执行PCR。将得到的扩增子克隆至pTZ57R/T质粒并测序。根据此序列设计4个引物(即反向1-4,参见上文的引物列表)以扩增PCR产物侧翼的基因组DNA。两个为外侧引物，两个用于随后的PCR。反向PCR的DNA模板通过下述方法制备使用20UMsel在37 。C处理10昭红麻基因组DNA3小时，然 后进行乙醇沉淀。选择Msel限制性内切核酸酶是因为在所述扩增片段的 编码序列中未发现其识别序列而被选择。用T4DNA连接酶(4 U)在4°C重 新环化1 pg Msel处理的DNA，保持12小时，然后进行乙醇沉淀。然后 使用所述反向引物对100 ng自连接的植物基因组DNA执行PCR反应。将 PCR产物克隆至pTZ57R/T质粒并测序。然后在NCBI数据库中搜索所述 分离的红麻基因的同源序列。
实施例1 转基因拟南芥系
增强型35S启动子驱动的GA20-氧化酶基因转化拟南芥植物
根据报告的拟南芥GA20-氧化酶序列(Xu等Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6640-6644、 1995)设计引物。使用这些引物分离GA 20-氧化酶基因组 序列。PCR扩增的基因的序列与045的序列相似(登录号ATU20873)。所 克隆基因和所报告基因之间的Blast分析显示几个差异，但是没有发现缺 口或终止密码子。这些碱基对变化不可能是PCR反应造成的突变，因为它 们彼此邻近并且以非常高的频率出现，这不符合Taq聚合酶的错误频率。 从Co/ww/)/a生态型中分离045序列，将其导入双元Ti质粒pBinl9Plus。 将GA20-氧化酶基因在35S启动子的调节之下克隆，将其N末端通过pLola 中间载体连接至Myc表位。使用农杆菌菌林GV3101转化拟南芥植物。通 过在含有卡那霉素的培养基上培养选择转基因Tl系。随机选择的Tl林系 明显高于wt对照植物。
使用GA2-氧化酶基因抑制构建体转化拟南芥植物
根据NCBI中提交的拟南芥GA2-氧化酶序列(NCBI登录号 NMJ06491)设计引物，以分离373bp片段(SEQIDNO: 35)，其序列如下CCACTATTTCCAAGTCTTCTCAAAAGCCCGGGAACTTTCAG
将所述片段以正义和反义两个方向克隆至pKannibal载体，位于Pdk 内含子侧翼(Wesley等，Plant J. 27: 581-590, 2001)。将此载体亚克隆至双 元载体pArt27(Gleave, Plant Mol Biol 20: 1203-1207, 1992)。将所述栽体 电穿孔至用于植物转化的农杆菌GV3101菌抹。通过在含有卡那霉素的培 养基上培养选择转基因Tl系。
SEQ ID NO : 35的互补序列如下(SEQ ID NO : 39):
CCGGATTTTGGTATTGCTACCGGTTTAGACAATACCGCCATTG
转基因拟南芥系的表型鉴定
种植了 GA 20-氧化酶过表达和GA 2-氧化酶沉默两种转化的Tl系， 采集叶样品。提取基因组DNA，通过PCR检验是否存在所述转基因。将 所述转基因的阳性系种植于对照野生型(wt)植物的旁边。在植物生长过程 中，分析其解剖学特性并与wt对照植物进行比较。GA20-氧化酶过表达植 物显示出与GA 2-氧化酶沉默植物相似的表型。在长日条件下，所述转基 因植物长得更高，开花更快(
图1A)。未检测到构成花序轴的节间数的显著 差异。因此，植物生长的增加可归结于节间的变长。在短日条件下，wt植 物长有典型的大莲座叶，而所述转基因系长有长日条件下典型的花序轴(图 1B)。用间苯二酚蓝对茎横切面进行染色(鉴别纤维细胞中的木质素)。沉默
43GA 2-氧化酶的转基因系中的纤维具有淡蓝色染色，相比之下，Wt纤维则
为深蓝色，这很可能指示细胞壁中木质素积累的降低(图2)。此外，在所述
转基因系中检测到木质部纤维数和密度大大增加。
实施例2
转基因烟草系
拟南芥GA20-氧化酶基因在烟草植物中的异源过表达
