昆虫抗性和除草剂耐受性大豆事件9582.814.19.1的制作方法
【专利摘要】大豆事件9582.814.19.1包含编码Cry1F、Cry1Ac(synpro)、和PAT的基因，其对含有该事件的大豆作物提供昆虫抗性和除草剂耐受性，并且实现用于植物保护和贮存产品保护的方法。
【专利说明】昆虫抗性和除草剂耐受性大豆事件9582.814.19.1
[0001]对相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2011年7月26日提交的临时申请N0.61/511，664和2011年8月10日提交的临时申请N0.61/521，798的优先权，这两篇通过提及完整收入本文。
[0003]发明背景
[0004]编码CrylF和CrylAc synpro (CrylAc)的基因能够对转基因植物赋予昆虫抗性，例如对鳞翅目(I印idopteran)昆虫的抗性；而编码PAT(膦丝菌素乙酰转移酶)的基因能够对转基因植物赋予对除草剂膦丝菌素(草丁磷)的耐受性。PAT已经在大豆中成功表达，既在生成昆虫抗性转基因作物中用作选择标志物，又在转基因作物中赋予对除草剂草丁磷的商业水平的耐受性。
[0005]已知外来基因在植物中的表达受到其在植物基因组中位置影响，这可能是由于染色质结构(例如异染色质)或整合位点附近的转录调节元件(例如增强子)的接近性所致(Weising等，Ann.Rev.Genet22:421-477, 1988)。同时，转基因在基因组中不同位置处的存在会以不同方式影响植物的总体表型。出于此原因，经常有必要筛选大量事件以鉴定以引入的感兴趣基因的最佳表达为特征的事件。例如，在植物中及在其它生物体中已经观察到事件间可以有引入基因的表达水平的较宽变化。还可以有表达的空间或时间方式的差异，例如转基因在各种植物组织中的相对表达差异，其不能对应于从引入的基因构建体中存在的转录调节元件预期的方式。出于此原因，常见的是生成数百至数千个不同事件，并且对那些事件筛选具有对于商业目的期望的转基因表达水平和方式的单一事件。具有期望的转基因表达水平或方式的事件可用于将转基因渐渗(intoogress)入其它遗传背景中，其通过使用常规育种方法的有性异性杂交(outcrossing)进行。此类杂交的后代维持初始转化体的转基因表达特征。此策略用于确保完全适合于地方生长条件的多种品种的可靠基因表达。
[0006]期望能够检测特定事件的存在`以测定有性杂交的后代是否含有转基因或感兴趣转基因的组。另外，用于检测特定事件的方法会有助于例如遵守要求自重组作物植物衍生的食物的销售前批准和标签的规则，或者有助于用于环境监测，监测田间作物的性状，或者监测自作物收获物衍生的产品，以及用于确保服从管理或合同条款的各方的顺应性。
[0007]有可能通过本领域中已知的任何核酸检测方法，包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)或使用核酸探针的DNA杂交来检测转基因事件的存在。这些检测方法一般聚焦于常用的遗传元件，诸如启动子、终止子、标志物基因，等等，因为对于许多DNA构建体，编码区是可互换的。因此，此类方法可能不可用于区别不同事件，特别是使用相同DNA构建体或非常相似的构建体生成的那些事件，除非与插入的异源DNA相邻的侧翼DNA的DNA序列是已知的。例如，对于玉米事件DAS-59122-7，事件特异性PCR测定法记载于美国专利申请2006/0070139。会期望具有用于鉴定大豆事件9582.814.19.1的简单且有区别力的方法。
[0008]发明概述
