专利名称：一种高黄酮含量马棘的培育方法
技术领域：
本发明涉及一种马棘的培育方法，尤其是提高黄酮含量的马棘的培育方法。
背景技术：
我国新农村建设的首要任务是不断提高农民收入，发展效益农业是有效途径之一。因此，在继续重视高产、优质和抗病农作物传统育种的同时，发展以功能型为特征的农作物成为育种新方向，有助于提高农产品的附加值，实现效益农业与农民增收有机结合， “以用促种”保障农村经济持续稳定长效机制的形成。马棘(Indigofera pseudotinctoria Mats)系豆科木蓝属多年生小灌木,具有耐热、耐旱、耐瘠、适应性广的特点，适合绿化荒山、护坡固坎、保持水土，也是牛和羊等草食性动物的优质青饲料。我国为多山、多丘陵的国家，马棘尤其适宜种植于广大贫瘠干旱的堤坡缓地，这对山区生态经济的可持续发展具有重要意义。生物总黄酮系一大类天然产物，广泛存在于植物界，是许多中草药的有效成分具有如下重要的生理功能消除疲劳、保护血管、防动脉硬化、扩张毛细血管、疏通微循环、活化大脑及其他脏器细胞的功能、抗脂肪氧化、抗衰老。黄酮醇合成酶基因FLS是黄酮生物合成中关键调控酶，可以二氢黄酮醇为底物， 高效调控合成槲皮素、山萘酚、杨梅素等黄酮醇。
发明内容
正是在上述背景下，本发明的目的是提出一种高黄酮含量马棘的培育方法，以获得高黄酮含量马棘，进行类黄酮的开发，用于食品、医药、饲料和化工等领域。本发明的高黄酮含量马棘的培育方法，包括以下步骤
I)取马棘的成熟种子为外植体，接种至诱导培养基，在25±1°C、光强3000勒克司光条件下诱导形成愈伤组织；
2)将诱导形成3周的愈伤组织，转移至继代培养基，继代培养至愈伤组织进入成倍增
殖期；
3)将成倍增殖的愈伤组织，在25±1°C避光的黑暗条件下进行受体愈伤组织的预培养
2天；
4)将经过预培养的愈伤组织，在农杆菌悬浮液中浸泡15分钟，之后弃去菌液，用无菌滤纸吸干，接种于共培养基上，在25±1°C避光的黑暗条件下共培养2天；
5)将上述共培养愈伤组织，洗净、晾干后，转移到筛选培养基，在25± I °C避光的黑暗条件下培养6周，收集新长出的抗性愈伤组织，转移至新的筛选培养基上，再进行连续2轮继代筛选，每隔3周转继I次；
6)取3轮筛选后的抗性愈伤组织，转移至分化培养基，在25±1°C、光强3000勒克司光条件下诱导分化成苗，对抗性植株进行组织化学染色和分子检测，选留含目的基因插入序列的的转基因植株，所说的目的基因插入序列是指目的基因黄酮醇合成酶基因/ &标记基因葡糖苷酸酶基因GUS和筛选基因抗潮霉素基因HPT的插入序列，目的基因黄酮醇合成酶基因片段长821bp ；
7)取入选的转基因植株，田间种植后收获种子，测定叶片内黄酮含量，选留黄酮含量高于3%的转基因植株；
8)继续种植步骤7)筛选的转基因株系，评价黄酮含量的表达稳定性，繁殖黄酮含量稳定高于3%的优良株系，为培育的高黄酮含量马棘。本发明中，所说的诱导培养基为N6基本培养基添加2，4-D1. 5mg、蔗糖30g和琼脂粉6. 8g, pH灭菌前5. 8。本发明中，所说的继代培养基为N6基本培养基添加2，4-D Img蔗糖30g和琼脂粉
6.8g, pH 灭菌前 5. 8。本发明中，所说的共培养基为N6基本培养基添加2，4-D lmg、乙酰丁香酮2mg、蔗糖30g和琼脂粉6. 8g，pH灭菌前5. 8。本发明中，所说的筛选培养基为N6基本培养基添加2，4-D lmg、潮霉素25mg、羧卞 200 mg、鹿糖30g和琼脂粉6. 8g, pH灭菌前5. 8。本发明中，所说的分化培养基为N6基本培养基添加6-BA1. Omg、NAAlmg、KTI. 5mg、 羧卞200mg、蔗糖30g和琼脂粉6. 8g，pH灭菌前5. 8。上述的N6 基本培养基为 KNO3 2830mg、(NH4)2SO4 463mg、CaCl2 2H20 166mg、 MgSO4 7H20 185mg、KH2PO4 400mg、MnSO4 4H20 4. 