大量蓄积类胡萝卜素以及花青素的转化甘薯植物体的制备方法以及由此制备的植物体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种大量蓄积类胡萝卜素以及花青素的转化甘薯植物体的制备方法，其是通过将包含在来源于甘薯（Ipomoea?batatas）的IbOrange基因中，人为地插入特定碱基序列的IbOr-Ins基因突变体的重组载体，转化至大量蓄积花青素的甘薯植物体内实现的；由上述方法制备的大量蓄积类胡萝卜素以及花青素的转化甘薯植物体及其种子；一种环境胁迫耐性较野生型提高的蓄积花青素的转化甘薯植物体的制备方法，其通过将上述重组载体转化至大量蓄积花青素的甘薯植物体而得到的；由上述方法制备的，环境胁迫耐性较野生型提高的蓄积花青素的转化甘薯植物体及其种子；一种能增加蓄积花青素的甘薯植物体的类胡萝卜素含量以及环境胁迫耐性的组合物，其包含所述IbOr-Ins基因变异体。
【专利说明】大量蓄积类胡萝卜素以及花青素的转化甘薯植物体的制备方法以及由此制备的植物体
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种大量蓄积类胡萝卜素以及花青素的转化甘薯植物体的制备方法以及由此制备的植物体；更详细地说，本发明涉及一种大量蓄积类胡萝卜素以及花青素的转化甘薯植物体的制备方法，其是通过将包含在来源于甘薯(Ipomoea batatas)的IbOrange基因中，人为地插入特定碱基序列的IbOr-1ns基因突变体的重组载体，转化至大量蓄积花青素的甘薯植物体内实现的；由上述方法制备的大量蓄积类胡萝卜素以及花青素的转化甘薯植物体及其种子；一种环境胁迫耐性较野生型提高的蓄积花青素的转化甘薯植物体的制备方法，其通过将上述重组载体转化至大量蓄积花青素的甘薯植物体而得到的；由上述方法制备的，环境胁迫耐性较野生型提高的蓄积花青素的转化甘薯植物体及其种子；一种能增加蓄积花青素的甘薯植物体的类胡萝卜素含量以及环境胁迫耐性的组合物，其包含所述IbOr-1ns基因变异体。
【背景技术】[0002]甘薯(Ipomoea batatas L.Lam)不仅能够在比较贫瘠的土地上进行栽培,而且每公顷产量约为30吨，是一种被用作粮食和家畜饲料的具代表性的块根农作物。紫色、黄色等有色甘薯含有多种抗氧化物质，特别是呈黄色的黄色甘薯含有14.7~20mg/100g的胡萝卜素，而紫色甘薯含有2.28g/100g左右的花青素，其能够促进细胞的老化，并且可去除作为各种成人疾病病因的活性氧，具有优异的抗氧化作用。此外，在1990年代以后，通过农杆菌(Agrobacterium)对甘薯尝试了进行协同培养的转化，通过顶端及侧芽分裂组织诱导胚胎发生培养细胞及体细胞胚胎的发生，使植物体再分化转化系统得到发展(Lim等A.2007,《分子育种》19,227-239，(Lim et al.2007, Mol Breedingl9，227-239))。但是还没有对大量生产类胡萝卜素、花青素、多酚等小分子抗氧化物质的甘薯的相关报道。由此认为，开发一种具有复合胁迫耐性的同时，还能够大量产生小分子抗氧化物质的作物，可用于解决21世纪人类所面临的粮食、能源和环境问题。
[0003]Islam等(Islam et al.2002Biosc1.Biotechnol.Biochem.66,2483-2486)报道了甘薯的叶子中至少存在15中以上的具有高生理活性的花青素，其比维生素C或者维生素E具有更强的抗氧化活性(Philpo tt et al.2003J.Sc1.Food Agric.83，1076-1082)。有趣的是据报道称，在很多植物体叶子中花青素的生物合成是被诱导活性氧的外部环境胁迫诱导的，尤其是叶子或者根部的花青素在保护植物体的防御机制中发挥主要的作用，使其免受外部的侵袭(Neill et al.2002Plant Cell Environ.25，539-547)。由于植物酚类化合物的多样性和广泛的分布，其被认为是最重要的天然抗氧化剂。据报道称，多酚和酚类化合物还在人体内发挥保护我们身体的重要作用，使身体免受各种氧化胁迫，因此越来越受瞩目。在甘薯根部中最具代表性的多酹，即羟基肉桂酸(hydroxycinnamic acids, HCA)是强力的抗氧化剂，无论是在甘薯组织和表达期，在大部分的甘薯品种中均大量含有(Islametal.2002J.Agric.Food Chem.50，3718-3722)。如上所述，多酚与类胡萝卜素、花青素一同，使得甘薯表现出很高的抗氧化活性。
