专利名称：一种酶解饼粕蛋白生产饲用混合小肽的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用蛋白酶酶解饼粕蛋白生产饲用混合小肽的方法，属于用 酶制剂方法获得饲用生物制品技术领域，可作为添加剂或饲料蛋白源用于畜禽和 水产饲料中。
背景技术：
蛋白质的酶法水解是在一定条件下对蛋白质分子进行催化水解，使蛋白质分 子降解成不同链长的小分子，与酸碱催化反应相比，它具有反应条件温和，副反 应少，不破坏氨基酸和其它营养成分的特点，同时生成的肽类和氨基酸能更好的 被动物吸收和利用。
目前酶类制品商品化生产非常普遍，有动物性内源酶、微生物酶和植物蛋白 酶。从酶解成本来看，微生酶价格低，活性强，适合应用于大规模生产。常用的 酶解蛋白原料有酪蛋白、大豆蛋白、乳清蛋白、鱼肉蛋白、饼粕蛋白等。以动物 蛋白原料作为酶解蛋白源，其价格较高，而饼粕类等植物蛋白，如豆粕、棉粕、 花生粕等，作为水产饲料中常见的植物蛋白原料，来源广泛，价廉物美，广泛应 用于动物的配合饲料中。因此，积极开发饼粕类植物蛋白资源对饲料业的可持续 发展具有显著意义。
大量研究证明，由于大豆蛋白，花生蛋白，棉粕蛋白等结构复杂，分子量较 大，不易在体内消化吸收，而蛋白质的短肽物质不但消化吸收效果好，且分子量 集中在3000Da以下的肽具有降血压、抗氧化、降胆固醇等功能。在动物饲料中添 加小肽制品可有效避免游离氨基酸之间的竞争，提高饲料中蛋白质和微量元素的 利用率，促进动物生长，改善饲料报酬，提高动物的免疫力和抗应激能力。另外， 小肽不仅具有很好的溶解性、低粘度、抗凝胶形成性，可用来制作达到健康目标 的各种食品，且吸收速度快、耗能低、不易饱和，各种肽之间运转无竟争性与抑 制性，因此动物对肽的吸收比对游离氨基酸吸收更迅速，更有效。
目前，在医药生化制剂制造领域，应用生物与化学工程技术已开发出数百种 肽制品，作为多种生物活性因子、激素、受体、生物活性物的抑制剂、营养添加 剂等，其产品纯度高、功能确切，但价格十分昂贵。在动物饲料加工业领域，目 前也有一些通过水解、微生物发酵等工艺生产的蛋白质一肽一氨基酸混合制品， 但由于成分复杂，属于肽应用的初级产品。
因此，加强对饲料源活性肽的基础研究，对于开发生产经济实用的饲料肽产 品和进一步提高动物生产性能具有积极的现实意义。
技术问题
本发明的目的是提供"一种酶解饼粕蛋白生产词用混合小肽的方法"，克服 当前饲料蛋白源短缺、植物蛋白氨基酸不平衡以及抗营养因子问题，尤其对提高动物对蛋白质的消化吸收率提供了一种工艺简便、成本低廉、绿色环保型生物产 品，可用于大规模工业化生产，为畜禽及水产饲料提供一种新型蛋白源及添加剂。
技术方案
本发明所述的饲用混合小肽的制备方法，其步骤为
1) 将无霉变的豆粕和棉粕去除杂物，分别粉碎过ioo目筛，按一定比例充分混 合均匀后，按两种饼粕混合物与水质量比为1: (3 5)的比例将水加入复合饼 粕粉料中，搅拌均匀得到液态混合物；
2) 在液态混合物中加入NaOH溶液调节酸碱度维持反应体系的pH值在6.8 7.2 之间；
3) 按1500IU/g蛋白的比例加入枯草杆菌蛋白酶，在45 55'C条件下进行水浴反 应，反应时间为4 6h，得到反应后液态混合物；
4) 反应结束后，将反应后液态混合物放置于85T:以上温度下水浴灭活，然后冷 却，离心取其上层液体，干燥成干粉，即为混合小肽。
在步骤l)中，豆粕和棉粕按一定比例混合，其质量比最好为豆粕棉粕=
3: 7，在复合饼粕粉料中加入的水为去离子水，其最佳比例为复合饼粕粉料水 =1: 3。
在步骤2)中，在反应过程中不断搅拌，最好温度保持在5(TC，并加NaOH 溶液维持反应体系的pH值在7.0，反应时间为5h。
在步骤3)中，将反应后液态混合物置于85'C以上温度下，在容器中加热 10min进行灭活，然后采用离心等物理方法，取其上层液体部分干燥成混合小肽。
有益效果