4mg、ZnSO4 7H20 I. 5mg、FeSO4 7H20 27. 8mg、Na2-EDTA 2H20 37. 3mg、H3BO3 I. 6mg、肌醇 lOOmg、烟酸 0. 5mg、维生素 B6 0. 5mg、 维生素BI 0. 5mg和甘氨酸2mg。本发明中，所说的农杆菌的菌株为EHA105，内含质粒pCAM1305，pCAM1305的T-DNA 区域携带目的基因插入序列，包括目的基因黄酮醇合成酶基因/ &标记基因葡糖苷酸酶基因GUS和筛选基因抗潮霉素基因HPT的插入序列。目的基因黄酮醇合成酶基因片段长 821bp，与35S和nos终止子共同构成表达框架。菌株为EHAlO方便购买或赠送获得，在一般植物遗传实验室均有保存，参见文献吴关庭等，中国农业科学，2005，38 (12) :2395-2402。上述的标记基因葡糖苷酸酶基因⑶S的组织化学染色方法参见Rueb和Hensgens. Rice Genetics Newsletters, 1989, (6): 168-169,筛选基因抗潮霉素基因 HPT 的分子检测方法参见文献吴关庭等，中国农业科学，2005，38 (12) :2395-2402。本发明中，所说的黄酮含量检测方法，以芦丁为标样的比色法在波长510nm处测定，参见文献杨美华，卢充伟，匡岩巍，等.柱色谱-紫外分光光度法测定广金钱草中总黄酮的含量.中草药，2004，35(6) : 688 690。上述的稳定性是指入选马棘中黄酮含量在不同年份间(2年以上)、季节间(2季以上)以及地点间(2个地点以上)的含量变化不显著。本发明培育的高黄酮含量的马棘，具有以下优点
本发明首先利用黄酮醇合成酶基因FLS，作为黄酮生物合成中的关键中间调控酶，调控合成槲皮素、山萘酚、杨梅素等黄酮醇，培育出高黄酮含量马棘，进行高效生物提取，发展新型保健食品添加剂和营养强化剂，用于食品、医药饲料和化工等领域。
图I是本发明所用的黄酮醇合成酶基因插入序列的载体构建示意图。
具体实施例方式以下通过具体实例进一步说明本发明。实施例I :
以取马棘品系“ZJJ01”的成熟种子为外植体，接种至诱导培养基，在25±1°C、光强 3000勒克斯光条件下诱导形成愈伤组织；
取诱导形成3周的愈伤组织，转移至继代培养基，继代培养至愈伤组织进入成倍增殖
期；
取成倍增殖的愈伤组织，在25±1°C、避光的黑暗条件下进行受体愈伤组织的预培养2
天;
取经过预培养的愈伤组织(约500个培养皿，含5000块以上的愈伤组织)，在农杆菌悬浮液中浸泡15分钟，之后弃去菌液，用无菌滤纸吸干，接种于共培养基上，在25 ± I °C、避光的黑暗条件下共培养2天；
取上述共培养愈伤组织，洗净、晾干后，转移到筛选培养基，在25土 1°C、避光的黑暗条件下培养6周，收集新长出的抗性愈伤组织(约450块愈伤组织)，转移至新的筛选培养基上，再进行连续2轮继代筛选，每隔3周转继I次；
取3轮筛选后的抗性愈伤组织(约90块愈伤组织)，转移至分化培养基，在25±1°C、光强3000勒克斯光条件下诱导分化成苗83株，对抗性植株进行标记基因GUS组织化学染色和筛选基因HPT分子检测，选留含目的基因黄酮醇合成酶基因插入序列的转基因植株 21株(目的基因插入序列的载体构建如图I所示)。取入选的转基因植株，田间种植后收获种子，进行叶片内黄酮含量检测，选留黄酮含量高于3%的转基因植株9株，继续种植转基因株系；
2008-2010连续3年，分别在浙江杭州、临安、富阳三地三季评价总黄酮含量的表达稳定性，繁殖总黄酮含量稳定高于10%的优良株系，最终培育高黄酮含量马棘4个，T-MJ-U T-MJ-2、T-MJ-3和T-MJ-4，其叶片内总黄酮含量分别为5. 1%、4. 6%、3. 7%、3. 2%，而原马棘的总黄酮含量仅为0. 82%。
权利要求