[0009]本发明涉及新的昆虫抗性和除草剂耐受性转基因大豆转化事件，称作大豆事件9582.814.19.1，其包含插入大豆细胞基因组内的特定位点中的如本文中描述的crylF，crylAc和pat。代表性大豆种子已经以段落[0021]中标识的登录号保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)。含有此事件的大豆植物的DNA包含本文中描述的接合(junction)/侧翼序列，其表征大豆基因组内插入DNA的位置。SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2诊断大豆事件 9582.814.19.1。更具体而言，SEQ ID NO:1 的 bpl400/1401，和 bpl536/1537，及 SEQ IDNO:2的bpl52/153处接合周围的序列诊断大豆事件9582.814.19.1。下文段落[00012]描述了包含含有大豆事件9582.814.19.1的大豆DNA特征性的这些接合的序列的例子。
[0010]在一个实施方案中，本发明提供了大豆植物或其部分，其对大豆夜蛾(Pseudoplusia includens)(大豆尺蠖(soybean looper))有抗性,并且具有包含一种或多种选自下组的序列的基因组:SEQ ID NO:1 的 bpl385-1415 ；SEQ ID NO:1 的 bpl350_1450 ；SEQ ID N0:1 的 bpl300-1500 ;SEQ ID NO:1 的 bpl200_1600 ;SEQ ID NO: 2 的 bpl37_168 ;SEQ ID N0:2的bpl03-203 ;和SEQ ID NO:2的bp3_303及其互补物。在另一个实施方案中，本发明提供了此类植物的种子。
[0011]在另一个实施方案中，本发明提供了一种控制昆虫的方法,其包括将昆虫暴露于昆虫抗性大豆植物，由此以控制所述昆虫，其中所述大豆植物具有含有一种或多种选自下组的序列的基因组:SEQ ID N0:1 的 bpl385-1415 ;SEQ ID NO:1 的 bpl350_1450 ;SEQID N0:1 的 bpl300-1500 ;SEQ ID NO:1 的 bpl200_1600 ;SEQ ID NO: 2 的 bpl37_168 ;SEQID N0:2的bpl03-203 ;和SEQ ID N0:2的bp3_303及其互补物；所述序列是大豆事件9582.814.19.1 存在特征性的。大豆事件 9582.814.19.1 中 crylF v3(crylF)和 cryIAcsynpro (cryIAc)基因的存在赋予对例如大豆夜蛾(大豆尺蠖)，黎豆夜蛾(Anticarsiagemmatalis)(黎豆毛虫(velvet bean caterpillar))，夜小卷蛾(Epinotia aporema)，Omoides indicatus,薄荷灰夜蛾(Rachiplusia nu),草地夜蛾(Spodoptera frugiperda),Spodoptera cosmoides,南方灰翅夜蛾(Spodoptera eridania)，烟芽夜蛾(Heliothisvirescens),美洲棉铃虫 (Heliocoverpa zea), Spilosoma virginica 和南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus Iignosellus)的抗性。
[0012]在另一个实施方案中，本发明提供了控制大豆作物中杂草的方法,其包括对大豆作物应用草丁磷除草剂，所述大豆作物包含具有基因组的大豆植物，所述基因组含有一种或多种选自下组的序列:SEQ ID N0:1 的 bpl385-1415 ;SEQ ID NO:1 的 bpl350_1450 ;SEQ ID N0:1 的 bpl300-1500 ;SEQ ID NO:1 的 bpl200_1600 ;SEQ ID NO: 2 的 bpl37_168 ;SEQ ID N0:2的bpl03-203 ;和SEQ ID N0:2的bp3_303及其互补物，其诊断大豆事件9582.814.19.1的存在。大豆事件9582.814.19.1中pat v6 (pat)基因的存在赋予对草丁磷除草剂的耐受性。
[0013]在另一个实施方案中，本发明提供了一种检测包含大豆DNA的样品中大豆事件9582.814.19.1的方法，所述方法包括:
