生防枯草芽孢杆菌株sh7的发酵培养方法及使用该方法培养所得生防枯草芽孢杆菌sh7的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，涉及生防枯草芽孢杆菌株SH7的发酵培养方法及使用该方法培养所得生防枯草芽孢杆菌SH7，本发明方法按顺序包括如下步骤：（1）种子准备：将枯草芽孢杆菌SH7菌株接种于牛肉汁液体种子培养基中，灭菌，37℃过夜摇菌得种子菌液，所述牛肉汁液体种子培养基包含酵母粉、葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏；（2）发酵培养：于发酵培养基中接种步骤（1）的种子菌液，摇菌36h后取发酵完毕的菌液，离心5分钟，倒掉上清液，冷冻干燥后，称重。本发明所筛选出的芽孢杆菌SH7对烟草青枯病菌表现出了良好的拮抗性，温室药效试验达到了较高的水平，前景广阔，本发明方法为枯草芽孢杆菌的生产应用打下了良好的基础。
【专利说明】生防枯草芽孢杆菌株SH7的发酵培养方法及使用该方法培养所得生防枯草芽孢杆菌SH7
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，涉及生防枯草芽孢杆菌株SH7的发酵培养方法及使用该方法培养所得生防枯草芽孢杆菌SH7。
【背景技术】
[0002]烟草细菌性青枯病是由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种典型的维管束病害，最显著的症状是枯萎，且枯萎的速度很快，一旦发病即可造成全株死亡，是烟草上一大毁灭性病害。目前在我国长江流域及其以南烟区普遍发生；在多发病区旱地烟田的发病率为30%-50%，特别是旱地重茬连作烟田的发病率为50%以上；尤以华南烟区为害严重，个别年份暴发流行。近几年来，该病的发病和为害范围有向北方烟区扩展的趋势，在山东、河南、陕西及辽宁等省都有发生，局部地区为害较重。目前该病造成的损失已居各类病害的第四位，必须重视该病的防治工作。尤其近年以来由根结线虫造成的伤口引起的青枯病、黑胫病复合侵染的危害呈上升趋势，造成烟田严重减产。鉴于化学防治对环境的污染和生态平衡的破坏，因此烟草青枯病的生物防治越来越被重视。
[0003]烟草是我国重要的经济作物，中国烤烟的主要产区分布在云南、贵州、四川、湖北、湖南、陕西、河南、安徽、山东、辽宁、吉林、黑龙江等20多个省区的近900个县市。其中，云南省是我国烟草种植面积最大的省。中国烟叶的质量在不断提高，全国良种化面积达到90%以上，是世界上最大的烟草生产国。
[0004]在烟草生产上病害是严重影响产量和质量的重要因素。烟草细菌性青枯病又称“烟痕”，是由Ralstonia solanacearum引起的一种维管束病害，主要侵染烟草根部和莖，也可侵染叶片；在苗床和大田均能发生，常造成烟株大片枯萎死亡，是一种毁灭性的土传病害。1864年印度尼西亚首先报道在烟草上引起毁灭性的损失；在美国，1880年首次发现此病，1910年大面积流行，随后美国一些农场被迫停止种烟。此病广泛分布于世界热带、亚热带及温带等湿热地区；我国烟草青枯病菌的地理分布长江以南发生居多，依发病高低可划分为4个区，多发病区包括广东、江西、福建、湖南、四川、浙江、安徽等省区；次发病区包括贵卅、湖北；偶发病区包括云南、河南、山东、陕西、辽宁；其余为无病区，各区的划分是相对的，区间存在过渡带；呈现由西向东、由北向南逐渐增加的趋势。
[0005]烟草细菌性青枯病菌的寄主范围很广，可侵染50多个科200余种植物，是番茄、马铃薯、烟草、花生、甘薯、茄子、生姜、香蕉以及一些贵重药品和花卉等植物生产的重要限制因素。大多数禾本科植物及棉花、甘薯和麻类作物不受侵染。病菌主要在土壤和堆肥中越冬，也可以潜伏在种子、根际或生长着的寄主体内越冬；一般条件下，是从根部伤口侵入，不能从气孔侵入。青枯病的主要初次侵染来源是土壤、病残组织和肥料中的病菌，这些病原菌靠雨水、排灌水、病土、带菌苗、疫苗、人畜、生产工具及昆虫进行扩散远距离传播。
