专利名称：猴头菇的液体深层发酵培养方法
技术领域：
本发明属于食用菌的培养方法，具体涉及猴头菇的液体深层发酵培养方法，还涉 及发酵培养用的培养基。
背景技术：
猴头菌(Hericium erinaceus)，因子实体形状酷似小猴子的头而得名。又称猴头 菇、猴头蘑、猥菌、对口蘑、喝巴拉(藏名)、山伏菌(日本)和熊头苗(欧洲)。(吕作舟， 食用菌栽培学，高等教育出版社，2006年，P262)。猴头菌是一种兼有食用和药用价值的名 贵食用菌，猴头菇多糖能明显抑制胃、食管、肝、皮肤癌的生长，(Mizimo，Τ. International Journal of Medicinal Mushrooms 1，1999. pl05_119.)它的主要活性成分有三种: β -D-葡聚糖，具有抗肿瘤功效；麦角固醇，是维生素D的前体物质；Cyathane衍生物，是一 种神经生长刺激因子。(Smith 等.cancer research UK. 2002. p41_42)。猴头菌的生产途径主要有三种一、人工栽培，其优点是简单易行，成本低。其缺点 是栽培周期长，整个生产周期约3个月。(张金霞，食用菌安全优质生产技术，中国农业出 版社，2004，P191-201) ；二、固体发酵，用固体培养基培养猴头菌菌丝体，以获得次生代谢产 物。菌丝长满培养基约需30天，继续培养10天左右，pH降至4左右开启棉塞，挖出菌质， 晒干供提取用。它的优点①培养基简单且来源广泛，价格便宜；②发酵过程一般不需要严 格的无菌操作；③培养过程供氧和温度可以采用直接空气强制通风来控制；④发酵残渣的 处理简单，可直接作为饲料或肥料。但其缺点明显①培养基水分活度低，培养基不均勻且 不易搅拌，菌体的生长、对营养物质的吸收和代谢产物的分泌都不均勻，使得发酵参数的检 测和控制困难，也使得连续操作和自动化很困难；②微生物呼吸和代谢所产生热量的温度 控制非常困难，因为固体培养基的热传导性差；③由于对影响固态的因素了解不够，培养方 法大多基于经验数据和操作的经验，与液体深层发酵相比，劳动强度大，占地面积大，易污 染杂菌。三、液体深层发酵，最早报道于20世纪80年代末，研究内容包括营养需要、环境因 子、发酵工艺等，以获得最佳操作条件在较短时间内生产大量的菌丝体与代谢产物。优点 ①可以进行工业化连续生产，通过控制最佳条件来培养菌丝体，生产工艺规范；②培养原料 来源广泛，价格便宜；③通过控制发酵罐的通气搅拌系统、温度调节系统、PH值调节系统和 培养基补给系统等装置，培养条件最佳，发酵周期短，生产效率高。(杨海龙等。药用真菌深 层发酵生产技术，化学工业出版社，2009年，pl4-17，p212)，但是目前的液体深层发酵方法 (李宇伟等。猴头菌液体培养产多糖条件优化的研究，食用菌，2008 (3)，pl5-16)菌丝体生 物量在6g/L左右，产量较低，因此亟须筛选新的猴头菌菌株以及菌丝体产量高的发酵培养 方法。
发明内容
本发明目的在于解决猴头菇生产方法中存在的菌丝体生物产量低的问题，提供一 种猴头菇的液体深层发酵培养方法。
本发明第二目的是提供一种猴头菇液体深层发酵用的液体种子培养基。本发明第三目的是提供一种猴头菇液体深层发酵用的液体发酵培养基。本发明第四目的是提供一个猴头菇菌株。为实现上述目的，本发明的技术方案为猴头菇的液体深层发酵培养方法，包括如下步骤(1)菌种活化按照3 5%的重量比将猴头菇菌种接种于斜面培养基上，在22 26°C下培养12 16d，得活化的猴头菇菌种；所述的斜面培养基的组成成份及其含量为马 铃薯(取汁)180 220g/L,葡萄糖18 22g/L，琼脂15 20g/L,其余为水；(2) 一级菌种培养接取活化的猴头菇菌种，捣碎，按照3 6g/L的比例将活化的 猴头菇菌种接种于液体种子培养基中，在22 26°C、转速为120 ISOrpm条件下培养4 7d，得一级菌种；所述的液体种子培养基的组成成份及其重量比为葡萄糖1 3%、玉米 淀粉0. 01 0. 1%、麦麸0. 1 0. 5%、蛋白胨0. 1 0. 3%、酵母粉0. 2 0. 4%、KH2PO4