[0014](a)使所述样品与长度至少IObp的第一引物和长度至少IObp的第二引物接触，所述第一引物选择性结合SEQ ID N0:1的bpl-1400或其互补物内的侧翼序列，所述第二引物选择性结合SEQ ID NO:1的bpl401-1836或其互补物内的插入物序列；并测定所述引物间生成的扩增子；或
[0015](b)使所述样品与长度至少IObp的第一引物和长度至少IObp的第二引物接触，所述第一引物选择性结合SEQ ID N0:2的bpl-152或其互补物内的插入物序列，所述第二引物选择性结合SEQ ID NO:2的bpl53-1550或其互补物内的侧翼序列；并
[0016](c)测定所述引物间生成的扩增子。
[0017]在另一个实施方案中，本发明提供了检测大豆事件9582.814.19.1的方法，其包括:
[0018](a)使所述样品与第一引物和第二引物接触，所述第一引物选择性结合选自下组的侧翼序列:SEQ ID NO:1的bpl-1400和SEQ ID NO: 2的bpl53_1550及其互补物，所述第二引物选择性结合SEQ ID NO:3或其互补物；
[0019](b)将所述样品进行聚合酶链式反应处理；并
[0020](c) (e)测定所述引物间生成的扩增子。
[0021]在另一个实施方案中，本发明提供了对大豆植物育种的方法，其包括:将第一植物与第二大豆植物杂交以生成第三大豆植物,所述第一植物包含DNA，该DNA包含一种或多种选自下组的序列:SEQ ID N0:1 的bpl385-1415 ;SEQ ID NO:1 的bpl350_1450 ;SEQ ID NO:1的 bpl300-1500 ;SEQ ID NO:1 的 bpl200_1600 ;SEQ ID NO: 2 的 bpl37_168 ;SEQ ID NO: 2的bpl03-203 ;和SEQ ID NO:2的bp3_303，及其互补物；并对所述第三大豆植物测定包含一种或多种选自下组的序列的DNA的存在:SEQ ID NO:1的bpl385_1415 ;SEQ ID NO:1的bpl350-1450 ；SEQ ID NO:1 的 bpl300_1500 ;SEQ ID NO:1 的 bpl200_1600 ;SEQ ID N0:2 的bpl37-168 ；SEQ ID NO:2 的 bpl03_203 ;和 SEQ ID NO:2 的 bp3_303，及其互补物。
[0022]在另一个实施方案中，本发明提供了诊断大豆事件9582.814.19.1的分离的DNA分子。在SEQ ID N0S:1和2外，此类分子包括包含SEQ ID NO:1的bpl400_1401和SEQID NO:1中相对于bpl400/1401接合的每个方向的至少IObp且长度至少25bp的分子；包含SEQ ID NO:2的152 - 153和SEQ ID N0:2中相对于bpl52/153接合的每个方向的至少IObp且长度至少25bp的扩增子。例子是SEQ ID NO:1的bpl385_1415 ;SEQ ID NO:1的bpl350-1450 ；SEQ ID NO:1 的 bpl3`00_1500 ;SEQ ID NO:1 的bpl200_1600 ;SEQ ID N0:2 的bpl37-168 ；SEQ ID NO:2 的 bpl03_203 ;和 SEQ ID NO:2 的 bp3_303，及其互补物。
[0023]在另一个实施方案中，本发明提供了控制大豆谷粒、种子或种子粗粉中的有害生物的方法，其包括在所述谷粒、种子或种子粗粉中包含大豆事件9582.814.19.1，如由包含一种或多种选自下组的序列的DNA的所述谷粒、种子或种子粗粉证明的:SEQ ID N0:1的bpl385-1415 ；SEQ ID NO:1 的 bpl350_1450 ;SEQ ID NO:1 的 bpl300_1500 ;SEQ ID NO:1 的bpl200-1600 ；SEQ ID NO:2 的 bpl37_168 ;SEQ ID NO:2 的 bpl03_203 ;和 SEQ ID N0:2 的bp3-303，及其互补物。