[0006]烟草青枯病在苗床和大田均能发生。主要侵染烟株根、茎，也可侵染叶片，染病叶片初期仍为绿色悬挂在茎上，故称“青枯病”;天气炎热时，病株的叶片呈不规则的灼伤，叶片变干，边缘脱落。病株的茎呈直立状，茎上垂着死亡的叶片。土壤湿度大时，根软腐发粘，致使全株枯死。
[0007]利用有益微生物防治植物病害，已成为一个十分活跃并开始显示良好应用前景的领域。许多论著报道(Cook, K.J.and Baker K.F.The nature and practice of biologicalcontrol of plant pathogens.1984, APS press USA)认为生物防治在未来农业中具有重要地位。大量的研究表明，生防细菌在其生长发育中产生多种拮抗性或竞争性的代谢产物，通过直接或间接作用，达到阻碍或杀死病原菌的效果。无论是自然发生的生物防治现象还是人们用于生物防治的生物类型中，细菌的作用是非常明显的。其主要优势在于:1)细菌的种类和数量众多，在植物根际和地上部大量存在；2)细菌对病原菌的作用方式较广，可以通过竞争、拮抗和诱导植物产生抗性等方式对病原菌产生影响；3)具有惊人的繁殖速度；4)许多细菌存在于植物根际和地上部，对植物的生态比较适宜；5)细菌大多可以人工培养，便于控制，在实践中易于操作；6)有些细菌不仅能防治病害而且可以增加作物产量(程亮等，拮抗细菌的研究进展[J].江西农业大学学报，2003，25(5):732~736)。表现出或被认为有生防潜力的有益细菌种类众多(Dviad M.Biological Control of Soilbrone PlantPathogens in the Rizhosphere with Bacteria.Ann.Rev.Phytopathol.1988, 26:379 ~407);包括了许多属的细菌，目前成功应用的植物病害生防细菌有Agrobacterium、Bacillus、Pseudomonas> Erwinia、Xanthomonas 等属的一些菌株。
[0008]烟草青枯病是烟草生产中最严重的病害之一，每年都造成烟叶产量的严重损失和品质下降，是烟草生产中一个很重要的制约因素。而作物青枯病生防枯草芽孢杆菌株SH7能有效地防治和减轻烟草青枯病的危害，但是现有技术中发酵培养该菌株产量低，不适合大量发酵用。
【发明内容】
[0009]根据上述领域的需求和不足，本发明提供一种作物青枯病生防枯草芽孢杆菌株SH7的发酵培养方法。该方法为作物青枯病生防枯草芽孢杆菌株SH7的生产应用打下了良好的基础。
[0010]本发明的技术方案如下:
[0011]生防枯草芽孢杆菌株SH7的发酵培养方法，其特征在于，按顺序包括如下步骤:
[0012](I)种子准备:将生防枯草芽孢杆菌SH7菌株接种于牛肉汁液体种子培养基中，灭菌，37°C过夜摇菌得种子菌液，所述牛肉汁液体种子培养基包含酵母粉、葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏；
[0013](2)发酵培养:于发酵培养基中接种步骤(1)的种子菌液,摇菌36h后取发酵完毕的菌液，离心5分钟,倒掉上清液,冷冻干燥后，称重。
[0014]所述发酵培养基包含牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、氯化钠、淀粉、30.8mg/L的硫酸锰溶液。
[0015]所述发酵培养基中含有牛肉膏0.3份、蛋白胨1份、葡萄糖1份、氯化钠0.5份。
[0016]所述发酵培养基各成分重量份配比为牛肉膏0.3份、蛋白胨1份、葡萄糖1份、氯化钠0.5份、淀粉0.3份、30.8mg/L的硫酸锰溶液0.1份。
[0017]步骤(2)中，发酵培养基的pH值为7.9-8.2 ;300ml的三角瓶的装瓶量为40_80ml ；接种量4%-8% ;培养温度为28-31 °C;培养转速为150r/min-240r/min ;发酵时间为24h_60h。
[0018]发酵培养基的pH值为8.2 ；300ml的三角瓶的装瓶量为60ml ;接种量8% ;培养温度为31°C ;培养转速为150r/min ;发酵时间为48h。