[0004]世界卫生组织(WHO)公布了全世界有I亿名儿童由于缺乏维生素A而受苦，并由此导致每年有50万名以上的儿童失明。胡萝卜素作为维生素A的前体，其具有营养强化剂和食品辅助剂的生理活性功能，因此可以说关于食品中胡萝卜素的蓄积的代谢工程学研究是为提高营养学价值所必需的研究对象。已知胡萝卜素作为具有高抗氧化活性的物质，不仅具有生理活性功能，而且对于植物自身的氧化胁迫的防御机制也起到重要作用，最近有报道指出类胡萝卜素的生物合成受植物激素之一的脱落酸(ABA)的影响，因此需要对这些抗氧化物质和环境胁迫进行研究。
[0005]为了从转化植物体生产有用物质进行着多项研究，但其生产率较低，无法满足商业化的要求。由此认为，为了较经济地大量生产具有高附加价值的生理活性物质，利用植物培养细胞以及植物体本身，降低生产费用的方法将被有效地应用。并且，开发能大量产生有用物质的植物体后，重新诱导植物培养细胞，可大大得缩短从产生有用物质到大量生产所需要的时间，比较容易进行培养细胞的扩大培养。并且，可排除可在转化植物体中发生的环境危害问题，不仅能广泛应用于生理活性蛋白质等多种目标化合物，即使还用于医药品、食品用途，相比微生物、动物培养，对于其的排斥感会小。
[0006]韩国授权专利第10-0813284号中公开有一种增加类胡萝卜素含量的方法，其是将源自柑橘的八氢番茄红素生物合成酶基因转化到植物体中，从而增加类胡萝卜素含量；韩国公开专利第2010-0100097中公开有一种提高盐胁迫耐性的方法，其是将源自甘薯的MuSl基因转化到植物体中，从而提高盐胁迫耐性。
【发明内容】
[0007]本发明要解决的技术问题
[0008]本发明是根据上述要求而提出的，本发明通过将包含在来源于甘薯的IbOrange基因中，人为地插入特定碱基序列的IbOr-1ns基因突变体的重组载体，转化至蓄积花青素的甘薯植物体内，从而制备了大量蓄积功能性的类胡萝卜素以及花青素的转化甘薯植物体；并且，确认了所述转化植物体表现出环境胁迫耐性，从而完成了本发明。
[0009]技术方案
[0010]未解决上述技术问题，本发明提供一种大量蓄积类胡萝卜素以及花青素的转化甘薯植物体的制备方法，其包括将含有在来源于甘薯的IbOrange基因中，人为地插入特定碱基序列的IbOr-1ns基因突变体的重组载体，转化至蓄积花青素的甘薯植物体内，从而使IbOr-1ns基因突变体过 表达的步骤。
[0011]并且，本发明提供由上述方法制备的大量蓄积类胡萝卜素以及花青素的转化甘薯植物体及即其种子。
[0012]并且，本发明提供一种环境胁迫耐性较野生型提高的大量蓄积花青素的转化甘薯植物体的制备方法，其包括将含有在来源于甘薯的IbOrange基因中，人为地插入特定碱基序列的IbOr-1ns基因突变体的重组载体，转化至蓄积花青素的甘薯植物体内，从而使IbOr-1ns基因突变体过表达的步骤。
[0013]并且，本发明提供由上述方法制备的，环境胁迫耐性较野生型提高的大量蓄积花青素的转化甘薯植物体及其种子。[0014]并且，本发明提供一种增加累积花青素的甘薯植物体的类胡萝卜素含量的组合物，其包含在来源于甘薯的IbOrange基因中，人为地插入特定碱基序列的IbOr-1ns基因变异体。
[0015]并且，本发明提供一种能增加蓄积花青素的甘薯植物体的环境胁迫耐性的组合物，其包含在来源于甘薯的IbOrange基因中，人为地插入特定碱基序列的IbOr-1ns基因变异体。
[0016]有益效果
[0017]由本发明制备的大量蓄积类胡萝卜素以及花青素的转化甘薯植物体，可作为功能性食品被有效的使用；并且由于其显示环境胁迫耐性，因此对于扩大收获量，其使用价值有可能非常高。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1表不在来源于甘薯的IbOrange基因中人为地插入特定碱基序列的IbOr-1ns基因的植物表达载体。