0.05 0. 2%,MgSO4 · 7H20 0. 01 0. 1 %、VB1 为 8 15mg/L，其余为水；(3) 二级菌种培养按照8 15%的体积比将步骤(2)所得一级菌种接种于液体 发酵培养基中，在24 28°C、压力为0. 05MPa、通风量为每分钟罐容积的50 100%条件下 培养3 6d，得二级菌种；所述液体发酵培养基的组成成份及其含量为葡萄糖20 30g/ L,玉米淀粉0. 05 0. 2g/L，酵母粉2 4g/L，蛋白胨2 4g/L，麦麸0. 5 1. 5g/L，KH2PO4
1.Og/L，MgSO4 0. 5g/L，其余为水；(4)发酵罐放大培养按照8 15%的体积比将二级菌种接种于液体发酵培养基 中，在24 28°C、压力为0. 05MPa、通风量为每分钟罐容积的50 100%条件下培养6 10d，得猴头菇菌丝体；所述的液体发酵培养基的组成成份及其含量同步骤(3)。上述发酵培养方法中所述的猴头菇菌种可以是通常生产上所用的猴头菇 (Hericium erinaceus)菌种、或者所采集的里予生猴头 (Hericium erinaceus)菌禾中。上述发酵培养方法中所述的猴头菇菌种是指猴头菌(Hericium erinaceus)中农 猴头1，已于2009年12月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保 藏编号为CGMCC 3536。上述发酵培养方法步骤(1)中所得的猴头菇菌种的大小为3-5X3_5mm。上述发酵培养方法步骤(2)中所述的液体种子培养基的装液量为罐容积的40%。上述发酵培养方法步骤(3)或(4)中所述的液体发酵培养基的罐装液量为罐容积 的60 80%。所述的液体种子培养基的制备方法，包括按照上述重量比将为葡萄糖、玉米淀粉、 麦麸、蛋白栋、酵母粉、KH2PO4, MgSO4 · 7H20和VB1加入水中，搅拌均勻，然后用水定容，再在 121°C，灭菌30min即可。所述的液体发酵培养基的制备方法，包括按照上述重量比将葡萄糖、玉米淀粉、酵 母粉、蛋白栋、麦麸、KH2PO4和MgSO4 · 7H20加入水中，搅拌均勻，然后用水定容，在121°C，灭 菌30min即可。本发明所得的猴头菇菌丝体可用于生产保健食品、食品添加剂、饮料等。本发明中所述的猴头菌、猴头菇、猴头蘑、猥菌、对口蘑、喝巴拉(藏名)、山伏菌 (日本)和熊头苗(欧洲)等名称都是指猴头菌(Hericium erinaceus)。
本发明具有的优点(1)、本发明方法猴头菌菌丝体生物产量高，可达12g/L，是 目前工厂发酵生产水平的2倍以上。(2)本发明猴头菌菌株中农猴头1生长速度快，可达 5. 8mm/d ； (3)本发明提供的种子和发酵培养基效果好，可使猴头菇菌丝体产量高。
图18个猴头菇菌株菌丝体生物量、胞外多糖的利率、胞内多糖含量对比柱形图。图2中农猴头1的rDNA_IGS2区域PCR扩增片段电泳图谱。
具体实施例方式实施例1猴头菌菌株中农猴头1的筛选以32个猴头菌株(3个来自中国农业科学院农业资源与农业区划研究所；4个来 自中国农业科学院蔬菜花卉研究所；其它引自上海农科院食用菌所、福建三明真菌研究所、 吉林省、江苏省等地(具体地点不可知)，所述的32个猴头菌株均为野生种)为材料，在 Difco PDA 培养基(一种标准培养基，德国生产)上25士0.1°C培养7天，测量菌落直径， 菌丝生长速度=菌落直径/7d，结果(见表1)显示由中国农业科学院农业资源与农业区划 研究所采自东北长白山的第18号菌株生长速度最快，说明它的活力比较强。将18号菌株 与其它7个菌株进行液体摇瓶培养，测定它们的菌丝体生物量、胞外多糖的利率、胞内多糖 的含量等，结果(见图1)这三项指标综合评价最优的是第18号菌株，将18号菌株定名为 中农猴头1。表1猴头菌32个菌株的菌丝生长速度
