专利名称：裂褶菌蛋白提取物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物病害防治领域，具体地说涉及裂褶菌蛋白提取物及其制备 方法和应用；此外，还涉及裂褶菌的培养方法和培养基。
背景技术：
植物病毒病类似人类的癌症，目前尚无十分有效的防治方法。烟草花叶病 毒(7b6accomo^cv/ntf， TMV)是最具经济重要性的病毒之一，能侵染茄科、 葫芦科、十字花科等300多种植物，并引起严重危害，植物病毒病防治通常依 靠育种和化学药剂的方法解决，但效果都不理想，前者受限于抗病基因的来源， 后者则效果差，同时会造成环境污染等问题。近年来，随着人们对环境的重视， 化学药剂的应用受到了限制，而环境友好型的生物源抗植物病毒药剂受到重视。
裂褶菌(5"c/H'zop/^〃wm comm,e Fr.)又称白参、树花，属于真菌门，担子 菌亚门、层菌纲、非褶菌目、裂褶菌科、裂褶菌属。裂褶菌广布于世界各地， 我国大部分地区都有分布。近年来，日本及欧美等国主要从分子生物学、抗癌 活性物质和优良菌株的选育等方面对裂褶菌进行研究，我国的研究则集中于裂 褶菌的发酵条件、人工驯化栽培和药用价值。裂褶菌中含有多种抗菌消炎、抗 肿瘤，抗辐射等活性物质，但其应用研究多集中在医学领域，而在抗植物病毒 方面的作用未涉及到。 '
专利《裂褶菌的培养工艺及其利用》(专利号ZL85103492)公开了用黄豆 粉、葡萄糖或蔗糖、酵母膏、硫酸镁、磷酸二氢钾等组成的培养基培养裂褶菌 的方法，提高菌丝体及裂褶多糖的得率，并从裂褶菌中提取抗肿瘤、抗放升白 及调整机体免疫功能、生产抗菌素增效剂的裂褶菌多糖和人体必需的氨基酸。 在这种液体培养工艺下，每升发酵菌液含200-300g菌丝体(湿重)，但是其产量 仍然较低。
发明内容
本发明第一目的是提供一种能防治烟草花叶病毒的裂褶菌蛋白提取物。 本发明第二目的是提供上述裂褶菌蛋白提取物的制备方法。本发明第三目的是提供裂褶菌的培养方法。 本发明第四目的是提供用于培养裂褶菌的培养基。
本发明第五目的是提供裂褶菌蛋白提取物在防治烟草花叶病毒上的用途。 实现本发明的技术方案如下 裂褶菌蛋白提取物，按照如下方法制备.-
(1) 按照重量体积比为1: 10 20的比例将裂褶菌菌丝粉与pH 7.0 9.0
的磷酸缓冲液(PBS)混合，然后在2 6。C浸提1 3h，再在4。C、7000 10000rpm 条件下离心15 25min，收集上清液，得到裂褶菌粗提液；.
(2) 向步骤(1)所得裂褶菌粗提液中加入硫酸铵至饱和度为40%，然后 在2 6。C放置6 12小时，再在4°C、 7000 10000rpm条件下离心〗5 25min， 收集上清液；
(3) 向步骤(2)所得上清液中加入硫酸铰至饱和度为85%，然后在2 6。C 放置6 12小时，再在4。C、 7000 10000rpm条件下离心15 25min，所得沉
淀即为裂褶菌蛋白提取物。
上述裂褶菌蛋白提取物的制备方法，包括如下歩骤
(1) 按照重量体积比为1: 10 20的比例将裂褶菌菌丝粉与pH 7.0 9.0 的磷酸缓冲液(PBS)混合，然后在2 6。C浸提1 3h，再在4。C、7000 10000rpm 条件下离心15 25min,收集上清液，得到裂褶菌粗提液；
(2) 向步骤(1)所得裂褶菌粗提液中加入硫酸铵至饱和度为40%，然后 在2 6。C放置6 12小时，再-在4°C、 7000 10000rpm条件下离心15 25min， 收集上清液；
(3) 向歩骤(2)所得上清液中加入硫酸铵至饱和度为85%，然后在2 6。C 放置6 12小时，再在4°C、 7000 10000rpm条件下离心15 25min，所得沉
淀即为裂褶菌蛋白提取物。
所述的裂褶菌菌丝粉的粒径为《60目。
上述裂褶菌蛋白提取物中所述的裂褶菌的培养方法，包括如下步骤