[0019]图2表示利用新紫美(么]天卜口| )甘薯体细胞，进行来源于甘薯IbOr-1ns基因突
变体转化的步骤(A)以及通过转化筛选标记物(HPTII)进行基因组DNA聚合酶链式反应(gDNA PCR)的结果(B) (N/T (Non transgenic plants):非转化植物体；E/V (Empty vectorplants):用空载体转化的对照组植物体；Zm-0r (transgenic plants):转化植物体)。
[0020]图3表示使本发 明中来源于甘薯的IbOr-1ns基因突变体过表达的转化新紫美甘薯的贮藏根的截面(A)以及地上部转化体的形态(B) (N/T:非转化植物体；E/V:用空载体转化的对照组植物体；Zm-0r:转化植物体；a:E/V植物体；b =Zm-Or植物体；c:E/V植物体茎部；d，e =Zm-Or植物体茎部)。
[0021]图4是表示转化来源于甘薯的IbOr-1ns基因突变体的新紫美甘薯转化体中，与类胡萝卜素生物合成相关基因的表达状况的结果，该结果是通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR ),后进行电泳测定的。
[0022]图5是表示转化来源于甘薯的IbOr-1ns基因突变体的新紫美甘薯转化体中，与花青素生物合成相关基因的表达状况的结果，该结果是通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR ),后进行电泳测定的。
[0023]图6是表示使来源于甘薯的IbOr-1ns基因突变体过表达的转化的新紫美甘薯贮藏根中，总类胡萝卜素含量的结果，该是通过分光光度计进行测定的。
[0024]图7是表示使来源于甘薯的IbOr-1ns基因突变体过表达的转化的新紫美甘薯贮藏根中，总花青素含量的结果，该是通过分光光度计进行测定的。
[0025]图8表示在使来源于甘薯的IbOr-1ns基因突变体过表达的转化的新紫美甘薯叶子中，分析DPPH自由基清除活性(A)和多酚含量的结果(B )。
[0026]图9表示在使来源于甘薯的IbOr-1ns基因突变体过表达的转化的新紫美甘薯叶子圆盘(旬[|4丑)中，分析对多种浓度的盐胁迫耐性的结果。
[0027]图10表示在使来源于甘薯的IbOr-1ns基因突变体过表达的转化的新紫美甘薯叶盘中，分析由不同浓度的MV处理的胁迫耐性的结果。【具体实施方式】
[0028]本发明为实现目的，提供一种大量蓄积类胡萝卜素以及花青素的转化甘薯植物体的制备方法，其包括将含有在来源于甘薯的IbOrange基因中，人为地插入特定碱基序列的IbOr-1ns基因突变体的重组载体，转化至大量蓄积花青素的甘薯植物体内，从而使IbOr-1ns基因突变体过表达的步骤，IbOr-1ns基因突变体由SEQ ID N0.1的碱基序列构成。
[0029]本发明中，在IbOrange基因(参见韩国授权专利第0990330号)中插入KSQNPNL氨基酸，从而制备了 IbOr-1ns基因突变体。然而能增加类胡萝卜素含量或者提高耐盐性的突变体均可使用，没有特殊的限制。
[0030]本发明的IbOr-1ns基因突变体优选包括SEQ ID N0.1表示的碱基序列。所述碱基序列的突变体也包括在本发明的范围内。更确切地说，上述基因突变体可包含与SEQ IDN0.1的碱基序列具有70%以上序列同源性的碱基序列，更优选为80%以上，进一步优选为90%以上，最优选为95%以上。对于多聚核苷酸的“序列同源性的％”是通过比较两个以最优方式排列的序列和比较区域得以确认。比较区域中的部分多聚核苷酸序列与对于两个序列的最优排列的参考序列(不包括添加或者删除)相比，可包含添加或者删除(即间隙(gap))。
[0031]术语“重组”是指细胞复制异种核酸或表达上述核酸或表达由肽、异种肽或异种核酸编码的蛋白质的细胞。重组细胞能将在上述细胞的天然形态中未被发现的基因或者基因片段表达为正义引物或者反义引物形态中的一个。而且，重组细胞可以表达从天然状态的细胞中发现的基因，但上述基因是发生变形的，是通过人为手段再导入至细胞内的基因。
