专利名称：一种生物有机肥发酵菌种的制备方法
技术领域：
本发明涉及的是农业生物有机肥生产技术，特别是一种固态发酵制备烟草秸秆生 物有机肥的菌种制备方法。
背景技术：
烟草是一种重要的经济作物，在国民经济中具有十分重要的作用。在我国烟草种 植生产过程中，长期以来以化学肥料为主，造成土壤有机质数量锐减，团聚体数量和质量下 降，通气性退化，影响烟叶生产的产量和质量。另外，当烟叶采收后，在烟田中丢弃大量的废 弃烟草秸秆，最长时间可达五个月，增加次年烟田病虫害，污染烟田生态环境。按照行业规 定，应该集中烟草秸秆焚烧处理，但这样会增加(X)2排放量，造成大气环境污染。是一种不 得而为之的办法。
现有技术中有借用一般农作物秸秆固体发酵技术把烟草秸杆发酵变成生物有机 肥方法，但因烟草秸秆含有大量烟碱、又带有大量有害病菌和病毒，这种方法没有优选选微 生物菌种，效果不好。常用的发酵细菌不适合在具有大量烟碱物质的条件下生存，不能够进 行有效发酵转化，所以现有方法难于解决上述问题。如果能寻找一种耐强烟碱高温微生物， 具有在大量烟碱物质的条件下生存的发酵细菌，进行固态发酵，将废弃烟草秸秆转化成一 种安全的生物有机肥，部分替代化学复合肥，回填到烟田。把烟草生产中的病虫害、土壤退 化、环境保护、资源利用和烟叶质量问题一并考虑，并加以利用。这样，大大地有利于改善环境。 发明内容
本发明的目的是提出一种能够在高温重烟碱条件下生存的固态发酵菌种的制备 方法。将该耐温耐烟碱的固态发酵菌种经培养和扩繁后，加入到废弃的烟草秸秆混合物中， 在自然条件下进行固态发酵，将烟草秸秆废弃物转化为烟草秸秆生物有机肥。
具体步骤为
1、菌株分离筛选从不同地区烟田的烟草秸秆中，分别取样加入到含有烟碱的葡 萄糖、蛋白胨，酵母膏，无机盐的液体培养基中，在50 60°C高温下，培养48小时。将培养 液稀释，涂布于含烟碱的蛋白胨，酵母膏的琼脂培养皿中，在25 35°C下，培养M 36小 时。挑取单菌落，分别并同时接种到蛋白胨、酵母膏、无机盐的同一编号的液体或固体培养 基中，在30°C下，培养对 30小时。提取离心上清培养液，加入链霉素、青霉素和羧甲基纤 维素，在50°C下，保温18小时，测定还原糖含量，分离筛选出、和D1菌株。
2、菌株分类鉴定及保藏
根据伯捷氏手册(第七版)和16SrRNA基因顺序测定对、和D1进行菌株的分类鉴定。
S4菌根据、菌的菌落形态，细胞形态，生理生化试验和16SrRNA基因序列测定结 果，S4菌为角军淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens S4)。
该菌株于2010年9月沈日保藏于中国湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物 保藏中心，名称为解淀粉芽孢杆菌、，保藏号CCTCC NO. M 2010249)。
该菌株的菌学特性。菌落粗糙，不透明，扩张，微带黄色，细胞直径< lym，杆状， 着色均勻，无夹膜，运动，革氏染色呈阳性；形成芽孢，芽孢椭圆形，中生不膨大，无伴孢晶 体，接触酶和氧化酶呈阳性，VP试验呈阳性，甲基红试验呈阳性，厌氧生长，可利用葡萄糖， 木糖，甘露糖，L-阿拉伯糖，并产酸，水解淀粉，分解酪素；不能利用乳糖，柠檬酸盐，硝酸盐 还原试验均为阳性；5°C下生长，7% NaCI下生长，PH5. 7生长，VPPH < 6阳性，VPPH > 7阴 性。
该菌能在烟碱存在的条件下生长。
D1菌根据D1菌的菌落形态，细胞形态，生理生化试验和16SrRNA基因序列测定结 果，D1 菌为短杆菌(Brevibacterium spDl)。
该菌株于2010年9月沈日保藏于中国湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物 保藏中心，名称为短杆菌D1,保藏号=CCTCC NO. M 2010250)。