(1) 裂褶菌母种活化将裂褶菌母种转接在？DA固体培养基上，然后在 24 28。C培养7 10天，得平板活化菌丝；
(2) —级菌种制备将步骤(1)所得平板活化菌丝切成小于lmm的小块， 按照0.4 0.8g菌丝/100ml的接种量将裂褶菌菌丝接种到液体发酵培养基巾，然后在24 28°C 、 200 260rpm/min条件下进行发酵培养4 6天，获得一级菌种； 所述液体发酵培养基的组成成份及其重量百分比为可溶性淀粉4 6%、葡萄 糖4 5.5%、小麦粉2 3%、玉米粉2 4%、酵母膏0.3 0.6%、黄豆粉0.5 1%、蛋白胨0.2 0.6%、 KH2P041%、 MgSO40.5%、 VB,0.01。/。，其余为水；
(3) 发酵培养按照体积百分比为5 15%的接种量将歩骤(2)得到的一 级菌种接种到液体发酵培养基(其组成成份及其重量百分比同步骤(2))中， 然后在24 28。C、 200 260rpm/min条件下进行发酵培养4 6天，得发酵混合
液；
(4) 将步骤(3)所得发酵混合液抽滤、收集裂褶菌菌丝，烘干、粉碎， 得裂褶菌菌丝粉。
上述培养方法步骤(2)或步骤(3)中所述的发酵培养的时间优选为6天。
上述培养方法步骤(1)所述的PDA固体培养基按照本领域技术人员所熟 知的方法制备，其组成成份及其重量百分比可以为马铃薯淀粉20%、葡萄糖 20%、琼脂20%、其余为水。
上述培养方法中所述的裂褶脔母种可以从中国农业微生物菌种保藏管理中 心或中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物屮心购买得到。
上述培养方法步骤(2)或歩骤(3)中所述的液体发酵培养基，其组成成 份及其重量百分比为可溶性淀粉4 6%、葡萄糖4 5.5%、小麦粉2 3%、 玉米粉2 4%、酵母膏0.3 0.6%、黄豆粉0.5 1%、蛋白胨0.2 0.6%、 KH2P04 1°/。、 MgSO40.5%、 VB,0.01。/。，其余为水。
上述液体发酵培养基的配制方法，包括按照比例将可溶性淀粉、葡萄糖、 小麦粉、玉米粉、酵母膏、黄豆粉、蛋白胨、KH2P04、 MgS04和VB,加入水 中，然后混合均匀即可。
本发明裂褶菌蛋白提取物在防治烟草花叶病毒病上的应用。具体方法为将 卜.述裂褶菌蛋白提取物稀释成浓度为40吗/ml的溶液，喷施于3 5叶期的烟草、 辣椒等植物的叶片上。
本发明具有的优点(1)木发明裂褶菌蛋白提取物对烟草花叶病毒的防治 效果好，在喷施烟草72小时后，接种烟草花叶病毒，对烟草花叶病毒的抑制率 口丄达到70%以上；(2)本发明的裂褶菌蛋白提取物属于天然提取物，对人类和 环境无害，属于环境友好型农药；(3)本发明裂褶菌蛋白提取物制备方法简单，成本低，适于进行规模化生产。(4)利用本发明的发酵培养基培养裂褶菌产量
高，每升发酵菌液可获得400 480g菌丝体湿重或54 60g菌丝体干重,与现有
技术相比，产量冇了很人的提高。
具体实施例方式
实施例1裂褶菌菌丝的制备
1、 菌种活化将裂褶菌母种转接在PDA固体培养基(马铃薯淀粉20%、 葡萄糖20%、琼脂20%、其余为水)上，在24。C培养10天，菌丝长满平板。
2、 裂褶菌的发酵培养
(1) 液体发酵培养基的制备分别称取以下成分，60g 口r溶性淀粉、55g 葡萄糖、30g小麦粉、40g玉米粉、6g酵母膏、10g黄豆粉、6g蛋白胨、lgKH2P04、 0.5gMgSO4、 10mgVBp将这些物质加入水屮并定容至lOOOml，混匀即可。
(2) —级菌种制备将步骤1得到的平板菌丝切成小于lmm的小块，按 照0.4g菌丝/100ml的接种量将裂褶菌菌丝转入装有100ml发酵培养基的500ml 摇瓶中，在24。C、 200rpm摇瓶培养6天得到一级菌种，其浓度为3.9g/100ml)。