[0032]本发明的上述IbOr-1ns基因突变体序列可以插入到重组表达载体内。术语“重组表达载体”是指细菌质粒、噬菌体、酵母菌质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其它载体。大体上,任意的质粒及载体只要在宿主内能够复制及稳定化,均可使用。上述表达载体的重要特性在于，具有复制原点、启动子、标记基因及翻译控制单元(translation controlelement)。
[0033]通过本领域技术人员公知的方法可以构建包括IbOr-1ns蛋白质-编码DNA序列及合适的转录/翻译调节信号的表达载体。上述方法包括试管内重组DNA技术、DNA合成技术及活体内重组技术等。为了引导mRNA的合成，上述DNA序列可以有效地连接到表达载体内的合适的启动子上。而且，表达载体可以包括作为翻译起始部位的核糖体结合部位及转录终止子。
[0034]本发明的重组载体的优选例为T1-质粒载体，其存在于根癌农杆菌等合适的宿主中时，能够将其自身的一部分，所谓的T-区域转移到植物细胞中。其它类型的T1-质粒载体(参照EP0116718B1号)可以通过将植物细胞或杂合DNA适当地插入到植物的基因组内，从而生产新的植物的原生质体，目前用于杂合DNA序列转移。T1-质粒载体最优选的形态是EP0120516B1号及美国专利第4940838号中要求保护的所谓双元(binary)载体。能够将本发明的DNA导入到植物宿主中的其它适合的载体可以选自源自双链植物病毒(例如，花椰菜花叶病毒(CaMV))及单链病毒、 双粒病毒等的病毒载体，例如可以选自非完整性植物病毒载体。这些载体的使用对难以适当地转化植物宿主时尤其有利。
[0035]表达载体优选含有一个以上的选择性标记。上述标记作为具有能够用常规化学方法筛选的特性的核酸序列，包括能将转化细胞从非转化细胞中区分出来的所有的基因。例如有草甘膦(glyphosate)或草丁膦(phosphinothricin)等除草剂抗性基因、卡那霉素(kanamycin)、G418、博来霉素(Bleomycin)、潮霉素(hygromycin)、氯霉素(chloramphenicol)等抗生素耐受性基因,但并不仅限于此。
[0036]在本发明的重组载体中，启动子可以是CaMV35S、肌动蛋白、泛素、pEMU、MAS或组蛋白启动子，但不限于此。术语“启动子”是指始于结构基因的DNA上游区域，是为了启动转录而与RNA聚合酶结合的DNA分子。“植物启动子”是指能在植物细胞中启动转录的启动子。“组成型(constitutive)启动子”是指在大部分的环境条件及生长状态或者细胞分化条件下具有活性的启动子。由于转化体的筛选能够在各阶段、通过各种组织形成，因此本发明优选组成型启动子。并且，不限制组成型启动子的选择可能性。
[0037]在本发明的重组载体中，可以使用通常使用的终止子，例如胭脂碱合酶(NOS)JK稻ct -淀粉酶RAmylA终止子、菜豆碱(phaseoline)终止子、根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的章鱼碱(Octopine)基因的终止子等,但不限定于此。关于终止子的必要性，一般被认为是这些区域能促进植物细胞内转录的确定性及效率。因此，在本发明的内容中优选使用终止子。
[0038]植物的转化是指将DNA转移到植物的任意方法。这些转化方法不一定需要经过再生及(或)组织培养期。目前，植物种的转化不仅对于双子叶植物，包括单子叶植物量子的植物种也非常普遍。原则上，任意的转化方法均可被用于将本发明的杂合DNA导入到祖细胞中。所述方法可选自对于原生质体的钙/聚乙二醇方法(Krens，F.A.et al.，1982, Nature296,72-74 ；Negrutiu 1.et al., Junel987, Plant Mol.Biol.8,363-373(Krens, F.A.等人，1982，自然 296，72-74 ;Negrutiu 1.等人，1987 年 6 月，植物分子生物学 8，363-373))、原生质体的电穿孔法(Shillito R.D.et al., 1985Bio/Technol.3，1099-1102 (Shillito R.D.