[0024]本发明还包括含有大豆事件9582.814.19.1的大豆植物细胞和植物部分，包括但不限于花粉、胚珠、花、枝条(Shoot)、根、和叶，及营养细胞的核、花粉细胞、种子和种子粗粉、和卵细胞。
[0025]在一些实施方案中，可以将大豆事件9582.814.19.1与其它性状组合，所述性状包括例如其它除草剂耐受性基因和/或昆虫抑制性蛋白质和转录调节序列(即RNA干扰，dsRNA，转录因子，等等)。可以经由植物育种，含有大豆事件9582.814.19.1的转基因植物的再转化，或经由同源重组通过靶向整合添加新性状将别的性状叠加到植物基因组中。
[0026]其它实施方案包括切割包含大豆事件9582.814.19.1 (包括例如pat基因表达盒)的多核苷酸序列。在切割多核苷酸序列后，可以将经修饰的事件在特定的染色体位置再靶向，其中别的多核苷酸序列与大豆事件9582.814.19.1叠加。
[0027]在一个实施方案中，本发明涵盖位于染色体02上在SEQ ID NO:1和2中列出的侧翼序列之间的大豆染色体靶位点。
[0028]在一个实施方案中，本发明涵盖生成转基因大豆植物的方法，其包括在染色体02上在SEQ ID N0:1和2中列出的基因组序列之间，即SEQ ID NO:1的bpl-1400和SEQ IDNO:2的bpl53-1550之间的位置处插入异源核酸。
[0029]另外，本发明提供了用于检测(例如大豆)样品中的主题事件的存在的测定法。测定法可以基于插入大豆基因组中的重组构建体的DNA序列，以及基于在插入位点侧翼的基因组序列。还提供了可用于进行测定法的试剂盒和条件。
[0030]本发明部分涉及源自在转基因大豆系中插入来自PDAB9582的T-DNA的边界区的DNA序列的克隆和分析。这些序列是独特的。基于插入物和接合序列，可以生成事件特异性引物。PCR分析证明了这些事件可以通过分析用这些事件特异性引物组生成的PCR扩增子来鉴定。如此，这些和其它相关规程可以用于独特鉴定包含本发明事件的大豆系。
[0031]种子保藏
[0032]作为此公开内容的一部分，包含大豆事件9582.814.19.1的大豆系的至少2500粒种子保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801UniversityBoulevard，Manassas, VA, 20110。ATCC于2011年7月21日接收保藏物ATCC专利保藏名称PTA-12006。生成此保藏物，并且为了专利规程的目的就种子保藏物而言会依照布达佩斯条约的条款或者在布达佩斯条约的条款下维持。生成此保藏物，并且为了专利规程的目的就种子保藏物而言会依照 布达佩斯条约的条款或者在布达佩斯条约的条款下维持。
[0033]序列简述
[0034]SEQ ID NO:1是大豆事件9582.814.19.1的5’DNA侧翼边界序列。核苷酸1-1400是基因组序列。核苷酸1401-1535是来自pDAB9582的重排序列。核苷酸1536-1836是插入物序列。
[0035]SEQ ID NO: 2是大豆事件9582.814.19.1的3’ DNA侧翼边界序列。核苷酸1-152是插入物序列。核苷酸153-1550是基因组序列。
[0036]SEQ ID NO: 3是pDAB9582的DNA序列，其在下文表1中注释。
[0037]SEQ ID N0:4是用于确认5’边界基因组DNA的寡核苷酸引物81419_FW3。
[0038]SEQ ID N0:5是用于确认3’边界基因组DNA的寡核苷酸引物81419_RV1。
[0039]SEQ ID N0:6是用于确认3’边界基因组DNA的寡核苷酸引物81419_RV2。
[0040]SEQ ID NO: 7是用于确认3’边界基因组DNA的寡核苷酸引物81419_RV3。
