专利名称：一种急性Stanford A型主动脉夹层伴MODS动物模型的建立方法
技术领域：
本发明涉及一种急性Manford A型主动脉夹层伴MODS动物模型的建立方法。
背景技术：
急性主动脉夹层(aortic dissection，AD)是指在主动脉中层发生撕裂后，血液通过内膜中膜的撕裂口进入假腔，它是心血管外科危重急症，进展快，死亡率高，早期病死率约每小时1%，48小时内死亡率可高达50%。主动脉夹层的分型有很多种，就指导临床治疗来讲，Manford分型最常用也最有价值。Manford A型主动脉夹层指病变累及升主动脉伴或不伴有累及降主动脉，Stanford B型主动脉夹层指病变仅累及降主动脉。主动脉夹层发生后，动脉血流持续进入假腔，动脉壁进行性剥离，假腔持续扩大。假腔内压力增高，体积增大，压迫真腔使前向血流减少，远端缺血；或者压迫主动脉重要分支，致使重要器官缺血；加之其他继发性损害，最终造成多器官功能不全综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS), MODS是导致患者死亡的重要原因之一。关于主动脉夹层发生MODS研究的相关文献报道不多，但其他引起MODS严重疾病(如急性坏死性胰腺炎等)的相关研究表明，全身炎性反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)常常为任何原因造成的MODS的前奏。因此，建立一个急性AD伴MODS的动物模型，是研究炎性反应在 AD及其MODS发生、发展中作用的重要基础研究工作。早在1959年，Blanton FS等用手术方法建立AD模型。近年来随着介入技术的发展，也有学者用介入的方式进行AD的制作并获得成功。但是这些模型均局限于Manford B型AD，而且存在夹层撕裂程度有限，手术成功率不高，难于建立急性Manford A型AD伴 MODS。目前的文献检索表明，能够模拟临床发病急、进展快、死亡率高的急性AD伴MODS的动物模型尚无成功的报道，而深入研究急性AD发生发展的机制，寻求干预的关键环节，发展临床治疗的新技术新方法，则迫切需要建立动物模型。构建主动脉夹层动物模型的方法最早可以追溯到1952年，Blanton FS等第一次用手术开胸的方法尝试建立夹层模型。他们通过开胸暴露主动脉，手术切开主动脉壁，将切口远端的主动脉壁中层进行钝性分离，并把远端外中层缝合至近端动脉的全层，从而造成主动脉夹层模型。此方法虽然成功复制出主动脉夹层的模型，但复制出来的夹层假腔较短，手术的成功率不高，未伴发MODS。此后的几十年，模型制作均为参考Blanton FS手术的方法来制作主动脉夹层，模型没有大的发展。随着介入技术的提高，越来越多的学者开始采用此方法来制作主动脉夹层。2002年，二军大汤敬东等尝试用介入的方法来复制夹层模型。他们以一个可以调整角度的穿刺针为材料，在 X线透视帮助下，将穿刺针经实验动物髂总动脉或腹主动脉导入至胸主动脉，通过调整穿刺针的角度，使针头刺破主动脉中膜并注射生理盐水和弹力蛋白酶来制作夹层，此种方法制作夹层模型的成功率较低，制作的夹层不够明显；而且该方法需要很好的介入技术，对操作者的技术要求较高，稍有不慎即可导致动脉破裂。另外有人采用开胸暴露主动脉，分离动脉间隙，然后用i^rgarty导管球囊分离动脉的间隙，形成动脉夹层。
虽然前人对主动脉夹层模型的制作进行了有益的尝试，但是这些模型均存在夹层撕裂长度有限，夹层制作成功率不高等缺点，而且这些模型均Stanford B型夹层。对于A 型夹层的制作未见相关报道，关于夹层制作后伴发MODS更无相关记载。因此，急性主动脉夹层的应用基础与临床研究迫切需要建立能够模仿人类急性Manford A型主动脉夹层病理解剖与病理生理的实验动物模型。
发明内容