等人，1985生物/技术3，1099-1102))、对植物元素的显微注射法(Crossway A.et al.，1986，Mol.Gen.Genet.202，179-185 (克洛斯威 A.等人，1986，分子遗传学和基因组202，179-185))、各种植物元素的(DNA或者RNA-涂布的)微粒轰击法(Klein T.M.et al., 1987, Nature327,70 (Klein T.M.等人，1987，自然 327，70))、依据植物的浸润或者成熟花粉或者小孢子转化的，根癌农杆菌介导的基因转移(非完整性)中依据病毒的感染(ΕΡ0301316号)等。本发明的优选方法包含农杆菌介导的DNA转移。更为优选的是利用ΕΡΑ120516号及美国专利第4940838号所记载的所谓双元载体技术的方法。
[0039]根据本发明一个体现例的方法，上述蓄积花青素的甘薯植物体优选紫色甘薯，更优选品种为新紫美的甘薯，但并不仅限于此。
[0040]并且，本发明提供由上述方法制备的大量蓄积类胡萝卜素以及花青素的转化甘薯植物体及其种子。
[0041]本发明确认了用本发明的来源于甘薯的IbOr-1ns基因突变体进行转化的新紫美甘薯植物体，其IbOrange基因以及与类胡萝卜素生物合成相关的主要基因PSY、LCY-β、LCY- ε以及CHY-β )的表达量，较非转化植物体增加，并且还确认了类胡萝卜素含量较非转化植物体增加约 3倍以上(参考图4以及图6)。
[0042]并且，本发明提供一种相比野生型对环境胁迫的耐性增加的大量蓄积花青素的转化甘薯植物体的制备方法，其包括将含有由SEQ IDN0.1的碱基序列构成的IbOr-1ns基因突变体的重组载体转化至蓄积花青素的甘薯植物体内，从而使IbOr-1ns基因突变体过表达的步骤，所述IbOr-1ns基因突变体是在来源于甘薯的IbOrange基因中人为地插入特定喊基序列而得到的。
[0043]根据本发明一个体现例的方法，所述蓄积花青素的甘薯植物体优选紫色甘薯，更优选品种为新紫美的甘薯，但并不仅限于此。
[0044]根据本发明一个体现例的方法，上述环境胁迫优选为非生物学(abiotic)胁迫，更优选为盐或者甲基紫精，但并不仅限于此。
[0045]并且，本发明提供由上述方法制备的，较野生型环境胁迫耐性提高的，大量蓄积花青素的转化甘薯植物体及其植物体种子。
[0046]并且，本发明提供一种增加蓄积花青素的甘薯植物体的类胡萝卜素含量的组合物，其包含在来源于甘薯的IbOrange基因中人为地插入特定碱基序列的IbOr-1ns基因变异体，所述IbOr-1ns基因变异体由SEQ ID N0.1的碱基序列构成。本发明的组合物包含有SEQ ID N0.1的碱基序列构成的IbOr-1ns基因变异体作为有效成分，并通过将上述基因突变体转化至大量蓄积花青素的甘薯植物体，从而增加蓄积花青素的甘薯植物体的类胡萝卜素的含量。
[0047]并且，本发明提供一种增加蓄积花青素的甘薯植物体的环境胁迫耐性的组合物，其包含在来源于甘薯的IbOrange基因中人为地插入特定碱基序列的IbOr-1ns基因变异体，所述IbOr-1ns基因变异体由SEQ ID N0.1的碱基序列构成。本发明的组合物包含有SEQ ID N0.1的碱基序列构成的IbOr-1ns基因变异体作为有效成分，并通过将上述基因突变体转化至蓄积花青素的甘薯植物体，从而增加大量蓄积花青素的甘薯植物体的环境胁迫耐性。
[0048]以下，将通过实施例详细地说明本发明。但是，下述实施例只是为了例示本发明，本发明的内容并不限定于下述实施例。
[0049]实施例1.1bOr-1ns基因的克隆及碱基序列分析