权利要求
猴头菇的液体深层发酵培养方法，包括如下步骤(1)按照3～5％的重量比将猴头菇菌种接种于斜面培养基上，在22～26℃下培养12～16d，得活化的猴头菇菌种；所述的斜面培养基的组成成份及其含量为马铃薯180～220g的汁液/L，葡萄糖18～22g/L，琼脂15～20g/L，其余为水；(2)接取活化的猴头菇菌种，捣碎，按照3～6g/L的比例将活化的猴头菇菌种接种于液体种子培养基中，在22～26℃、转速为120～180rpm条件下培养4～7d，得一级菌种；所述的种子培养基的组成成份及其重量百分比为葡萄糖1～3％、玉米淀粉0.01～0.1％、麦麸0.1～0.5％、蛋白胨0.1～0.3％、酵母粉0.2～0.4％、KH2PO4 0.05～0.2％、MgSO4·7H2O 0.01～0.1％、VB1为8～15mg/L，其余为水；(3)按照8～15％的体积比将步骤(2)所得的一级菌种接种于发酵培养基中，在24～28℃、压力为0.05MPa、通风量为每分钟罐容积的50～100％条件下培养3～6d，得二级菌种；所述发酵培养基的组成成份及其含量为葡萄糖20～30g/L，玉米淀粉0.05～0.2g/L，酵母粉2～4g/L，蛋白胨2～4g/L，麦麸0.5～1.5g/L，KH2PO41.0g/L，MgSO40.5g/L，其余为水；(4)按照8～15％的体积比将二级菌种接种于液体发酵培养基中，在24～28℃、压力为0.05MPa、通风量为每分钟罐容积的50～100％条件下培养6～10d，可得猴头菇菌丝体。
2.按照权利要求1所述的发酵培养方法，其特征在于其步骤(1)中所述的猴头菇菌种 的大小为3-5X3-5mm。
3.按照权利要求1或2所述的发酵培养方法，其特征在于其步骤(2)中所述的液体种 子培养基装液量为罐容积的40%。
4.按照权利要求3所述的发酵培养方法，其特征在于其步骤(3)或(4)中所述的液体 发酵培养基的罐装液量为罐容积的60 80%。
5.一种猴头菇(Hericium erinaceus)菌株中农猴头1，已于2009年12月23日在中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC 3536。
6.一种猴头菇的液体种子培养基，其特征在于其组成成份及其重量比为葡萄糖1 3%、玉米淀粉0. 01 0. 1%、麦麸0. 1 0. 5%、蛋白胨0. 1 0. 3%、酵母粉0. 2 0. 4%, KH2PO4 0. 05 0. 2%,MgSO4 · 7H20 0. 01 0. 1 %、VB1 为 8 15mg/L，其余为水。
7.一种猴头菇的液体发酵培养基，其特征在于其组成成份及其含量为葡萄糖20 30g/L，玉米淀粉0. 05 0. 2g/L，酵母粉2 4g/L，蛋白胨2 4g/L，麦麸0. 5 1. 5g/L， KH2PO4L Og/L, MgSO4O. 5g/L，其余为水。
全文摘要
本发明公开了一种猴头菇的液体深层发酵培养方法，属于食用菌的培养方法领域。本发明培养方法是将猴头菇菌种在斜面培养基上进行活化，然后在液体种子培养基上进行一级菌种培养，再在液体发酵培养基上进行二级菌种培养，最后在液体发酵培养基上进行扩大培养，可得猴头菇菌丝体。本发明还公开了一个猴头菌菌种中农猴头1，以及用于猴头菇培养的种子培养基和发酵培养基。本发明培养方法所得的猴头菌菌丝体生物产量高，可达12g/L，是目前工厂发酵生产水平的2倍以上；其次本发明猴头菌菌株中农猴头1生长速度快，可达5.8mm/d；此外，本发明的液体种子培养基和发酵培养基培养效果好，使猴头菇菌丝体生长快、产量高。
文档编号C05G1/00GK101971762SQ20101010962
公开日2011年2月16日 申请日期2010年2月9日 优先权日2010年2月9日
发明者张金霞, 陈强, 高巍, 黄晨阳 申请人:中国农业科学院农业资源与农业区划研究所