本发明的技术方案是提供了一种急性Manford A型主动脉夹层伴MODS动物模型的建立方法。本发明的另一技术方案是提供了一种筛选治疗急性Manford A型主动脉夹层伴MODS药物的方法及药物大黄素的新用途。本发明提供了一种急性Manford A型主动脉夹层伴MODS动物模型的建立方法， 它包括如下步骤a、取实验犬，暴露升主动脉；b、在升主动脉起始部远端约2cm的部位，侧壁钳纵行钳夹主动脉侧壁约1/2周径， 小圆刀片横行切开外膜及部分中膜宽达升主动脉周径的1/2 ；找到中膜间隙，松开侧壁钳， 使用纹氏钳尖部沿中膜间隙，向远心端钝性轻柔分离，纵长约Icm ；C、插入连接注射器的Φ2. 5mm微泵延长管，高压快速推注生理盐水，利用生理盐水压力的冲击力量扩大夹层范围，直至剥离长度约5cm;假腔内注入弹力蛋白酶(200u加入 2ml生理盐水中)，压迫主动脉切口，使之在假腔中留置约5分种；d、再次钳夹侧壁钳，切开内层的中膜及内膜，使主动脉腔与外界相通，扇形剪除夹层切口远心端部分中膜及内膜，6-Oprolene线缝合切口近心端主动脉壁全层及远心端外膜及部分中膜，使血液能够持续进入假腔；e、松开侧壁钳，再次加强缝合切口，止血；夹层制作完成，逐层关胸，缝合胸壁；f、连接微量泵，静脉泵入肾上腺素升高血压，使实验动物收缩压维持于250 260mmHg 之间。本发明还提供了该方法制备的动物模型在筛选治疗急性Manford A型主动脉夹层伴MODS的药物中的用途。本发明提供了一种筛选治疗急性Manford A型主动脉夹层伴MODS药物的方法， 包括如下步骤①、建立急性Manford A型主动脉夹层伴MODS动物模型；②、将候选药物施用于动物模型；③、观察候选药物对急性Manford A型主动脉夹层伴MODS的影响情况，并进行评分，评价潜在治疗急性Manford A型主动脉夹层伴MODS的药物。其中，①步骤所述的急性Manford A型主动脉夹层伴MODS动物模型的建立方法为a、取实验犬，暴露升主动脉；b、在升主动脉起始部远端约2cm的部位，侧壁钳纵行钳夹主动脉侧壁约1/2周径， 小圆刀片横行切开外膜及部分中膜宽达升主动脉周径的1/2 ；找到中膜间隙，松开侧壁钳， 使用纹氏钳尖部沿中膜间隙，向远心端钝性轻柔分离，纵长约Icm ；
C、插入连接注射器的Φ2. 5mm微泵延长管，高压快速推注生理盐水，利用生理盐水压力的冲击力量扩大夹层范围，直至剥离长度约5cm;假腔内注入弹力蛋白酶(200u加入 2ml生理盐水中)，压迫主动脉切口，使之在假腔中留置约5分种；d、再次钳夹侧壁钳，切开内层的中膜及内膜，使主动脉腔与外界相通，扇形剪除夹层切口远心端部分中膜及内膜，6-Oprolene线缝合切口近心端主动脉壁全层及远心端外膜及部分中膜，使血液能够持续进入假腔；e、松开侧壁钳，再次加强缝合切口，止血；夹层制作完成，逐层关胸，缝合胸壁；f、连接微量泵，静脉泵入肾上腺素升高血压，使实验动物收缩压维持于250 260mmHg 之间。其中，所述的药物是大黄素。本发明还提供了大黄素在制备治疗急性Manford A型主动脉夹层伴MODS和药物中的用途。所述的药物中大黄素的使用剂量为200mg/kg。本发明还提供了一种急性Manford A型主动脉夹层伴MODS的脏器保护剂，它是由有效量的大黄素为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。其中，所述的制剂是口服制剂。本发明通过改良AD手术制作方法，同时借助静脉持续泵入肾上腺素形成人工控制性高血压，促进AD剥离范围的扩大和加速病程进展，以快速形成急性Manford A型AD 伴MODS为制作成功模型的目标，本发明急性Manford A型AD伴MODS的动物模型为进一步深入应用基础研究与干预治疗研究创造条件。
图1夹层制作成功，中层分离，假腔形成，黑色箭头所指为夹层撕裂部位，宽度接近主动脉周径的1/2。图2显微镜下放大100倍观察，可见夹层撕裂位于主动脉壁中层。图3显微镜下放大400倍观察，可见主动脉壁中层弹力纤维断裂，炎性细胞浸润。图4实验组大体解剖观察图5对照组大体解剖观察图6实验组显微镜观查(X 100)图7对照组显微镜观查(X 100)图8实验组显微镜观察(X 400)图10实验组大体解剖观察图12实验组显微镜观察(X 100)