[0050]制备了用于克隆甘薯Orange基因的PCR引物，其引物序列如下:正向引物(5’_atggtatattcaggtagaatcttgtcgctc-3’ ；SEQ ID N0.2)及反向弓丨物(5’-ttaatcaaatgggtcaattcgtgggtcatg-3’ ；SEQ ID N0.3)。将由此得到的 IbOr 作为模板，实施重叠(overlapping)PCR,从而实施了对IbOr的特定碱基序列的人为突变。为了插入IbOrange基因的氨基酸序列(参见韩国授权专利第0990330号)内的第133号氨基酸起被推定为-KSQNPNL-的碱基序列，制备了 PCR引物，此时所使用的引物序列如下:正向引物(5’ -gaaaagcaagaaaataaacttaaatcccagaaccctaac-3’ ；SEQID N0.4)及反向引物(5，-aagatttgcggatgtcaggttagggttctgggatttaag-3’ ；SEQ ID N0.5)。其结果，获得了约 921bp 的 PCR 产物，克隆到PGEM-T-载体上后，通过测序确认了从第133号氨基酸起以-KSQNPNL-插入的突变。使用Clonetech公司的优势2(advantage2)聚合酶实施PCR,使用pGEMeasy克隆载体(Promega)克隆预计大小的PCR产物后，通过测序确认了全部碱基序列。将此cDNA基因命名为IbOr-1ns。本发明的IbOr-1ns基因全长为924bp的cDNA编码307个氨基酸。用氨基酸排列预测的等电点(pi)和分子量(Mw)分别为8.45和33.74kDa。
[0051]在引物的碱基序列中，为了使用英杰公司(Invitrogen)的通道(g ateway)表达系统，在上述引物的5’末端上分别添加衔接序列(adapt er sequence)(用大写字母标记)。喊基序列为正向引物(5’ -CAAAAAAGCAGGCTNNa tggtatattcaggtagaatcttgtcgctc-3’ ；SEQID N0.6)及反向引物(5，-CAAGAAAGCTGGGTNttaatcaaatgggtcaattcgtgggtcatg-3’ ；SEQ IDN0.7)。首先,使用pGEMeasy克隆载体(Promega)克隆上述预计大小的PCR产物后,通过测序确认了全部碱基序列。将此cDNA基因命名为IbOr-1ns。对克隆有IbOrange基因的pGEMeasy载体进行BP反应，从而在pD0NR207载体上克隆基因。之后，通过pD0NR207和作为植物表达载体的PGWBlI载体的LR反应，克隆得到IbOr-1ns基因的植物表达载体(图1)。
[0052]实施例2.向新紫美甘薯体细胞培养细胞中转化来源于甘薯的IbOr-1ns基因变异体
[0053]在35S启动子的调节下，将来源于甘薯的IbOr-1ns基因突变体转化至大量含有花青素的甘薯品种新紫美体细胞培养细胞(图2A)。其结果，通过选择培养基获得转化小植物体，并以此为对象，通过基因组DNA PCR测定转化体筛选标记物潮霉素基因HPT II的表达，从而筛选出转化体。将上述转化体标记为Zm-Or (图2B)。
[0054]实施例3.转化来源于甘薯IbOr-1ns基因突变体的新紫美甘薯植物体的表型分析
[0055]将来源于甘薯的IbOr-1ns基因突变体转化至紫色甘薯新紫美后，获得贮藏根，结果如图3所示，如果是非转化的新紫美时，无明显变化，即仍表现为深紫色；与此相反，如果是Zm-Or时，表现出了黄色和紫色混合的表型(图3A)。并且，关于茎的表型，转化体的侧芽和侧枝大多数比较发达，其叶子数也比较多(图3B)。
[0056]实施例4.在转化来源于甘薯IbOr-1ns基因突变体的新紫美甘薯植物体中，与类胡萝卜素的生物合 成相关基因的表达分析
[0057]以非转化以及转化新紫美甘薯植物体为对象，通过RT-PCR分析了与类胡萝卜素生物合成相关基因以及IbOrange基因的表达。其结果，如果是非转化植物体以及转化空载体的植物体时，IbOrange基因的表达较弱，甚至不表达；与此相反，如果是Zm-Or时，IbOrange基因的表达大幅度地增加。并且，如果是非转化植物体以及转化空载体的植物体时，大部分类胡萝卜素相关的基因表达非常弱或者不表达；与此相反，如果是Zm-Or时，PSY,LCY-β ,LCY- ε ,CHY-β等，大部分与类胡萝卜素的生物合成相关基因的表达增加。并且，与独脚金内酯生物合成相关的基因(strigolactone biosynthesis related gene)如CCR4、CCR基因等和ABA生物合成主要基因NCED基因的表达也有了增加(图4)。