(3) 发酵培养按照体积百分比为5%的接种量将步骤2 (2)得到的--级 菌种接种到装有100ml步骤2( 1 )所述液体发酵培养基的500ml摇瓶中，在24°C 、 200rpm摇瓶下培养6天，得发酵混合液；
(4) 将上述发酵混合液抽滤、收集菌丝于4(TC烘箱中烘干，每100ml发 酵菌液得到5.8g菌丝(下重)，粉碎过60目筛，得到裂褶菌菌丝粉。
实施例2裂褶菌菌丝的制备
1、 菌种活化将裂褶菌母种转接在PDA固体培养基(马铃薯淀粉20%、 葡萄糖20%、琼脂20%、其余为水)上，在26t:培养10天，菌丝长满平板。
2、 裂褶菌的发酵培养
(1) 发酵培养基的制备分别称取以下成分，40g可溶性淀粉、40g葡萄 糖、20g小麦粉、20g玉米粉、3g酵母膏、5g黄豆粉、2g蛋白胨、0.1gKH2PO4、 0.5gMgSO4、 10mgVB,，将这些物质加入1000ml水中混匀即可。
(2) —级菌种制各将步骤1得到的平板菌丝切成小于lmm的小块，按 照0.6g菌丝/100ml的接种量将裂褶菌菌丝转入装有100ml发酵培养基的500ml 摇瓶中，于26。C、 240rpm摇瓶培养6天，得到一级菌种(浓度为4.2g/100ml)。
(3) 发酵培养按照体积百分比为10%的接种量将步骤2 (2)得到的一级菌种培养液接种到装有100ml步骤2 (1)所述发酵培养基的500ml摇瓶中， 于26"、 240rpm摇瓶培养6天，得发酵混合液。
(4)将上述发酵混合液抽滤收集菌丝于4(TC烘箱中烘干，每100ml发酵 菌液得到5.4g菌丝(干重)，粉碎过60目筛得到裂褶菌菌丝粉。 实施例3裂褶菌菌丝的制备
1、 菌种活化将裂褶菌母种转接在PDA固体培养基(马铃薯淀粉20%、 葡萄糖20%、琼脂20%、其余为水)上，在28。C培养10天，菌丝长满平板。
2、 裂褶菌的发酵培养
(1) 发酵培养基的制备分别称取以下成分，60g可溶性淀粉、55g葡萄 糖、30g小麦粉、40g玉米粉、6g酵母膏、10g黄豆粉、6g蛋白胨、lgKH2P04、 0.5gMgSO4、 10mgVBp将这些物质加入水定容至1000ml混匀即可。
(2) —级菌种制备将步骤l得到的平板菌丝切成小于lmm的小块，按 照0.8g菌丝/100ml的接种量将裂褶菌菌丝转入装有100ml发酵培养基的500ml 摇瓶中，于2Sr、 260rpm摇瓶培养6天得到一级菌种(浓度为4.1g/100ml)。
(3) 发酵培养将步骤1)得到的一级菌种培养液按照体积百分比为15% 的接种量接种到装有100ml步骤2)所述发酵培养基的500ml摇瓶中，于28°C、 260rpm摇瓶培养6天，得发酵混合液；
(4) 将上述发酵混合液抽滤收集菌丝于4(TC烘箱中烘干，每100ml发酵 菌液得到6g菌丝(干重)，粉碎过60 H筛得到裂褶菌菌丝粉。
实施例4裂褶菌蛋白提取物的制备 按照如下方法进行
(1) 按照重量体积比为lg/10ml的比例将2g实施例1中所得的裂褶菌菌 丝粉与0.025mol/LpH7.0的磷酸缓冲液混合；在2"浸提1小时后，4°C 10000rpm 下离心25min，收集上清液，得裂褶菌粗提液。
(2) 向步骤(1)得到的裂褶菌粗提液中加硫酸铵至饱和度为40%，在2C 放置8小时，在4。C、 10000rpm条件下离心，收集上清液。
(3) 向步骤(2)得到的上清液中加入硫酸铵至饱和度为85%，在2。C放 置8小时，在4。C、 10000rpm条件下离心，收集沉淀，即得到裂褶菌蛋白提取 物。
实施例5裂褶菌蛋白提取物的制备
8按照如卜方法进行
(1) 按照重量体积比为lg/20ml的比例将2g实施例2屮所得的裂褶菌菌 -丝粉与0.025mol/LpH8.0的磷酸缓冲液混合；在4。C浸提2小时，4。C10000rpm 下离心25min，收集上清液，得裂褶菌粗提液。
(2) 向步骤(1)得到的裂褶菌粗提液中加硫酸铵至饱和度为40%，然后 在4。C放置8小时，再在4。C、 10000rpm条件下离心，收集上清液。
