专利名称：鉴别或辅助鉴别花脸蘑原生质体单核体交配型的方法及其专用引物对sr-5×13的制作方法
技术领域：
本发明涉及鉴别或辅助鉴别花脸蘑原生质体单核体交配型的方法及其专用引物对 SR-5X13。
背景技术：
营养不亲和系统是一种识别异己的遗传系统，在多数真菌中，该系统能引起遗传上明显不同的个体在 交接区产生特征性的体细胞不亲和性(戚元成等，中国栽培糙皮侧耳品种体细胞不亲和性实验与RAro分析结果的比较.菌物学报，2010，29 (3))反应，体细胞不亲和性反应的强度因个体不同而异。在真菌中，营养不亲和又称为体细胞不亲和或异核体不亲和，它的作用在于防止同一种内交配型不同的个体或营养不亲和位点上基因不同的个体间的融合，以保持个体遗传上的稳定性。交配型是根据交配因子的个体间能否完成交配结合而确定的结合类型(中国标准出版社第一编辑室，中国农业标准汇编(食用菌卷).中国标准出版社，2010)。在真菌的有性生殖和营养生长过程中都存在一个自己或异己识别的机制或系统。有性生殖阶段靠交配型因子识别；而营养生长阶段的识别是靠异核体不亲和系统来进行的。异核体不亲和性是普遍存在于真菌中的一种生物学现象，在子囊菌、担子菌、接合菌等真菌中是一种普遍存在的现象。在异核体形成过程中，非己识别系统通过一系列蛋白因子的相互作用最终导致遗传背景不同的核不能形成稳定的异核体，也就是所谓的异核不亲和性。异核体不亲和性是一个受基因调控的过程并且往往异核体不亲和性的菌丝体会死亡。异核菌丝体在原生质体制备过程中出现单核原生质体的现象。这些单核原生质体经过再生培养和遗传筛选成为原生质体单核体，由于原生质体单核体是直接来源于营养菌丝，没有经历过减数分裂的无性后代，它为食用菌的遗传和育种研究提供了一种十分重要的基础材料。原生质体单核体的杂交育种方式是把两个分别来自双核亲本的原生质体单核体两两接入同一 PDA平板，对峙培养进行杂交。在杂交过程中，两个原生质体单核体的细胞质进行重组，形成一个异质异核的杂交后代。这一方法的主要特点是，根据亲本性状不易在原生质体单核体中分散和稀释，在育种程序中可以从一个比较小的变异范围内去选择具有亲本性状的不育单核体，有效地克服了传统育种过程中由孢子单核体遗传多样性所造成的亲本性状分散和选材困难的障碍，减少了筛选杂交后代的工作量。同时，由于原生质体单核体是在实验室条件下获得的，无季节性限制，因此缩短了育种时间。花脸蘑Lepista sordida (Fr) Sing 属于担子菌亚门(Basidiomycomycotina)、层菌纲(Hymenomycetes)、伞菌目(Agaricales)、口蘑科(Tricholomataceae)、香蘑属(Lepista)。该菌营养丰富，具有一定的药用功效。在中国主要分布于贵州、黑龙江、辽宁、河北、河南、甘肃、青海、四川、新疆、山西、内蒙古和福建等地，是一种名贵的食用菌和药用菌，人工栽培花脸香蘑还处于小规模试验阶段，野生产量低且稀少，其价格极其昂贵，是一种很有开发潜力的野生菌种。但实际生产中存在产量低，抗虫能力差，适应温度范围窄，子实体易碎，不易运输、保存等亟待解决的难题。这就要求花脸蘑的遗传育种相关的基础研究加大力度，为传统的遗传育种奠定坚实的理论基础和技术支持。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种鉴别或辅助鉴别花脸蘑原生质体单核体交配型的方法及其专用引物对SR-5X13。本发明所提供的鉴别或辅助鉴别花脸蘑原生质体单核体交配型的PCR引物对，名称为SR-5X 13，由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的两条单链DNA组成。其中，SEQ ID N0.1由19个脱氧核苷酸组成，SEQ ID N0.2由20个脱氧核苷酸组成。含有PCR引物对SR-5X 13的鉴别或辅助鉴别花脸蘑原生质体单核体交配型的试剂或试剂盒也属于本发明的保护范围。所述试剂或试剂盒除PCR引物对SR-5 X 13外，还含有进行PCR和DNA测序的其它常规试剂。