[0058]实施例5.在转化来源于甘薯IbOr-1ns基因突变体的新紫美甘薯植物体中，与花青素的生物合成相关基因的表达分析
[0059]以非转化以及转化新紫美甘薯植物体为对象，通过RT-PCR分析了与花青素生物合成相关基因的表达。其结果，如果是非转化新紫美甘薯植物体和转化空载体的新紫美甘薯植物体时，大部分与花青素相关基因的表达均较强；与此相反，如果是Zm-Or时，CHS、CH1、F3H、ANS、3GT等大部分花青素生物合成的主要基因的表达均减少。然而，在维管(vascular)内的与花青素的蓄积相关的基因，例如VP24与非转化植物体相比，表达差异并不是非常大(图5)。
[0060]实施例6.对转化来源于甘薯的IbOr-1ns基因突变体的新紫美甘薯植物体的类胡萝卜素的含量分析
[0061]为确认转化的新紫美甘薯植物体的类胡萝卜素的含量是否有变化，以非转化以及转化新紫美甘薯植物体为对象，对贮藏根组织的类胡萝卜素含量，通过分光光度计检测440nm处的吸光度而测定。从结果中可确认，转化的新紫美甘薯植物体与作为对照组的非转化体相比，类胡萝卜素含量增加了约3倍以上(图6)。
[0062]实施例7.对转化来源于甘薯的IbOr-1ns基因突变体的新紫美甘薯植物体的花青素的含量分析
[0063]为确认转化的新紫美甘薯植物体的花青素的含量是否有变化，以非转化以及转化新紫美甘薯植物体为对象，对贮藏根组织的花青素含量，通过分光光度计进行测定。从结果中可确认，转化新紫美甘薯植物体与作为对照组的非转化体相比，花青素含量降低了约
0.6-0.8倍以上(图7)。然而，转化植物体#1-1显示出了与非转化植物体类似的花青素含量，且该转化株显示出的类胡萝卜素含量最高，因此其被认为是比较理想的转化植物体(图6、图 7)。
[0064]实施例8.对转化来源于甘薯的IbOr-1ns基因突变体的新紫美甘薯植物体叶子的低分子抗氧化活性分析
[0065]为了以转化的新紫美甘薯植物体叶子为对象，比较低分子抗氧化物质的含量，测定了 DPPH自由基消除活性(图8A)。其结果，如果是非转化体和转化空载体的植物体时，每克(g)鲜重(fresh weight,FW)中表现出了约相当于250-340 μ g的抗坏血酸(ASA)的活性；而如果是转化体时，表现出了约相当于310-610 μ g的抗坏血酸的活性，尤其是转化体#1-1显示出了最高的抗氧化活性。并且，对于多酚，如果是非转化体和转化空载体的植物体时，每克鲜重表现出了约相当于170-190 μ g的绿原酸(chlorogenic acid)的活性；而如果是转化体时，表现出了约230-360 μ g的绿原酸的活性，即转化体较对照组显示出了更高的含量(图8B)。
[0066]实施例9.对转化来源于甘薯的IbOr-1ns基因突变体的新紫美甘薯植物体的非生物性胁迫耐性分析
[0067]依据本发明，利用来源于甘薯的IbOr-1ns基因突变体转化的新紫美甘薯植物体相比于非转化新紫美，其β_胡萝卜素含量增加了 2.5-2.9倍以上。为进一步确认，现有的花青素和通过本发明增加的类胡萝卜素能否使转化植物体具备胁迫耐性，利用盐、MV等处理，实施非生物性胁迫。
[0068]首先，将对照组和转化体叶状茎顶端第4、5个叶子，制备成直径为8mm的叶子圆盘(disc)，后在0、150、200、400mM浓度的NaCl溶液中，25°C的暗条件下浸溃24小时。通过3，3-二胺基联苯胺(3，3-diaminobezidine, DAB)染色观察了各个叶子圆盘受到的氧化胁迫。DAB与细胞内过氧化氢(H202)发生反应，产生褐色的沉淀物。在lmg/ml DAB-HCl(pH3.8)溶液中，将各个处理组浸溃24小时后，对显色程度进行照相。其结果，如果作为对照组的新紫美和转化空载体的新紫美时，随着NaCl浓度的增加褐色的显色程度更深，即随着浓度的增加，受到更多的氧化胁迫；而与此相比，如果是转化体时，与对照组相比，其显色程度较浅，即表现出了对于由盐引起的氧化胁迫的耐性(图9)。
[0069]并且，对于另一个氧化胁迫源的甲基紫精(MV)，取六个直径为8mm的叶子圆盘，分别悬浮于直径为2.5cm的多格培养皿(multi petri dish)中，其每孔包含有3ml的包含O、