使用与将GA20-氧化酶基因插入拟南芥的相同的农杆菌转化烟草植 物。将拟南芥GA20-氧化酶基因克隆至双元载体pNOGA的含有翻译增强 子信号的35S-Q启动子和GFP基因(绿色荧光蛋白)之间，所述GFP基因后 面是NOS终止子。通过在含有卡那霉素的培养基上培养选择转基因Tl系。 蛋白质印迹分析确认了蛋白质表达。
使用GA2-氧化酶基因抑制构建体转化烟草植物
根据NCBI中提交的烟草GA 2-氧化酶序列(登录号AB125232和 AB125233)设计引物，以分离155 bp沉默片段(SEQ ID NO: 36)，其序列 ^口下
TTCATTGCAGG
选择的序列与所述两个NCBI报告的烟草GA2-氧化酶家族基因互补。 将所述片段以正义和反义两个方向克隆至pKannibal载体，位于Pdk内含 子侧翼。将此载体亚克隆至双元载体pART27。将所述载体电穿孔至用于 植物转化的农杆菌GV3101菌林。通过在含有卡那霉素的培养基上培养选 择转基因Tl系。
SEQIDNO: 36的互补序列如下(SEQ ID NO: 40):
44CCAAATCCAATC
转基因烟草系的表型鉴定
种植异源GA20-氧化酶过表达的T1系。切下叶片，在共聚焦显微镜 下观察GFP发光。将表达GFP的系种植于wt植物旁边。约2.5个月后， 对茎的节间执行解剖学测量。转化系高于对照(图3)。检测到三个转基因系 和wt之间的节间数存在显著增加，这与拟南芥中的表型相反。不过，和 在拟南芥中一样，转化造成节间长度增加。节间长度差异在最长节间中更 加显著。制备茎横切片，间苯二酚蓝染色后在光学显微镜下进行观察。与 wt对照相比，转化植物明显产生更多的内层韧皮部纤维(图4)和更高的纤 维计数(表2)。与节间长度的差异相符，在所述转基因植物中鉴定了可检测 的更高数量的发育阶段节间，鉴于它们并未表现出在wt对照植物的相同 节间中观察到的纤维分化(fiber initiation),因此这表明GA 20-氧化酶过表 达加快了植物生长。拟南芥中发现的木质素减少在烟草转基因植物中不显 著。
将GA 2-氧化酶沉默的Tl系种植于wt对照旁边。测量解剖学特性。 两组之间的节间数无显著差异，虽然四个最高的系要高出20%-60%(图5 和6)。叶的大小也受沉默的影响。与wt植物相比，转基因叶更长，并存 在于更高的节间。
实施例3
红麻和番茄沉默片段的分离
根据NCBI提交的多个物种的序列设计GA 2-氧化酶的简并引物，方 法参见上文"材料和方法"。使用这些引物对从红麻和番茄的幼叶中提取 的基因组DNA进行PCR分析。低严格性PCR编程为使用54°C的杂交温 度。扩增的红麻片段长473 bp,并显示不包括任何内含子(参见下文)。因 此，使用其通过pKANNIBAL构建沉默载体，方法同拟南芥和烟草。扩增
45的番茄片段长488 bp(参见下文)。对它们的翻译和氨基酸水平的BLAST分 析证实，两个序列均为GA 2-氧化酶片段。
红麻扩增片段序列(SEQ ID NO: 4)如下
AGACCCA
SEQ ID NO : 4 的互补序歹'J如下(SEQ ID NO : 38):
番茄扩增片段序列(SEQIDNO: 37)如下:AAGAGCGACTCTG
SEQ ID NO : 37的互补序歹'J如下(SEQ ID NO : 41):
TTCCTCGCAA
实施例4
完整红麻GA2-氧化酶基因分离
使用所述简并引物通过PCR获得DNA片段，使用所述DNA片段设 计用于反向PCR和随后的巢式PCR的引物，方法参见上文"材料和方法"。 将巢式PCR扩增子克隆至pUC57R/T质粒并测序。通过位于三个独立的内 含扩增子的质粒的三个独立的序列验证所述序列。因此，鉴定了红麻0八2-氧化酶的完整基因组序列(SEQIDNO: 3)(图7)。
47该基因长1134bp,包括多个假定的剪接变体。它与任何已知基因没有 明显的DNA同源性，但是在氨基酸水平与欧洲夹竹桃(A^7'ww 0/e朋tfer)的 GA20x2具有63%同源性和76%相似性。红麻GA 2-氧化酶的cDNA核苷 酸序列(SEQIDNO: l)和氨基酸序列(SEQ ID NO: 2)显示于图8。