图14实验组显微镜观察(X 400)图16实验组大体解剖观察图18实验组显微镜观察(X 100)图20实验组显微镜观察(X 400)图22实验组大体解剖观察图M实验组显微镜观察(X 100)
图9对照组显微镜观察(X400) 图11对照组大体解剖观察图13对照组显微镜观察(X 100) 图15对照组显微镜观察(X400) 图17对照组大体解剖观察图19对照组显微镜观察(X 100) 图21对照组显微镜观察(X400) 图23对照组大体解剖观察图25对照组显微镜观察(X 100)
图沈实验组显微镜观察(X 400)图28肠大体解剖观察实验组图30实验组显微镜观察(X 100)图32实验组显微镜观察(X 400)图34肺大体解剖观察实验组图36实验组显微镜观察(X 100)图38实验组显微镜观察(X 400)
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图27对照组显微镜观察(X400) 图四脏器保护剂组图31脏器保护剂组显微镜观察(X 100) 图33脏器保护剂组显微镜观察(X400) 图35脏器保护剂组图37脏器保护剂组显微镜观察(X 100) 图39脏器保护剂组显微镜观察(X400)
说明书
具体实施例方式实施例1本发明急性Manford A型主动脉夹层伴MODS动物模型的建立方法1 材料1. 1实验动物健康成年Beagle犬18只，雌雄不拘，体重8 12kg，平均8. 95 士0.72kg。术前每只动物分笼独养，室温23 25°C，自由摄食、进水，12小时光照/黑暗。犬由四川大学华西临床医学院/华西医院中医药安全性评价中心提供，并由四川大学华西临床医学院/华西医院实验动物中心动物房按实验动物要求专人饲养。1. 2主要实验试剂及药品1)肝素钠(上海生物化学制药厂)2)青霉素钠(华北制药)3)肾上腺素(上海禾丰制药有限公司)4)戊巴比妥钠(上海化学试剂公司)5)阿托品(杭州海阳医药化工有限公司)6)福尔马林(新乡市新龙化工有限公司)7)平衡液(成都利康药品有限公司)1. 3主要实验仪器及设备1)手术器械(上海金钟医疗器械公司)2)高频电刀(美国威利高频电刀)3)电动吸引器(上海医疗器械工业公司)4)麻醉机(Excel 210 SE Datex-Ohmeda)5)呼吸机(S900C西门子公司)6)微量注射泵(上海安吉电子设备有限公司产品)7)血气分析仪(i-STAT美国雅培便携式血气分析仪)8)倒置相差显微镜(OLYMPUS 1X7042)9)高速离心机(美国科峻仪器公司)10)全自动生化分析仪(德国利霸全自动生化仪)2 方法2. 1实验准备所有操作均在华西临床医学院/华西医院科技园麻醉与危重急救研究室进行。实验动物术前晚禁食、晨禁饮，以免麻醉后引起胃内容物返流致呼吸道阻塞。术前
7备皮，范围为胸骨正中及双侧腹股沟手术切口为中心的IOcm区域。术前半小时肌肉注射阿托品0. 02mg/kg,以减少气管内分泌物，防止气道阻塞，并便于插管时充分暴露气管开口。麻醉前先将动物固定在固定架上，穿刺左上肢肘正中静脉，置入并固定静脉留置针，3%戊巴比妥钠(25mg/kg)行静脉麻醉，青霉素钠万u/kg)静脉推注预防感染，并静滴平衡液。静脉麻醉成功后犬仰卧位，头颈部略低于身体平面，使用带气囊的7F硅胶气管插管，喉镜引导下直视经口插管建立人工气道。插入深度一般为22 ^cm,当听见犬有轻微呛咳声或看见气管插管内壁随呼吸有雾气显现时，表示插管成功。用听诊器听诊双肺呼吸音是否清晰及对称，确定气管插管的位置。从插管气囊内推注5ml空气后固定气管插管，用约束带将气管插管妥善固定于犬嘴上。气管插管连接呼吸机进行人工辅助机械通气，呼吸机参数设置为吸入氧浓度 100%，呼吸频率20次/分，潮气量15ml/kg。犬舌头帖置氧饱和探头，四肢留置心电电极片，连接生命监护仪。行一侧股动脉穿刺置管，连接压力换能器监测血压。按研究设计的各时间点抽取动脉血进行血气分析。另一侧股静脉行中心静脉穿刺置管，用于静脉输液和采集静脉血标本。2. 2实验分组本部分实验分为两组实验组(正中开胸手术制作升主动脉夹层并进行人工控制性高血压，6只)，对照组(正中开胸并进行人工控制性高血压，开胸手术中不进行手术制作升主动脉夹层，6只)。