2.5、5、10 μ M的MV的0.4%山梨醇溶液。在25°C的暗条件下培养12小时，使MV被吸收后，在连续光条件下培养24小时。其中以12小时为间隔，利用电导计(model455C，Istek公司，韩国)测定溶液的离子电导率，以及通过DAB染色测定24小时后的氧化胁迫，从而观察叶子的损伤程度。如果是非转化体和转化空载体的对照组植物体时，用2.5 μ M的MV处理后，到48小时其显示37.3%和55.7的高离子电导率，从而可知其对由MV产生的氧化胁迫具有很强的敏感性。与此相反，如果是转化体时，其仅显示25.6%和31.2%的低离子电导率，从而可知其对由MV产生的氧化胁迫具有很强的耐性。如果是非转化体和转化空载体的对照组植物体时，用5 μ M的MV处理后，到48小时其显示51.9%和62.5的高离子电导率，从而可知其对由MV产生的氧化胁迫具有很强的敏感性。与此相反，如果是转化体时，其仅显示34.9%和40.8%的低离子电导率，从而可知其对由MV产生的氧化胁迫具有很强的耐性(图10Α)。并且，在lmg/ml DAB-HCl (pH3.8)溶液中，将各个处理组浸溃24小时后，进行显色的结果显示，如果是非转化体和转化空载体的对照组植物体时，随着MV浓度的增加，其褐色的显色程度越深，即随着浓度的增加，受到更多的氧化胁迫；与此相反，如果是转化植物体时，其显色程 度相比于对照组低，即显示对由MV引起的氧化胁迫的耐性(图10B)。
【权利要求】
1.一种大量蓄积类胡萝卜素以及花青素的转化甘薯植物体的制备方法，其特征在于，其包括将含有由SEQ ID N0.1的碱基序列构成的IbOr-1ns基因突变体的重组载体转化至蓄积花青素的甘薯植物体内，从而使IbOr-1ns基因突变体过表达的步骤,所述IbOr-1ns基因突变体是在来源于甘薯的IbOrange基因中人为地插入特定碱基序列而得到的。
2.根据权利要求1所述的大量蓄积类胡萝卜素以及花青素的转化甘薯植物体的制备方法，其特征在于，所述甘薯植物体为紫色甘薯。
3.一种大量蓄积类胡萝卜素以及花青素的转化甘薯植物体，其特征在于，其通过权利要求I或者2所述的方法制备。
4.通过根据权利要求3所述的方法得到的甘薯植物体的种子。
5.一种相比野生型对环境胁迫的耐性增加的大量蓄积花青素的转化甘薯植物体的制备方法，其包括将含有由SEQ ID N0.1的碱基序列构成的IbOr-1ns基因突变体的重组载体转化至蓄积花青素的甘薯植物体内，从而使IbOr-1ns基因突变体过表达的步骤，所述IbOr-1ns基因突变体是在来源于甘薯的IbOrange基因中人为地插入特定碱基序列而得到的。
6.根据权利要求5所述的相比野生型对环境胁迫的耐性增加的大量蓄积花青素的转化甘薯植物体的制备方法，其特征在于，所述甘薯植物体为紫色甘薯。
7.根据权利要求5所述的相比野生型对环境胁迫的耐性增加的大量蓄积花青素的转化甘薯植物体的制备方法，其特征在于，所述环境胁迫为非生物性胁迫。
8.通过权利要求5至7中任意一项所述的方法而制备的相比野生型对环境胁迫的耐性增加的大量蓄积花青素的转化甘薯植物体。
9.通过权利要求8所述的方法得到的甘薯植物体的种子。
10.一种增加蓄积花青素的甘薯植物体的类胡萝卜素含量的组合物，其特征在于，其包含在来源于甘薯的IbOrange基因中人为地插入特定碱基序列的IbOr-1ns基因变异体,所述IbOr-1ns基因变异体由SEQ ID N0.1的喊基序列构成。
11.一种增加蓄积花青素的甘薯植物体的环境胁迫耐性的组合物，其特征在于，其包含在来源于甘薯的IbOrange 基因中人为地插入特定碱基序列的IbOr-1ns基因变异体,所述IbOr-1ns基因变异体由SEQ ID N0.1的喊基序列构成。
【文档编号】A01H5/00GK103917087SQ201180072691
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2011年10月24日 优先权日:2011年8月5日
【发明者】郭尚洙, 李幸顺, 金善荷, 朴成喆, 郑在哲 申请人:韩国生命工学研究院