本领域技术人员应理解，本发明不受上文特别显示和描述的内容的限 制。更确切地说，本发明的范围由下述权利要求确定。
权利要求
1. 一种分离的核酸分子，所述核酸分子包含如SEQ ID NO1所述的编码红麻赤霉素2-氧化酶(GA2-氧化酶)的核苷酸序列或其互补链或同源序列，其中所述同源序列与SEQ ID NO1具有至少80％的序列同一性。
2. 如权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述同源序列与SEQ ID NO: 1具有至少90%的序列同一性。
3. 如权利要求l所述的分离的核酸分子，其中所述同源序列与SEQID NO: 1具有至少95%的序列同 一性。
4. 如权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述同源序列与SEQ ID NO: 1具有100%的序列同一性或100%的序列同源性。
5. —种分离的红麻植物GA2-氧化酶多肽或其类似物或片段，所述多 肽包含如SEQ ID NO: 2所述的氨基酸序列，其中所述类似物与SEQ ID NO: 2具有至少80%的氨基酸序列同源性。
6. 如权利要求5所述的分离的红麻GA2-氧化酶多肽，所述多肽具有 如SEQ ID NO: 2所述的氨基酸序列。
7. —种分离的核酸分子，所述核酸分子具有如SEQIDNO: 3所述的 编码红麻植物赤霉素2-氧化酶(GA2-氧化酶)的核苷酸序列。
8. —种双链RNA分子，其下调红麻GA 2-氧化酶基因的表达，所述 双链RNA分子包含a) 包含与红麻GA 2-氧化酶基因转录的RNA或其片段具有至少90%序 列同一性的至少20个连续核苷酸的所述双链RNA的第一个RNA 链；和b) 包含与红麻GA2-氧化酶基因转录的RNA的互补序列或其片段具有 至少90%序列同一性的至少20个连续核苷酸的所述双链RNA的第 二个RNA链，其中所述第一个和第二个RNA链能够彼此杂交以形成所述双链RNA分子。
9. 如权利要求8所述的双链RNA分子，其中所述第 一个RNA链与红 麻GA2-氧化酶基因转录的RNA或其片段具有至少95%序列同一性。
10. 如权利要求8所述的双链RNA分子，其中所述第一个RNA链与 红麻GA2-氧化酶基因转录的RNA或其片段具有100%序列同一性。
11. 如权利要求8所述的双链RNA分子，其中所述红麻GA 2-氧化酶 基因转录的RNA包含如SEQ ID NO: 1所述的核苷酸序列。
12. 如权利要求8所述的双链RNA分子，其中所述红麻GA2-氧化酶 基因转录的RNA的片段包含如SEQ ID NO: 4所述的核香酸序列。
13. 如权利要求8所述的双链RNA分子，其中所述第二个RNA链与 同一性。
14. 如权利要求8所述的双链RNA分子，其中所述第二个RNA链与 红麻GA 2-氧化酶基因转录的RNA的互补序列或其片段具有100%序列同一性。
15. 如权利要求12所述的双链RNA,其中所述第一个和第二个RNA 链各包含至少25个核苷酸。
16. —种用于生成能够下调红麻GA2-氧化酶基因的表达的RNA分子 的DNA构建体，所述DNA构建体包含可操作地连接至编码形成双链RNA 的RNA序列的多核苷酸序列的植物启动子，所述多核苷酸序列包含(i) 包含与如SEQ ID NO: 1所述的核苷酸序列或其片段具有至少90% 序列同一性的至少20个连续核苷酸的第一个核苷酸序列；和(ii) 包含与如SEQ ID NO: 1所述的核苷酸序列的互补序列或其片段具 有至少90%序列同一性的至少20个连续核苷酸的第二个核苷酸序 列，其中所述DNA构建体转录的RNA分子下调红麻GA2-氧化酶基因的 表达。
17. 如权利要求16所述的DNA构建体，其中所述第一个和第二个核 苷酸序列各包含至少25个核苷酸。
18. 如权利要求16所述的DNA构建体，其中所述第一个和第二个核 苦酸序列各包含至少50个核苷酸。
19. 如权利要求16所述的DNA构建体，其中所述第一个和第二个核 苦酸序列各包含至少100个核苷酸。