2. 3实验组建立急性主动脉夹层模型的方法常规消毒铺巾，胸部正中切口，逐层切开皮肤、皮下、肌肉层，线锯锯开胸骨，悬吊心包，暴露升主动脉。在升主动脉起始部远端约2cm的部位，侧壁钳纵行钳夹主动脉侧壁约 1/2周径，小圆刀片横行切开外膜及部分中膜宽达升主动脉周径的1/2。找到中膜间隙，松开侧壁钳，使用纹氏钳尖部沿中膜间隙，向远心端钝性轻柔分离，纵长约1cm。插入连接注射器的Φ2. 5mm微泵延长管，高压快速推注生理盐水，利用生理盐水压力的冲击力量扩大夹层范围，直至剥离长度约5cm。假腔内注入弹力蛋白酶(200u加入2ml生理盐水中)，压迫主动脉切口，使之在假腔中留置约5分种。再次钳夹侧壁钳，切开内层的中膜及内膜，使主动脉腔与外界相通，扇形剪除夹层切口远心端部分中膜及内膜，6-Oprolene线缝合切口近心端主动脉壁全层及远心端外膜及部分中膜，使血液能够持续进入假腔。松开侧壁钳，再次加强缝合切口，仔细止血。夹层制作完成，逐层关胸，缝合胸壁。连接微量泵，静脉泵入肾上腺素升高血压。肾上腺素配制方法为动物的体重X0. 03mg加入50ml生理盐水中，初始以2ml/h泵入，实验过程中根据收缩压调整肾上腺素的泵入量，使实验动物收缩压维持于 250 ^OmmHg 之间。2. 4对照组的建立方法麻醉及手术准备同实验组，手术仅行开胸，悬吊心包，钳夹升主动脉壁及人工控制性高血压，手术中不进行升主动脉夹层的手术制作。肾上腺素配制及泵入方法、剂量调整同实验组，动物收缩压维持于250 ^OmmHg之间。2. 5血液标本的采集及检测采集分别于麻醉后开胸手术前(Tl)，手术操作结束时(T2)，手术后2小时(T3)，手术后4小时(T4)，手术后6小时(仍)共5个时间点从股动脉穿刺置管中采集动脉血标本行动脉血气分析及通过中心静脉置管抽取静脉血标本行肝肾功能的检测。检测动脉血气分析使用一次性专用动脉采血针，抽取Iml动脉血，10分钟内于 i-STAT美国雅培便携式血气分析仪中进行检测并根据体温进行校正。血浆取静脉血5ml置入EDTA抗凝管中，混勻，然后3000转/分高速离心15分钟，取上清液体，4°C冰箱冷藏保存，并于1周内送四川大学华西临床医学院/华西医院中医药安全性评价中心生化实验室行肝肾功能的检测。2. 6病理标本的采集及分析所有实验动物均于手术后6小时(T5时间点)急性期处死，切除全部主动脉，解剖主动脉夹层统计夹层撕裂长度；切除肺组织(全部左上肺)、小肠(肠系膜前动脉供应区域)、左半肝、左肾行大体观察，并保留主动脉夹层、肺、肠道、肝及肾标本福尔马林中固定、 保存，病理切片显微镜下观察。3统计学处理所有计量资料数据均以均数士标准差表示，应用SPSS13. 0软件进行统计分析， 组间比较采用配对资料的t检验，组内比较采用两两比较的q检验。检验水准设为0. 05, P <0. 05认为有统计学差异。三结果1 一般结果本部分实验共使用beagle犬18只，其中对照组6只；剩余12只beagle犬制作主动脉夹层。实验早期制作主动脉夹层与实验观察失败6只，其中制作主动脉夹层时犬死亡 3只，死亡犬均为主动脉夹层制作完成后，夹层手术切口缝合止血困难，因失血性休克死亡； 实验观察失败3只，均为实验过程中生命体征波动较大，中断观察。制作主动脉夹层成功并完成全程观察的实验动物6只为实验组，对照组手术和实验观察全程均无死亡。实验组和对照组各6只犬的体重、手术时间、主动脉夹层制作时间、实验全过程输液量无统计学差异(P > 0. 05)，见表1。其中对照组采用开胸后两次钳夹主动脉，模仿夹层制作过程并保证两组手术时间的一致性。两组动物实验观察期内各时间点动脉收缩压也无统计学差异(P >0.05)，见表2。表1实验组与对照组比较(x±s)
权利要求