本发明的实验证 明PCR引物对SR-5X 13、含有PCR引物对SR-5X 13的试剂或试剂盒可用于鉴别或辅助鉴别花脸蘑原生质体单核体交配型。本发明所提供的鉴别或辅助鉴别花脸蘑原生质体单核体交配型的方法，包括如下步骤:分别以待鉴别的两株花脸蘑原生质体单核体的基因组DNA为模板，用由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2的两条单链DNA组成的PCR引物对SR-5X 13进行PCR扩增，检测所得到的PCR产物的大小，根据PCR扩增产物的大小按照下述方法确定所述待鉴别的两株花脸蘑原生质体单核体的交配型:如果所述待鉴别的两株花脸蘑原生质体单核体的PCR产物均含有500bp_800bp的DNA片段(或所述待鉴别的两株花脸蘑原生质体单核体的PCR产物均为500bp-800bp的DNA片段)，所述待鉴别的两株花脸蘑原生质体单核体的交配型相同或候选为交配型相同，如果所述待鉴别的两株花脸蘑原生质体单核体的PCR产物均不含有500bp-800bp的DNA片段(或所述待鉴别的两株花脸蘑原生质体单核体的PCR产物均不为大小是500bp-800bp的DNA片段)，所述待鉴别的两株花脸蘑原生质体单核体的交配型相同或候选为交配型相同；如果所述待鉴别的两株花脸蘑原生质体单核体中的一株待鉴别的花脸蘑原生质体单核体的PCR产物含有500bp-800bp的DNA片段(或所述待鉴别的两株花脸蘑原生质体单核体中的一株待鉴别的花脸蘑原生质体单核体的PCR产物为500bp-800bp的DNA片段)，另一株待鉴别的花脸蘑原生质体单核体的PCR产物不含有500bp-800bp的DNA片段(或另一株待鉴别的花脸蘑原生质体单核体的PCR产物不为500bp-800bp的DNA片段)，所述待鉴别的两株花脸蘑原生质体单核体的交配型不同或候选为交配型不同。上述方法中，所述500bp-800bp的DNA片段具体为728bp的DNA片段。在本发明的一个实施例中，所述PCR扩增采用的引物退火条件为53°C退火30s。所述PCR扩增中采用的PCR反应温度程序如下:94°C预变性5min ;94°C变性30s，53°C退火30s, 72°C延伸 40s, 30 个循环；72°C延伸 7min。上述方法中，两株花脸蘑原生质体单核体的交配型相同是指将两株花脸蘑原生质体单核体在一起对峙培养，两株花脸蘑原生质体单核体的菌丝交接处无拮抗线，不能产生锁状联合；两株花脸蘑原生质体单核体的交配型不同是指将两株花脸蘑原生质体单核体在一起对峙培养，两株花脸蘑原生质体单核体的菌丝交接处有拮抗线并产生锁状联合，杂交可育。实验证明，本发明的特异性引物对SR-5X 13对花脸蘑原生质体单核体具有特异性，本发明利用PCR引物对SR-5X 13鉴别花脸蘑原生质体单核体间的交配型是否相同的方法与现有的体细胞不亲和性实验方法鉴别花脸蘑原生质体单核体间的交配型是否相同的方法的一致性为100%。本方法缩短了花脸蘑原生质体单核体交配型的鉴别时间并简化了交配型鉴别的步骤，其准确性和可靠性高。通过原生质体单核化获得的单核体称为原生质单核体，与孢子单核体不同，原生质体单核体在原生质体制备过程中从花脸蘑异核菌丝体中直接得到的单核单倍体的无性后代，因此花脸蘑的原生质单核体只有两种形式的交配型AxBx和AyBy两对。在常规的杂交育种中，只有交配型不同的单核菌株是杂交可育的，因此交配型的鉴定是杂交育种的前提和必要条件。本发明对研究花脸蘑的遗传育种及生产实践具有重要意义。本发明适用于食用菌生产、菌种选育等相关专业领域对花脸蘑原生质体原生质单核体的鉴别及遗传育种等方面的研究。