[0041]SEQ ID N0:8是用于确认5’边界基因组DNA的寡核苷酸引物5’ IREnd-Ol0
[0042]SEQ ID NO:9是用于确认5’边界基因组DNA的寡核苷酸引物5’ IREnd-02。
[0043]SEQ ID NO: 10是用于确认5’边界基因组DNA的寡核苷酸引物AtUbi 10RV1。
[0044]SEQ ID NO: 11是用于确认5’边界基因组DNA的寡核苷酸引物AtUbi 10RV2。
[0045]SEQ ID NO: 12是用于确认3’边界基因组DNA的寡核苷酸引物3’ PATEnd05。
[0046]SEQ ID NO: 13是用于确认3’边界基因组DNA的寡核苷酸引物3’ PATEnd06。
[0047]SEQ ID NO: 14是大豆事件9582.814.19.1的确认序列。包括5’基因组侧翼序列，PDAB9582T链插入物，和3’基因组侧翼序列。[0048]附图简述
[0049]图1是含有crylF、cryIAc和pat表达盒的pDAB9582的质粒图。
[0050]图2描绘了用于确认大豆事件pDAB9582.814.19.1的5’和3’边界序列的引物位置。
[0051]图3描绘了大豆事件PDAB9582.814.19.1中的基因组序列重排。
[0052]发明详述
[0053]已经对大豆事件9582.814.19.1插入的两个末端测序并表征。开发出事件特异性测定法。还已经将其定位至大豆基因组(大豆基因组02)。可以将事件渐渗入别的良种系中。
[0054]如上文在发明部分中提到的，对植物基因组中引入并整合转基因牵涉一些随机事件(因此名称“事件”代表表达的给定插入)。也就是说，凭借许多转化技术诸如土壤杆菌(Agrobacterium)转化，生物射弹转化(即基因枪)，和碳化硅介导的转化(即WHISKERS)，不可预测在基因组中转基因会在何处被插入。如此，鉴定插入物两侧的侧翼植物基因组DNA对于鉴定具有给定插入事件的植物可以是重要的。例如，可以设计PCR引物，其生成穿过插入物和宿主基因组的接合区的PCR扩增子。可以使用此PCR扩增子来鉴定独特的或不同类型的插入事件。
[0055]本文中提供的定义和实例是为了帮助描述本发明并指导本领域一般技术人员实施本发明。除非另有记录，应根据相关领域的一般技术人员的常规用法来理解术语。使用如列于37CFR § 1.822的DNA碱基命名法。
[0056]如用于本文，术语“后代”指包含大豆事件9582.814.19.1的亲本植物的任何世代的后代。
[0057]转基因“事件”是通过用异源DNA，即包含感兴趣的转基因的核酸构建体转化植物细胞，重新产生由将所述转基因插入植物基因组所得的植物群体，并选择由插入特定基因组位置所表征的特定植物来产生。术语“事件”指含有所述异源DNA的起始转化体和转化体后代。术语“事件”还指通过转化体和含有基因组/转基因DNA的另一品种之间的有性异型杂交(outcross)产生的后代。即使在与回归(recurrent)亲本的反复回交之后,插入的转基因DNA和来自转化的亲本的侧翼基因组DNA (基因组/转基因DNA)仍存在于杂交后代的相同染色体位置处。术语“事件”还指来自包含插入的DNA和直接邻接插入的DNA的侧翼基因组序列的起始转化体及其后代的DNA,期待其会转移至下述后代,所述后代作为一个含有所述插入的DNA的亲本系(例如起始转化体和其自交所得的后代)和不含有该插入的DNA的亲本系有性杂交的结果而接受了含有感兴趣的转基因的插入的DNA。
[0058]“接合序列”或“边界序列”跨越了插入基因组的DNA与来自插入点侧翼的大豆天然基因组的DNA连接的点，其中植物基因物质中一种或其他接合序列的鉴定或检测足以对所述事件具诊断性。包括了跨越本文中所述的大豆事件中的插入和类似长度的侧翼DNA的DNA序列。本文中提供了此类诊断性序列的具体实例；然而，其他与插入的接合或插入和基因组序列的接合重叠的序列也具诊断性，并可根据本发明使用。