(3) 向步骤(2)得到的上清液中继续加入硫酸铵至饱和度85%，在4°C 放置8小时，再在4。C、 10000rpm条件下离心，收集沉淀，即得到裂褶菌蛋白 提取物。
实施例6裂褶菌蛋白提取物的制备 按照如下方法进行
(1) 按照重量体积比为lg/20ml的比例将2g实施例3中所得的裂褶菌菌 丝粉与0.025mol/L pH9.0的磷酸缓冲液混合；然后在6。C浸提3小时， 4"Cl0000rpm下离心25min，收集上清液，得裂褶菌粗提液。
(2) 向步骤(1)得到的裂褶菌粗提液中加硫酸钹至饱和度为40%，然后 在6。C放置8小时，再在4。C、 10000rpm条件下离心，收集上清液。
(3) 向步骤(2)得到的上清液中加入硫酸铵至饱和度85%，然后在6'C 放置8小时，再在4。C、 10000rpm条件下离心，收集沉淀，即得到裂褶菌蛋t^ 提取物。
实施例7裂褶菌蛋白提取物诱导烟草抗烟草花叶病毒活性试验
1、 蛋白浓度的测定
用BCA蛋白浓度试剂盒(美国Pierce公司)检测实施例4、 5、 6中提取的 裂褶菌蛋白提取物的蛋白浓度。
2、 抗病毒效果试验
(1) 喷雾防治处理分别将实施例4、 5、 6中得到的裂褶菌蛋白提取物用 水稀释得到总蛋白浓度为40pg/ml的溶液，分别对三至四叶期的枯斑三生烟进 行整株喷雾，设三个重复，每个重复三株，每株三片叶子；同时用清水喷施丁 三至四叶期的枯斑三生烟作为对照(CK)，设置三个重复，每个重复二株，每 株三片叶子。
(2) 病毒接种液的制备病毒来源为北京市农林科学院植物与环境保护研究所植病综防研究室保存的TMV普通株系(以普通烟为繁殖寄主，活体保存)，
将感染烟草花叶病毒TMV普通株系的普通烟的叶片去除主脉，与pH8.0的0.01 mol/LPBS按lg/20ml混合，每20mlPBS加0.015g金刚砂，将叶片充分研磨， 得到接种液。
(3) 接种按步骤(1)的方法喷雾处理枯斑三生烟植株72小时后，用步 骤(2)得到的接种液进行汁液摩擦接种(植病研究方法(第三版)，方中达，中 国农业出版社)接种后立即用清水冲洗，于防虫温室中培养，培养条件为28i: 光照12小时，18。C无光照12小时，交替进行。
(4) 枯斑抑制率讣算接种72小时后调查枯斑三生烟叶片产生枯斑数量，
按下式计算出枯斑抑制率。
X= (CK-Y) X100/CK (式I)
式I屮，X为枯斑抑制率，单位％; CK为清水对照叶片的平均枯斑数， 单位个；Y为经裂褶菌蛋白提取物诱导处理后叶片的平均枯斑数，单位个。 结果(见表1)实施例4、 5、 fi所得的裂褶菌蛋闩提取物处理过的烟草 对烟草花叶病毒的抑制率均在70%以匕说明裂褶菌蛋白提取物能够诱导烟草 对烟草花叶病毒产生抗性。
表1.裂褶菌蛋白提取物诱导烟草抗烟草花叶病毒活性试验结果
裂褶菌 蛋白 提取物重复一重复二重复三平均值标准 偏差
贫'寂叙 ^发^抑制 率％平均 枯斑 数抑制 率0/0平均 枯斑数抑制 率％平均 枯斑 数抑制 率％实施例42774.492577.613270.242874.113.7
实施例52972.152874.473369.163071.092.7
实施例62575.963270.913071.963270.092.7
CK104110107107
10
权利要求
1、裂褶菌蛋白提取物，按照如下方法制备(1)按照重量体积比为1∶10～20的比例将裂褶菌菌丝粉与pH7.0～9.0的磷酸缓冲液混合，然后在2～6℃浸提1～3h，再在4℃、7000～10000rpm条件下离心15～25min，收集上清液，得到裂褶菌粗提液；(2)向步骤(1)所得裂褶菌粗提液中加入硫酸铵至饱和度为40％，然后在2～6℃放置6～12小时，再在4℃、7000～10000rpm条件下离心15～25min，收集上清液；(3)向步骤(2)所得上清液中加入硫酸铵至饱和度为85％，然后在2～6℃放置6～12小时，再在4℃、7000～10000rpm条件下离心15～25min，所得沉淀即为裂褶菌蛋白提取物。