图1为用本发明引物对SR-5X 13对部分花脸蘑原生质体单核体的PCR扩增产物电泳图。图中，I至9号对应菌株依次为:110号，67号，55号，137号；179号，139号，100号，65号，双核菌株；M:DNA Marker。图2为用引物ISSR-818对花脸蘑原生质体单核体进行PCR的电泳图。图中，I至7对应的菌株依次为:110号，58号,99号，179号，69号，104号，双核菌株的基因组DNA;M:DNA Marker。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。花脸蘑Lepista sordida (Fr) Sing (燕继晔等.花脸蘑蛋白粗提液控制辣椒病毒病及促生作用研究.中国生物防治学报28(2)269-274)公众可从野外采集，也可从商业途径获得，还可从北京市农林科学院获得，以重复本发明实验。在下文中，均简称花脸蘑。1、下述实施例中的花脸蘑原生质体单核体均通过原生质体单核化获得，具体方法如下:1.1培养基MM缓冲液由溶质和溶剂组成；所述溶剂为50mM马来酸缓冲液(pH5.5);所述溶质及其在MM缓冲液中的浓度如下:0.5M甘露醇。液体MCM培养基:将酵母提取物2g、胰蛋白胨2g、葡萄糖20g、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾0.5g和磷酸氢二钾Ig溶于水并用水定容至1L。固体MCM平板:在液体MCM培养基中添加琼脂，使其浓度为20g/L。
固体再生平板(RM)的制备方法:在液体MCM培养基中添加山梨醇和琼脂，使其浓度分别为IM和20g/L。1.2原生质体制备I)取花脸蘑菌丝于液体MCM培养基中，160rpm、25°C培养4天(3-5天均可)，用3层无菌擦镜纸过滤并收集菌丝，然后用0.6M甘露醇水溶液洗涤2-3次。2)将步骤I)的花脸蘑菌丝(约Ig)悬浮于1.5%溶壁酶溶液(将1.5g溶壁酶用0.6M甘露醇水溶液溶解并定容至IOOmL ;溶壁酶购自广东碧德生物科技有限公司，产品目录号:Bd_8110001023)，在水浴摇床(32°C、60rpm)中温浴2小时，用3层无菌擦镜纸过滤并收集滤液。3)将步骤2)的滤液3000rpm离心IOmin并收集沉淀。4)将步骤3)的沉淀用MM缓冲液洗涤三次后，悬浮于100 μ I MM缓冲液中，即为原生质体溶液。1.3原生质单核体的获得将获得的原生质体用丽缓冲液稀释至浓度为IO3-1O4个/mL，均匀涂布于RM上，28 °C静置培养10-14天；待生长出来单菌落后用无菌接种针转接至固体MCM培养基上，28 V培养5-7天。将获得的原生质单核体依次编号，并在放大400倍的显微镜(Olympus BX51)下观察，如果没有发现锁状联合，则该菌株为花脸蘑原生质体单核体。共得到30株花脸蘑原生质体单核体，它们的编号分别为 36、42、50、53、55、58、61、65、66、67、69、71、72、75、81、82、86、87、88、99、100、104、110、111、113、117、119、137、139、179。2、下述实施例 中的花脸蘑原生质体单核体的交配型按照下述拮抗实验方法鉴别PDA培养基:200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水IOOOml煮沸半个小时，纱布过滤，取滤液再加20g葡萄糖和20g琼脂，121°C灭菌20分钟。将两株待鉴别交配型的花脸蘑原生质体单核体一起接种到PDA培养基上，两者之间间开2cm，25°C培养7-10天。如果两株待鉴别交配型的花脸蘑原生质体单核体的菌丝长在一起，在显微镜下观察交接处的菌丝没有锁状联合，该两株待鉴别交配型的花脸蘑原生质体单核体的交配型相同。如果两株待鉴别交配型的花脸蘑原生质体单核体的菌丝交汇的地方有拮抗线，则挑取拮抗线上的菌丝，至PDA培养基上25°C培养3-5天后，在显微镜下观察是否有锁状联合，若无锁状联合，该两株待鉴别交配型的花脸蘑原生质体单核体的交配型相同；若有锁状联合，该两株待鉴别交配型的花脸蘑原生质体单核体的交配型不同。按照该方法鉴别1.3得到的30株花脸蘑原生质体单核体的交配型，结果如表I和2所示。表I和表2中，“ V ”表示两个菌株之间体细胞不亲和性实验有拮抗线，两个菌株的交配型不同X ”表示两个菌株之间体细胞不亲和性实验无拮抗线，两个菌株的交配型相同。表1.体细胞不亲和性实验方法鉴别花脸蘑原生质体单核体间的交配型是否相同的结果