20. 如权利要求16所述的DNA构建体，其中所述第一个核苷酸序列 与如SEQ ID NO: 1所述的核香酸序列或其片段具有至少95%序列同一性。
21. 如权利要求16所述的DNA构建体，其中所述第一个核苷酸序列 与如SEQ ID NO: 1所述的核苷酸序列或其片段具有100%序列同源性。
22. 如权利要求16所述的DNA构建体，其中所述第一个核苷酸序列 与如SEQ ID NO: 4所述的核香酸序列或其片段具有至少90%序列同一性。
23. 如权利要求16所述的DNA构建体，其中所述第二个核苷酸序列 与如SEQ ID NO: 1所述的核苷酸序列的互补序列或其片,殳具有至少95% 序列同一性。
24. 如权利要求16所述的DNA构建体，其中所述第二个核香酸序列 与如SEQ ID NO: 1所述的核苷酸序列的互补序列或其片段具有100%序列 同源性。
25. 如权利要求16所述的DNA构建体，其中所述第二个核苦酸序列 与如SEQ ID NO: 38所述的核苷酸序列或其片段具有至少90%序列同一性。
26. 如权利要求16所述的DNA构建体，其中所述植物启动子选自由 组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子和发育阶段特异性启动 子组成的组。
27. 如权利要求16所述的DNA构建体，其进一步包含可选择的标记。
28. 如权利要求16所述的DNA构建体，其进一步包含选自由增强子、 转录因子和转录终止子信号组成的组的表达控制序列。
29. 如权利要求16所述的DNA构建体，其中所述第一个和第二个核 苷酸序列可操作地连接至同 一启动子。
30. 如权利要求16所述的DNA构建体，其中所述第一个和第二个核 苦酸序列-皮间隔子序列隔开。
31. 如权利要求30所述的DNA构建体，其中所述间隔子序列是内含子。
32. —种一直物细胞，其经权利要求8至15任一项所述的双链RNA转化。
33. 如权利要求32所述的植物细胞，其中所述细胞是红麻植物细胞。
34. —种植物细胞，其经权利要求16至31任一项所述的DNA构建体 转化。
35. 如权利要求34所述的植物细胞，其中所述细胞是红麻植物细胞。
36. —种转基因植物，其包含至少一个用权利要求8至15任一项所述 的双链RNA转化的细胞。
37. 如权利要求36所述的转基因植物，其中所述转基因植物是红麻植物。
38. —种转基因植物，其包含至少一个用权利要求16至31任一项所 述的DNA构建体转化的细胞。
39. 如权利要求38所述的转基因植物，其中所述转基因植物是红麻植物。
40. —种转基因植物的种子，所述转基因植物是权利要求36至39任 一项所述的转基因植物。
41. 一种转基因植物的茎，所述转基因植物是权利要求36至39任一 项所述的转基因植物。
42. —种用于生产具有降低的GA 2-氧化酶基因的表达的转基因植物 的方法，所述方法包括将权利要求8至15的任一项所述的双链RNA导入 所述才直物的至少 一个细胞。
43. 如权利要求42所述的方法，其中所述植物是红麻植物。
44. 一种用于生产具有降低的GA 2-氧化酶基因的表达的转基因植物 的方法，所述方法包括将包含可操作地连接至编码RNA序列的多核苷酸 序列的植物启动子的DNA构建体导入至少一个植物细胞，所述多核苷酸 序列包含(i) 包含与编码所述植物GA 2-氧化酶的核酸分子或其片段具有至少 90%序列同一性的至少20个连续核苷酸的第一个核苷酸序列；和(ii) 包含与编码所述植物GA2-氧化酶的核酸分子的互补序列或其片段 具有至少90%序列同一性的至少20个连续核香酸的第二个核苷酸 序列，其中所述DNA构建体转录的RNA分子下调所述GA 2-氧化酶基因的表达。
45. 如权利要求44所述的方法，其中所述植物选自由被子植物家族和 棵子植物家族组成的组。
46. 如权利要求45所述的方法，其中所述植物属于选自由木槿属、杨 属、桉属、向日葵属、黄麻属和苎麻属组成的组的被子植物家族。