1.一种急性Manford A型主动脉夹层伴MODS动物模型的建立方法，它包括如下步骤a、取实验犬，暴露升主动脉；b、在升主动脉起始部远端2cm的部位，侧壁钳纵行钳夹主动脉侧壁1/2周径，小圆刀片横行切开外膜及部分中膜宽达升主动脉周径的1/2 ；找到中膜间隙，松开侧壁钳，使用纹氏钳尖部沿中膜间隙，向远心端钝性轻柔分离，纵长Icm ；c、插入连接注射器的Φ2.5mm微泵延长管，高压快速推注生理盐水，利用生理盐水压力的冲击力量扩大夹层范围，直至剥离长度5cm ；假腔内注入弹力蛋白酶(200u加入2ml生理盐水中)，压迫主动脉切口，使之在假腔中留置5分种；d、再次钳夹侧壁钳，切开内层的中膜及内膜，使主动脉腔与外界相通，扇形剪除夹层切口远心端部分中膜及内膜，6-Oprolene线缝合切口近心端主动脉壁全层及远心端外膜及部分中膜，使血液能够持续进入假腔；e、松开侧壁钳，再次加强缝合切口，止血；夹层制作完成，逐层关胸，缝合胸壁；f、连接微量泵，静脉泵入肾上腺素升高血压，使实验动物收缩压维持于250 沈OmmHg 之间。
2.权利要求1所述的方法制备的动物模型在筛选治疗急性ManfordA型主动脉夹层伴MODS的药物中的用途。
3.一种筛选治疗急性Manford A型主动脉夹层伴MODS药物的方法，包括如下步骤①、建立急性ManfordA型主动脉夹层伴MODS动物模型；②、将治疗急性ManfordA型主动脉夹层伴MODS的药物、候选药物分别施用于动物模型；③、观察候选药物对急性ManfordA型主动脉夹层伴MODS的影响情况，并进行评分， 评价潜在治疗急性Manford A型主动脉夹层伴MODS的药物。
4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于①步骤所述的急性ManfordA型主动脉夹层伴MODS动物模型的建立方法为a、取实验犬，暴露升主动脉；b、在升主动脉起始部远端2cm的部位，侧壁钳纵行钳夹主动脉侧壁1/2周径，小圆刀片横行切开外膜及部分中膜宽达升主动脉周径的1/2 ；找到中膜间隙，松开侧壁钳，使用纹氏钳尖部沿中膜间隙，向远心端钝性轻柔分离，纵长Icm ；c、插入连接注射器的Φ2.5mm微泵延长管，高压快速推注生理盐水，利用生理盐水压力的冲击力量扩大夹层范围，直至剥离长度5cm ；假腔内注入弹力蛋白酶(200u加入2ml生理盐水中)，压迫主动脉切口，使之在假腔中留置5分种；d、再次钳夹侧壁钳，切开内层的中膜及内膜，使主动脉腔与外界相通，扇形剪除夹层切口远心端部分中膜及内膜，6-Oprolene线缝合切口近心端主动脉壁全层及远心端外膜及部分中膜，使血液能够持续进入假腔；e、松开侧壁钳，再次加强缝合切口，止血；夹层制作完成，逐层关胸，缝合胸壁；f、连接微量泵，静脉泵入肾上腺素升高血压，使实验动物收缩压维持于250 260mmHg 之间。
5.大黄素在制备作为急性ManfordA型主动脉夹层伴MODS的脏器保护剂的药物中的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于所述的药物中大黄素的使用剂量为 200mg/kg。
7.一种急性Manford A型主动脉夹层伴MODS的脏器保护剂，它是由有效量的大黄素为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。
8.根据权利要求7所述的脏器保护剂，其特征在于所述的制剂是口服制剂。
全文摘要
本发明提供了一种急性Stanford A型主动脉夹层伴MODS动物模型的建立方法。本发明还提供了大黄素在制备治疗急性Stanford A型主动脉夹层伴MODS的药物中的用途。本发明还提供了一种急性Stanford A型主动脉夹层伴MODS的脏器保护剂。本发明通过改良AD手术制作方法，同时借助静脉持续泵入肾上腺素形成人工控制性高血压，促进AD剥离范围的扩大和加速病程进展，以快速形成急性Stanford A型AD伴MODS为制作成功模型的目标，本发明急性Stanford A型AD伴MODS的动物模型为进一步深入应用基础研究与干预治疗研究创造条件。
文档编号A01K67/02GK102334465SQ201010608819
公开日2012年2月1日 申请日期2010年12月28日 优先权日2010年12月28日
发明者李宏霞, 李明, 王莉, 白志轩, 石应康 申请人:四川大学华西医院, 国家成都中药安全性评价中心, 成都华西海圻医药科技有限公司