权利要求
1.鉴别或辅助鉴别花脸蘑原生质体单核体交配型的方法，包括如下步骤:分别以待鉴别的两株花脸蘑原生质体单核体的基因组DNA为模板，用由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的两条单链DNA组成的PCR弓丨物对进行PCR扩增，检测所得到的PCR产物的大小，根据PCR扩增产物的大小按照下述方法确定所述待鉴别的两株花脸蘑原生质体单核体的交配型: 如果所述待鉴别的两株花脸蘑原生质体单核体的PCR产物均含有500bp-800bp的DNA片段，所述待鉴别的两株花脸蘑原生质体单核体的交配型相同或候选为交配型相同，如果所述待鉴别的两株花脸蘑原生质体单核体的PCR产物均不含有500bp-800bp的DNA片段，所述待鉴别的两株花脸蘑原生质体单核体的交配型相同或候选为交配型相同；如果所述待鉴别的两株花脸蘑原生质体单核体中的一株待鉴别的花脸蘑原生质体单核体的PCR产物含有500bp-800bp的DNA片段，另一株待鉴别的花脸蘑原生质体单核体的PCR产物不含有500bp-800bp的DNA片段，所述待鉴别的两株花脸蘑原生质体单核体的交配型不同或候选为交配型不同。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述500bp-800bp的DNA片段为728bp的DNA片段。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述PCR扩增采用的引物退火条件为53°C退火30s。
4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于:所述PCR扩增中采用的PCR反应温度程序:94°C预变性5min ;94°C变性30s，53°C退火30s，72°C延伸40s，30个循环；72°C延伸7min。
5.权利要求1-4中任一所述的方法在花脸蘑育种中的应用。
6.鉴别或辅助鉴别花脸蘑原生质体单核体交配型的PCR引物对，其特征在于:所述引物对的名称为SR-5X 13，由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的两条单链DNA组成。
7.含有权利要求6所述的PCR引物对的鉴别或辅助鉴别花脸蘑原生质体单核体交配型的试剂。
8.含有权利要求6所述的PCR引物对的鉴别或辅助鉴别花脸蘑原生质体单核体交配型的试剂盒。
9.权利要求6所述的PCR引物对、权利要求7所述的试剂或权利要求8所述的试剂盒在鉴别或辅助鉴别花脸蘑原生质体单核体交配型中的应用。
10.权利要求6所述的PCR引物对、权利要求7所述的试剂或权利要求8所述的试剂盒在花脸蘑育种中的应用。
全文摘要
本发明公开了鉴别或辅助鉴别花脸蘑原生质体单核体交配型的方法及其专用引物对SR-5×13。该方法包括如下步骤分别以待鉴别的两株花脸蘑原生质体单核体的基因组DNA为模板，用由SEQ ID No.1和2所示的PCR引物对进行PCR扩增，检测所得到的PCR产物的大小，如果所述待鉴别的两株原生质体单核体的PCR产物均含有500bp-800bp的DNA片段或均不含有500bp-800bp的DNA片段，该两株花脸蘑原生质体单核体的交配型相同；如果所述待鉴别的两株原生质体单核体中的一株待鉴别的花脸蘑原生质体单核体的PCR产物含有500bp-800bp的DNA片段，另一株待鉴别的花脸蘑原生质体单核体的PCR产物不含有500bp-800bp的DNA片段，该两株花脸蘑原生质体单核体的交配型不同。
文档编号A01H1/04GK103184282SQ20131004373
公开日2013年7月3日 申请日期2013年2月4日 优先权日2013年2月4日
发明者许峰, 刘宇, 赵爽, 李登进, 王守现, 耿小丽, 王兰青 申请人:北京市农林科学院