[0059]本发明部分涉及使用此类侧翼、接合和插入物序列的事件鉴定。本发明包括相关的PCR引物和扩增子。根据本主题发明，使用跨越插入的DNA及其边界的扩增子的PCR分析方法可用于检测或鉴定商业化的转基因大豆品种或来源于本主题专利的转基因玉米品系白勺品系。
[0060]侧翼/接合序列诊断出大豆事件9582.814.19.1。基于这些序列，生成事件特异性弓丨物。PCR分析证明了可通过对用这些事件特异性引物组生成的PCR扩增子的分析来在不同的玉米基因型中鉴定这些大豆品系。如此，这些和其他相关规程可用于独特地鉴定这些玉米品系。本文中鉴定的序列是独特的。
[0061]本主题发明的检测技术特别地可与植物育种一同使用，以确定在为了将一种或多种其他感兴趣的性状赋予后代，将包含感兴趣的事件的亲本植物与另一种植物品系杂交之后，哪些后代植物包含给定事件。这些PCR分析方法有利于大豆育种项目以及质量控制，特别是对于商业化转基因大豆种子。现在亦可制备并使用用于这些转基因大豆品系的PCR检测试剂盒。这亦可帮助产品登记和产品管理。
[0062]此外，可使用侧翼大豆/基因组序列以特异性鉴定每个插入物的基因组位置。该信息可用于制作特异于每一个事件的分子标志物系统。这些可用于加速育种策略和构建连锁数据。
[0063]此外，可使用侧翼序列信息以研究和表征转基因整合过程，基因组整合位点特征，事件分选，转基因及其侧翼序列的稳定性，和基因表达(特别涉及基因静默，转基因甲基化样式，位置效应，和潜在的表达相关元件，如MARS (基质连接区)等)。
[0064]对于所有主题公开，应显而易见本主题发明包括以段落[0021]中标识的ATCC保藏号可获得的种子。本主题发明还包括从以段落[0021]中标识的ATCC保藏号保藏的种子培育的除草剂抗性大豆植物。本主题发明进一步包括所述植物的部分，如叶、组织样品、由所述植物产生的种子、花粉等(其中它们包含crylF, cryIAc, pat,和SEQ ID NO:1和2)。
[0065]此外，本主题发明包括从保藏的种子培育的植物的后裔和/或后代植物，优选为除草剂抗性大豆植物，其中所述植物具有包含如本文所述的可检测的野生型接合序列的基因组。如用于本文，术语“大豆”意指大豆(Glycine max)，并包括所有其可与大豆植物育种的品种。
[0066]本发明进一步包括使用本主题发明的植物作为至少一个亲本来进行杂交的过程。举例而言，本主题发明包括具有本文中例示的任何植物作为一个或两个亲本的F1杂交植物。本主题发明还包括由此类本主题发明的Fl杂合体产生的种子。本发明包括用于产生F1杂合体的方法，即将例示的植物与不同(例如，近交的亲本)植物杂交和收获所得的杂交种子。本主题发明包括作为母本或父本的示例性植物。所得的植物的特征亦可通过慎重选择亲本植物来改善。
[0067]可培育本发明的昆虫抗性/草丁磷耐受性大豆植物，即首先将由本文中提及的任何一种品系种子培育的大豆植物组成的第一亲本大豆植物和第二亲本植物有性杂交，由此产生多株第一后代植物，然后选择对草丁磷有抗性的第一后代植物；将第一后代植物自交，由此产生多株第二后代植物，然后从第二后代植物选择对草丁磷有抗性的植物。这些步骤可进一步包括将第一后代植物或第二后代植物与第二亲本大豆植物或第三亲本大豆植物回交。然后可种植包含本主题发明或其后代的大豆种子的大豆作物。
[0068]亦可理解的是，亦可使两种不同转基因植物交配以产生含有两种独立分离添加的外源基因的后代。合适后代的自交可产生对于两种添加的外源基因为纯合的植物。亦考虑了回交于亲本植物和与非转基因植物的异型 杂交，以及营养繁殖。其他常用于不同性状和作物的育种方法在本领域是已知的。使用了回交育种以将简单遗传的高度可遗传性状的基因转移至期望的纯合栽培种或近交系，其为回归亲本。待转移的性状的来源称为供体亲本。期待所得的植物具有回归亲本(例如栽培种)的特征和从供体亲本转移的期望的性状。在起始杂交之后，选择了拥有供体亲本的表型的个体，并将其反复与回归亲本杂交(回交)。预期所得的亲本具有回归亲本(例如栽培种)的特征，和从供体亲本转移的期望的性状。