本发明选用豆粕和棉粕，按特定比例混合后作为酶解底物，以内切蛋白微生 物酶类对饼粕蛋白进行酶解，通过正交试验设计，系统地分析得出制备高水解度 小肽的最佳酶解条件，为工业化生产饲用混合小肽提供了成熟的酶解工艺。
(1) 用枯草杆菌蛋白酶酶解豆粕和棉粕蛋白混合物，水解度(DH)非常高， 达到9;分子量小于3000Da的小分子蛋白质、肽等比例高达30%以上。表明枯草杆 菌蛋白酶对复合饼粕具有很强的酶解能力。
(2) 获得混合小肽的方法和程序简单易行枯草杆菌蛋白酶的酶解条件为 p朋.8 7.2，温度45 55X:，时间4 6h。条件温和，方法简便安全、高效，并 无副毒物产生，避免象酸碱水解而产生毒副产物和蛋白质变性，并可产生活性肽
(3) 资源丰富、价格低廉我国饼粕类蛋白资源非常丰富、价格低廉、蛋 白质含量高，是很好的动物饲料蛋白资源；同时，微生酶价格较低，并且活性较 强，适合应用于大规模生产。
(4) 营养价值高饼粕蛋白经过酶解之后，可溶性蛋白比例比原来增加了 1倍，其中，分子量小于3000Da的小分子蛋白比例高达32%。动物营养研究表明， 分子量在3000Da以下的肽，具有吸收速度快、耗能低、不易饱和，且各种肽之 间运转无竟争性与抑制性的特点。(5)经济环保该技术应用可实现使用饼粕蛋白资源部分或完全替代动物 蛋白资源的目标，既降低了生产成本，解决了动物蛋白资源短缺的问题，又对外 界环境无污染，是一种具有很高生态环境保护价值的新方法。
图混合小肽生产工艺图
具体实施例方式
将无霉变的豆粕和棉粕去除杂物，分别粉碎过100目筛，按3:7的比例充分 混合后，按3: 1的比例将去离子水加入复合饼粕粉料中，搅拌均匀得到液态混 合物。用NaOH溶液调节混合物pH值为7后，按1500IU/g蛋白的比例加入枯 草杆菌蛋白酶，在5(TC条件下水浴反应5小时。反应结束后，在85。C以上温度 下加热灭活10min，然后冷却，在室温3500r/min下离心10min，取上清液干燥， 即为混合小肽。通过高效液相色谱分析，混合小肽的分子量分布比例见表2。
表2混合小肽的分子量分布比例(%)
分子量1700Da-3443Da170Da-1700Da93Da-170Da<93Da
比例9. 3364.8121.084, 77
注Da表示道尔顿，是表示分子量大小的单位
饲用混合小肽的应用
1)混合小肽在异育银鲫肠道中的吸收机制
为了研究异育银鲫肠道完整吸收小肽与肠道中小肽的关系，用生理盐水和混合小肽进行 异育银鲫肠道灌注试验。20分钟后尾静脉采血制备血浆，高效液相色谱分析结果表明灌 注混合小肽溶液组异育银鲫血浆中小肽总量较灌注生理盐水组异育银鲫增加了 28.02% (分 子量180Da-1800Da)，如表3所示。说明异育银鲫血浆中肽量的增加与肠道提供的肽种类和 数量有关，异育银鲫肠道能够一定程度完整吸收某些小肽直接进入血液循环，进而快速高效 的被机体吸收利用。
表3异育银鲫血浆:中蛋白质组分峰面积比例(%)
分子量74Da-l,a180Da-1800Da1800Da-謂00Da
生理盐水组60. 0418. 0621.90
混合小肽组61.2023. 1315. 67
注Da表示道尔顿，是表示分子量大小的单位
2)混合小肽对石斑鱼的促生长作用以2%混合小肽、0.01%芽孢杆菌、0.2%菊糖、0. 01%芽孢杆菌和0. 2%菊糖混合物作为添 加剂添加到基础日粮中饲喂石斑鱼。养殖试验结束后发现，与其他组相比，添加混合小肽能 显著提高石斑鱼30天时的特定生长率(SGR)， 60天时的增重率(WGR)以及养殖期间石斑 鱼的饲料利用率(FCR)，见表4。
表4混合小肽对石斑鱼生产性能的影响(％)
组别30d SGR60d WGRFCR
基础饲料(对照组)147. 07 ±14. 76a199. 82 ±16. 97a37. 38±3. 83a
基础饲料+混合小肽163. 70±14. 51a248. 58 ±24. 52b39. 10±3. 9a
基础饲料+芽孢杆菌158, 85 ±12. 34a212. 25±5. 91ab36. 23±3. 37a