1.一种高黄酮含量马棘的培育方法，包括以下步骤I)取马棘的成熟种子为外植体，接种至诱导培养基，在25±l°c、光强3000勒克司光条件下诱导形成愈伤组织；2)将诱导形成3周的愈伤组织，转移至继代培养基，继代培养至愈伤组织进入成倍增殖期；3)将成倍增殖的愈伤组织，在25±1°C避光的黑暗条件下进行受体愈伤组织的预培养2天；4)将经过预培养的愈伤组织，在农杆菌悬浮液中浸泡15分钟，之后弃去菌液，用无菌滤纸吸干，接种于共培养基上，在25±1°C避光的黑暗条件下共培养2天；5)将上述共培养愈伤组织，洗净、晾干后，转移到筛选培养基，在25± I °C避光的黑暗条件下培养6周，收集新长出的抗性愈伤组织，转移至新的筛选培养基上，再进行连续2轮继代筛选，每隔3周转继I次；6)取3轮筛选后的抗性愈伤组织，转移至分化培养基，在25±1°C、光强3000勒克司光条件下诱导分化成苗，对抗性植株进行组织化学染色和分子检测，选留含目的基因插入序列的的转基因植株，所说的目的基因插入序列是指目的基因黄酮醇合成酶基因/ &标记基因葡糖苷酸酶基因GUS和筛选基因抗潮霉素基因HPT的插入序列，目的基因黄酮醇合成酶基因片段长821bp ；7)取入选的转基因植株，田间种植后收获种子，测定叶片内黄酮含量，选留黄酮含量高于3%的转基因植株；8)继续种植步骤7)筛选的转基因株系，评价黄酮含量的表达稳定性，繁殖黄酮含量稳定高于3%的优良株系，为培育的高黄酮含量马棘。
2.根据权利要求I所述的高黄酮含量马棘的培育方法，其特征在于所说的诱导培养基为N6基本培养基添加2，4-D1. 5mg、蔗糖30g和琼脂粉6. 8g，pH灭菌前5. 8。
3.根据权利要求I所述的高黄酮含量马棘的培育方法，其特征在于所说的继代培养基为N6基本培养基添加2，4-D lmg、蔗糖30g和琼脂粉6. 8g，pH灭菌前5. 8。
4.根据权利要求I所述的高黄酮含量马棘的培育方法，其特征在于所说的共培养基为N6基本培养基添加2，4-D lmg、乙酰丁香酮2mg、蔗糖30g和琼脂粉6. 8g，pH灭菌前5. 8。
5.根据权利要求I所述的高黄酮含量马棘的培育方法，其特征在于所说的筛选培养基为N6基本培养基添加2，4-D lmg、潮霉素25mg、羧卞200 mg、蔗糖30g和琼脂粉6. 8g，pH 灭菌前5. 8。
6.根据权利要求I所述的高黄酮含量马棘的培育方法，其特征在于所说的分化培养基为N6基本培养基添加6-BA1. Omg、NAAlmg、KTI. 5mg、羧卞200mg、鹿糖30g和琼脂粉6. 8g, pH灭菌前5. 8。
7.根据权利要求2-6所述的高黄酮含量马棘的培育方法，其特征在于所说的N6基本培养基为 KNO3 2830mg、(NH4)2SO4 463mg、CaCl2 · 2H20 166mg、MgSO4 · 7H20 185mg、KH2PO4 400mg、MnSO4 · 4H20 4. 4mg、ZnSO4 · 7H20 I. 5mg、FeSO4 · 7H20 27. 8mg、Na2-EDTA · 2H20 37. 3mg,H3BO3 I. 6mg、肌醇 lOOmg、烟酸 0. 5mg、维生素 B6 0. 5mg、维生素 BI 0. 5mg 和甘氨酸2mg。
全文摘要
本发明涉及一种高黄酮含量马棘的培育方法，步骤包括取马棘的成熟种子为外植体，诱导愈伤组织，继代培养至成倍增殖期，暗条件预培养，进行农杆菌共培养转化，转移到筛选培养基进行3轮筛选，取抗性愈伤组织诱导分化成苗，对抗性植株进行标记基因组织化学染色和筛选基因分子检测，鉴定含目的基因黄酮醇合成酶基因FLS插入序列的分化小苗，对入选的转基因植株进行叶片内黄酮含量检测，选留黄酮含量高于3%的转基因植株，继续种植评价黄酮含量的表达稳定性，繁殖黄酮含量稳定高于3%的优良株系。本发明的高黄酮含量马棘，可以进行黄酮生物提取发展新型保健食品添加剂和营养强化剂。
文档编号A01H4/00GK102577950SQ201210028270
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月9日 优先权日2012年2月9日
发明者叶红霞, 吴殿星, 张宁, 沈晓霞, 舒小丽 申请人:浙江大学