该菌株的菌学特性。菌落粗糙，不透明，扩张，污白色、细胞杆状、着色均勻，革兰氏 染色呈阳性，无芽孢，接触酶呈阳性、氧化酶呈阴性、可利用甘油、L-阿拉伯糖、核糖、D-木 糖，半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露醇、鼠李糖、D-塔格糖、L-阿拉伯糖醇、葡萄糖酸盐、2-酮 基-葡萄糖酸盐并生长，硝酸盐还原呈阳性，不能利用D-阿拉伯糖，赤癣糖、L-木糖，山梨 糖、山梨醇、肌醇，卫茅醇，阿东醇，乳糖、麦芽糖，密二糖，蔗糖，海藻糖，棉子糖，木糖醇， D-来苏糖，D-岩藻糖L-岩藻糖，L-阿拉伯糖醇，和糖原，不水解淀粉，α甲基-D-甘露糖， N-乙酰-葡萄胺，苦杏仁甙，熊果糖甙，β -甲基-D-木糖甙，5-酮基-葡萄糖酸试验均为 阴性。
该菌能在烟碱存在的条件下生长。
3、种子培养。以D1菌和、菌作为菌种，在种子三角瓶或发酵罐中加入培养基MD， 其成分和比例如表1。
表1菌株液体培养基
权利要求
1.一种生物有机肥发酵菌种Dl短杆菌，其保藏编号为CCTCC No. M 2010250。
2.一种生物有机肥发酵菌种S4解淀粉芽孢杆菌，其保藏编号为CCTCC No.M2010249o
3.—种生物有机肥发酵菌种的制备方法，其特征在于制备步骤为1)、种子培养，以权利要求1、权利要求2所述的菌种Dl菌和S4菌作为菌种，在种子三 角瓶中进行种子培养，在种子三角瓶内加入培养基MD，其成分和比例如下表序号名称质量百分数，％备注1葡萄糖0.7 1.0控制PH在6.7 8.0之间。2蛋白胨0.6 0.83酵母膏0.3—0.54NaCl0.2 0.45KH7PO4O 0.26纯水98 83种子培养条件培养基灭菌后接入斜面母种，在观 30°C下，振荡培养16 22小时；2)、扩繁培养，在发酵罐中加入培养基MD，灭菌后按照发酵罐培养基MD的3 8%体积 比接入上述培养物混合后作种子，扩繁培养条件罐压为0. 4 0. 6Mpa,罐温为28 30°C， 空气流量为0. 3 0. 6 (v/v/min)，搅拌器转速为200rpm，扩繁培养18 M小时，当培养液 的OD值为0D600nm下降0. 02时终止发酵；3)、产品培养，在大型发酵罐中加入培养基MD，灭菌后按照发酵罐培养基的3 8% 体积比接入扩繁培养的培养物作液体种子，产品培养条件罐压为0. 4 0. 6Mpa，罐温为 28 30°C，空气流量为0. 3 0. 6 (v/v/min)，搅拌器转速为140 200rpm，产品培养18 24小时；当培养液的OD值为0D600mn下降0. 02时终止发酵；4)、将上述发酵培养物经膜滤浓缩1 8倍，检测得液态菌剂；或将上述发酵培养物经 膜滤浓缩1 8倍后，加入分散剂，进一步干燥得固态菌剂产品。
4.根据权利要求1或2的一种生物有机肥发酵菌种能够单独使用，或者联合使用，联合 使用的比例为讽菌、菌=1 4 1。
全文摘要
本发明提出了一种烟草秸秆生物有机肥发酵菌种短杆菌D1(Brevibacterium sp D1，保藏为CCTCC NoM 2010250)和解淀粉芽孢杆菌S4(Bacillus amyloliquefaciens S4，保藏为CCTCC NoM 2010249)，它们是从烟草秸秆中在高温重烟碱条件下分离筛选出的，能够在烟碱存在的条件下生存，经培养和扩繁后，加入到废弃的烟草秸秆混合物中，在自然条件下进行固态发酵，将烟草秸秆废弃物转化为烟草秸秆生物有机肥。该烟草秸秆生物有机肥可以代替其他肥料进行烟草生产，可以增加烟叶产量、增加烟叶产值和改善烟叶评吸质量，同时也消除了烟草秸秆废弃物对环境的污染。
文档编号C05F11/08GK102031233SQ20101053812
公开日2011年4月27日 申请日期2010年10月27日 优先权日2010年10月27日
发明者李锡宏, 杨树, 祖秉桥, 陈家任, 高勇 申请人:中国烟草总公司湖北省公司