基础饲料+菊 糖152.91士11.01a213,62±29. 72ab36. 38±2. 36a
基础饲料+益生菌+糖155. 62±3. 14a215. 9±8. 23ab35. 24±1.15a
注同一列小写字母不同者差异显著(P<0.05),同一列小写字母相同者差异不显著(P〉0.05)。
3)混合小肽的抗应激作用
在曰粮中添加1%混合小肽，可以提高异育银鲫机体血液中超氧化物歧化酶活性，降低 乙酰胆碱酯酶和谷草转氮酶活性，对缓解异育银鲫热应激损伤，提高机体免疫力和抗氧化能
力具有良好的调控作用，见表5。
表5常温和热应激状态下异育银鲫血清中免疫酶活性(n=3)
组别超氧化物歧化酶乙酰胆碱酯酶谷草转氨酶
常温下 应激后常温下 应激后常温下 应激后
对照组 小肽组176.76±14.61Aa 73.41±1.20Ba 162.3 l士16.79Aa 153.74士3.60Ab3.54±0.37Aa 4.79±0.49Aa 2.33±0.21Aab 4.85±0.27Ba33.50±4.40Aab 58.73±5.90Ba 29.27±2.60Aab 37.50±0.29Ac
注同行(大写字母)和同列(小写字母)中数据字母不相同者差异显著(P〈0.05)，相同者差异不显著
(P>0.05)。
权利要求
1. 一种酶解饼粕蛋白生产饲用混合小肽的方法，是一种由复合饼粕蛋白经蛋白酶水解生成混合小肽的方法。
2. 如权利要求1所述的饲用混合小肽的制备方法，其特征在于其步骤为1) 将无霉变的豆粕和棉粕去除杂物，分别粉碎过ioo目筛，按一定比例充分混 匀后，按质量比复合饼粕水=1: 3 5的比例将水加入复合饼粕粉料中，搅拌 均匀得到液态混合物；2) 在液态混合物中加入NaOH溶液维持反应体系的pH值在6. 8 7. 2之间，按 1500IU/g蛋白的比例加入枯草杆菌蛋白酶，在45 55'C条件下进行水浴反应， 反应时间为4 6h，得到反应后液态混合物；3) 反应结束后，将反应后液态混合物放置于85'C以上温度下灭活酶活，然后冷 却，离心取其上层液体部分，干燥成干粉，即为混合小肽。
3. 如权利要求2所述的混合小肽的制备方法，其特征在于，在步骤l)中，混合 比例为豆粕棉粕=3: 7，在复合饼粕粉料中加入的水为去离子水，其比例为复 合饼粕粉料水=1: 3。
4. 如权利要求2所述的混合小肽的制备方法，其特征在于，在步骤2)中，在容 器中震荡的温度为50°C。
5. 如权利要求2所述的混合小肽的制备方法，其特征在于，在步骤1)中，用 Na0H溶液的pH至7.0。
6. 如权利要求2所述的混合小肽的制备方法，其特征在于，在步骤2)中，反应 时间为5h。
7. 如权利要求2所述的混合小肽的制备方法，其特征在于在步骤3)中，将反应 溶液置于85°C以上温度下加热10min进行灭活，然后3500r/min离心10min，取 其上层液体干燥，即为混合小肽。
8. 权求1-7之一所述方法获得的混合小肽产品。
9. 权利要求8所述混合小肽产品的应用。
全文摘要
本发明涉及“一种酶解饼粕蛋白生产饲用混合小肽的方法”，属于生物制品技术领域。采用的复合饼粕是按照豆粕∶棉粕＝3∶7的质量比例配置而成，使用的蛋白酶是指枯草杆菌蛋白酶；在pH＝7，温度50℃的条件下，反应5小时酶解生成混合小肽。该技术选用特定比例的复合饼粕作为酶解底物，以内切蛋白微生物酶类对饼粕蛋白进行酶解，通过正交试验设计，系统地分析得出制备高水解度小肽的最佳酶解条件。该技术一方面提升了饼粕蛋白的应用价值，另一方面精确地控制了酶解反应的进行，提高了植物蛋白肽的水解度，降低了小肽生产成本。获得具有高溶解度、低黏度等优良特性的混合小肽。
文档编号A23K1/16GK101530156SQ20091002945
公开日2009年9月16日 申请日期2009年4月14日 优先权日2009年4月14日
发明者刘文斌, 方星星, 丹 桂, 恬 王 申请人:南京农业大学