2、 按照权利要求1所述的裂褶菌蛋白提取物，其特征在于所述的裂褶菌菌 丝粉的粒径为《60目。
3、 权利要求l所述的裂褶菌蛋白提取物的制备方法，包括如下步骤(1) 按照重量体积比为h 10 20的比例将裂褶菌菌丝粉与pH 7.0 9.0 的磷酸缓冲液(PBS)混合，然后在2 6。C浸提1 3h，再在4。C、7000 10000rpm 条件下离心15 25min，收集上清液，得到裂褶菌粗提液；(2) 向步骤(1)所得裂褶菌粗提液中加入硫酸铵至饱和度为40%，然后 在2 6。C放置6 12小时，再在4°C、 7000 10000rpm条件下离心15 25min， 收集上清液；(3) 向步骤(2)所得上清液中加入硫酸铵至饱和度为85%，然后在2 6°C 放置6 12小时，再在4。C、 7000 10000rpm条件下离心15 25min，所得沉淀即为裂褶菌蛋白提取物。
4、权利要求1中所述的裂褶菌的培养方法，包括如下步骤:(1) 将裂褶菌母种转接在PDA固体培养基上，然后在24 28。C培养7 10天，得平板活化菌丝；(2) 将步骤(1)所得平板活化菌丝切成小于lmm的小块，按照0.4 0.8g 菌丝/100ml的接种量将裂褶菌菌丝接种到液体发酵培养基中，然后在24 28°C 、 200 260rpm/min条件下进行发酵培养4 6天，获得一级菌种；所述的液体发 酵培养基的组成成份及其重量百分比为可溶性淀粉4 6%、葡萄糖4 5.5%、小麦粉2 3%、玉米粉2 4%、酵母膏0.3 0.6%、黄豆粉0.5 1%、蛋白胨 0.2 0.6%、 KH2P041%、 MgSO40.5%、 VB0.010/。，其余为水；(3) 按照体积百分比为5 15%的接种量将步骤(2)得到的一级菌种接种 到液体发酵培养基中，然后在24 28'C、 200 260rpm/min条件下进行发酵培 养4 6天，得发酵混合液；(4) 将步骤(3)所得发酵混合液抽滤、收集裂褶菌菌丝，烘干、粉碎， 得裂褶菌菌丝粉。
5、 按照权利要求4所述的培养方法，其特征在于其歩骤(2)中所述的发 酵培养的时间为6天。
6、 按照权利要求4所述的培养方法，其特征在于其歩骤(3)中所述的发 酵培养的时间为6天。
7、 按照权利要求4、 5或6所述的培养方法，其特征在于其步骤(1)中所 述的PDA固体培养基的组成成份及其重量百分比为马铃薯淀粉20%、葡萄糖 20%、琼脂20%、其余为水。
8、 权利要求4中所述的液体发酵培养基，其特征在于其组成成份及其重量 百分比为可溶性淀粉4 6%、葡萄糖4 5.5%、小麦粉2 3%、玉米粉2 4%、酵母膏0.3 0.6%、黄豆粉0.5 1%、蛋白胨0.2 0.6%、 KH2P041%、 MgS04 0.5%、 VB,0.01。/。，其余为水。
9、 权利要求1所述的裂褶菌蛋白提取物在防治烟草花叶病毒病上的应用。
全文摘要
本发明公开了一种裂褶菌蛋白提取物及其制备方法，就是将裂褶菌菌丝粉在磷酸缓冲液中浸提，然后离心，得裂褶菌菌丝粗提液；然后向裂褶菌菌丝粗提液中加入硫酸铵，放置6～12小时后离心，最终可得裂褶菌蛋白提取物。本发明还公开了裂褶菌的培养方法和一种发酵培养基。本发明裂褶菌蛋白提取物对烟草花叶病毒的防治效果好，对烟草花叶病毒的抑制率可达到70％以上；本发明属于天然提取物，对人类和环境无害，属于环境友好型农药；本发明制备方法简单，成本低，适于进行规模化生产。此外，利用本发明的发酵培养基培养裂褶菌产量高。
文档编号A01N63/04GK101444231SQ20081024756
公开日2009年6月3日 申请日期2008年12月30日 优先权日2008年12月30日
发明者红 严, 娜 卢, 莹 周, 李兴红, 燕继晔 申请人:北京市农林科学院