47. 如权利要求46所述的方法，其中所述植物选自由红麻、向日葵、 赤桉、大麻、黄麻和苎麻组成的组。
48. 如权利要求47所述的方法，其中所述植物是红麻植物。
49. 如权利要求48所述的方法，其中所述植物是红麻植物并且所述 DNA构建体是权利要求16所述的DNA构建体。
50. 如权利要求44所述的方法，其中所述植物是拟南芥，并且所述第 一个核苷酸序列与如SEQIDNO: 35所述的核香酸序列或其片段具有至少 90%序列同一性，所述第二个核苷酸序列与如SEQIDNO: 39所述的核苷 酸序列或其片段具有至少90%序列同一性。
51. 如权利要求50所述的方法，其中所述植物是烟草，并且所述第一 个核苷酸序列与如SEQ ID NO: 36所述的核苷酸序列或其片段具有至少90%序列同一性，所述第二个核苷酸序列与如SEQIDNO: 4G所述的核苷 酸序列或其片段具有至少90%序列同一性。
52. 如权利要求50所述的方法，其中所述植物是番茄，并且所述第一 个核苷酸序列与如SEQ ID NO: 37所述的核苷酸序列或其片段具有至少 90%序列同一性，所述第二个核苷酸序列与如SEQIDNO: 41所述的核苷 酸序列或其片段具有至少90%序列同一性。
53. 如权利要求44所述的方法，其中导入DNA构建体的所述步骤是 通过选自下述组的方法执行的农杆菌介导的转化、基因枪法、花粉介导 的转化、植物RNA病毒介导的转化、脂质体介导的转化、直接基因转移 和致密胚性愈伤组织的电穿孔。
54. —种用于增加植物纤维产量的方法，所述方法包括将包含可操作 地连接至编码RNA序列的多核香酸序列的植物启动子的DNA构建体导入 至少一个植物细胞，所述多核苷酸序列包含(i) 包含与编码所述植物GA 2-氧化酶的核酸分子或其片段具有至少 90%序列同一性的至少20个连续核苷酸的第一个核苷酸序列；和(ii) 包含与编码所述植物GA 2-氧化酶的核酸分子的互补序列或其片段 具有至少90%序列同一性的至少20个连续核苷酸的第二个核苷酸 序列，其中所述DNA构建体转录的RNA分子下调所述GA 2-氧化酶基因的 表达。
55. 如权利要求54所述的方法，其中所述植物选自由被子植物家族和 棵子植物家族组成的组。
56. 如权利要求55所述的方法，其中所述植物属于选自由木槿属、杨 属、桉属、向日葵属、黄麻属和苎麻属组成的组的被子植物家族。
57. 如权利要求56所述的方法，其中所述植物选自由红麻、向日葵、 赤才耍、大麻、黄麻和苎麻组成的组。
58. 如权利要求57所述的方法，其中所述植物是红麻植物。
59. 如权利要求54所述的方法，其中当所述植物是红麻植物时，所述 DNA构建体是权利要求16所述的DNA构建体。
60. —种反义寡核普酸，其靶向包含SEQ ID NO: 3所述的核苷酸序 列的核酸分子的区域。
61. —种编码核酶的核普酸序列，所述核酶能够切割由包含SEQ ID NO: 1所述的核苷酸序列的核酸分子转录的RNA序列。
62. —种表达载体，其包含权利要求1所述的分离的核酸分子。
63. —种植物细胞，其经包含权利要求62所述的分离的核酸分子的表 达载体转化。
64. —种转基因植物，其包含至少一个用权利要求62所述的表达载体 转化的植物细胞。
65. 如权利要求64所述的转基因植物，其中所述转基因植物是红麻植物。
66. —种生产转基因植物的方法，所述方法包括将权利要求62所述的 表达载体导入植物的至少一个细胞，籍此产生转基因植物，籍此过表达红 麻GA2-氧化酶。8
全文摘要
本发明提供分离的编码红麻(Hibiscus cannabinus)赤霉素2-氧化酶(GA2-氧化酶)的核酸序列。此外，本发明提供通过RNA干扰沉默GA2-氧化酶基因的表达以增加植物中，特别是红麻(kenaf)中的纤维的方法。
文档编号A01H5/00GK101489375SQ200780027639
公开日2009年7月22日 申请日期2007年5月24日 优先权日2006年5月23日
发明者乔纳森·达扬, 罗尼·阿洛尼, 阿迪·阿弗尼 申请人:雷蒙特亚特特拉维夫大学有限公司