[0069]同样地，可以使用本领域中已知的方法用别的转基因转化本发明的昆虫抗性/草丁磷耐受性大豆植物。转化技术诸如土壤杆菌转化、生物射弹转化(即基因枪)，和碳化硅介导的转化(即WHISKERS)可以用于将别的转基因导入大豆事件9582.814.19.1的基因组中。可以对含有新插入的转基因的转基因植物完成选择和表征以鉴定在本发明的crylF, cryIAc, pat基因外含有新转基因的稳定整合子(integrant)的植物。
[0070]本发明的DNA分子可作为分子标志物用于标志物协助育种(MAB)方法。本发明的DNA分子可如本领域已知地用于鉴定遗传连锁的农艺学上可用的性状的方法(如AFLP标志物，RFLP标志物，RAPD标志物，SNP和SSR)。可使用MAB方法在与本主题发明的大豆植物的杂交(或其后代和任何其他大豆栽培种或品种)的后代中追踪昆虫抗性和除草剂耐受性性状。所述DNA分子为针对该性状的标志物，且本领域中公知的MAB方法可用于追踪大豆植物中的除草剂抗性性状，其中至少一种本主题发明的大豆品系或其后代为亲本或祖先。本发明的方法可用于鉴定具有本主题事件的任何大豆品种。
[0071]本主题发明的方法包括产生昆虫抗性/除草剂耐受大豆植物的方法，其中所述方法包括用本主题发明的植物育种。更具体而言，所述方法可包括将两株本主题发明的植物杂交，或一株本主题发明的植物与任何其他植物杂交。优选的方法进一步包括通过就根据本主题发明可检测的事件和有利的品种性能(例如产量)分析所述后代来选择所述杂交的后代。举例而言，本主题发明可用于通过与包含其他所需的性状如农艺学性状、疾病耐受性或抗性，线虫耐受性或抗性和成熟日期的植物的育种循环来追踪本主题事件。可检测、鉴定、选择包含本主题事件和所需的性状的植物，并例如在进一步的育种轮次中快速使用。本主题事件/性状亦可通过育种来与其它昆虫抗性性状和/或其他的除草剂耐受性状组合，并根据本主题发明进行追踪。后者的实施方案为包含与赋予对2，4- 二氯苯氧基乙酸和吡唳基氧乙酸酯(pyridyloxyacetate)除草剂的耐受性的aad_12基因或者与编码对除草剂麦草畏(dicamba)的抗性的基因组合的本主题事件的植物。
[0072]因此，本主题发明可与，例如编码草甘膦抗性(例如抗性植物或细菌EPSPS，G0X,GAT)，草铵膦抗性(例如pat，bar)，乙酰乳酸合酶(ALS)抑制性除草剂抗性(例如咪唑啉酮[如咪草烟Qmazethapyr)]、磺酰脲、三唑并喃唳磺酰苯胺、喃唳基硫代苯甲酸类和其他化学物[Csr I，SurA等])，溴苯腈抗性(例如Bxn)，对HPTO酶(4-羟基苯基丙酮酸双加氧酶)抑制剂的抗性，对八氢番爺红素去饱和酶(phytoene desaturase) (PDS)的抑制剂的抗性，对光系统II抑制性除草剂(例如PsbA)的抗性，对光系统I抑制性除草剂的抗性，对原口卜啉原氧化酶(protoporphyrinogen oxidase IX (PPO))抑制性除草剂(例如PP0-1)的抗性，对苯基脲除草剂(例如CYP76B1)的抗性，麦草畏降解酶(dicamba-degrading enzyme)(参见，例如US20030135879)，和其他可单独或以多种组合叠加的性状相组合，以提供有效控制或预防杂草演替(weed shift)的能力和/或对于任何前述类型的除草剂的抗性。
[0073]此外，大豆事 件9582.814.19.1可与一种或多种其他输入(例如，昆虫抗性，病原体抗性，或应激耐受性等)或输出(例如增加的产量，改善的油分布(profile)，改善的纤维品质等)性状叠加。因此本主题发明可用于提供改善的作物品质与灵活且合算地控制任何数量的农艺学病虫害的能力的完整农艺学套组(package)。
[0074]本领域内已描述了通过同源重组将多核苷酸序列整合在植物细胞的特定染色体位点内的方法。举例而言，描述于美国专利申请
【发明者】N.巴德, G.布拉德费希, Y.C.崔, J.E.德里普斯, T.霍夫曼, D.帕雷迪, D.M.帕克赫斯特, S.G.托勒多, B.维金斯, N.周 申请人:陶氏益农公司