[0019]所述牛肉汁液体种子培养基按如下方法配制:将酵母粉0.5g、葡萄糖10g、蛋白胨5g、牛肉膏3g、加入容器定容至1L。
[0020]上述的发酵培养方法在培养作物青枯病生防枯草芽孢杆菌株SH7中的应用。
[0021]上述的发酵培养方法直接培养的生防枯草芽孢杆菌SH7。
[0022]本发明发明人通过对该菌培养基配方和培养条件的优化选择以及正交试验，确定最适宜SH7菌株生长的培养基配方及培养条件如下:0.9%牛肉膏+2%蛋白胨+2%葡萄糖+1.l%NaCl ;发酵起始pH值为8.2,300ml的三角瓶装瓶量为60ml、接种量为8%、温度为31°C、转速为150r/min，发酵时间为48h。
[0023]众所周知，烟草业在国民经济中的占有重要地位，目前青枯病的化学防治和生防都不甚理想，一定程度上制约了我国的烟草生产和出口。本发明发明人所筛选出的芽孢杆菌SH7对烟草青枯病菌表现出了良好的拮抗性，温室药效试验达到了较高的水平，前景广阔。本试验筛选出了适合该菌的发酵配方并优化了发酵条件，为该菌的生产应用打下了良好的基础。
[0024]菌种保藏信息:
[0025]菌种名称:芽孢杆菌属、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
[0026]保藏机构:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0027]保藏日期:2006年6月7日
[0028]保藏编号:CGMCC1732
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1为pH筛选结果；
[0030]图2为装瓶量筛选结果；
[0031]图3为接种量筛选结果；
[0032]图4为温度筛选结果；
[0033]图5为转速结果筛选；
[0034]图6为发酵时间筛选结果；
[0035]图7为5升发酵实验SH生长曲线图；
[0036]图8为50升发酵实验SH生长曲线图；
[0037]图9为发酵液抑制青枯菌的结果。
【具体实施方式】
[0038]提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
[0039]实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
[0040]本发明使用的枯草芽孢杆菌SH7菌株为由本室筛选并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的枯草芽孢杆菌SH7菌株，其保藏编号为=CGMCC 1732。
[0041]实施例1.生防菌株SH7的摇瓶发酵条件的筛选
[0042]I材料与方法
[0043]1.1供试菌株和培养基
[0044]保藏号为CGMCC1732的枯草芽孢杆菌SH7菌株由本室筛选、保存。
[0045]种子培养基:牛肉汁液体培养基(酵母粉0.5g、葡萄糖10g、蛋白胨5g、牛肉膏3g、ρΗ7.0，定容至 1L)。
[0046]待测培养基的配制:
[0047]①号培养基:淀粉0.15%、葡萄糖0.5%、尿素0.1%、磷酸氢二钾0.3%、磷酸二氢钾
0.15%、硫酸镁0.05%、酵母膏0.02%、氯化铁0.01%、碳酸钙0.01%、豆柏1% ；
[0048]②号培养基:淀粉0.15%、葡萄糖0.5%、尿素0.1%、磷酸氢二钾0.3%、磷酸二氢钾
0.15%、硫酸镁0.05%、酵母膏0.02%、氯化铁0.01%、碳酸钙0.01%、豆柏1%、30.8mg/L的硫酸锰溶液0.1% ；
[0049]③号培养基:牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、葡萄糖1%、氯化钠0.5% ；
[0050]④号培养基:牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、葡萄糖1%、氯化钠0.5%、淀粉0.3%,30.8mg/L的硫酸锰溶液0.1%。
[0051]将4种不同培养基pH值均调为7.2 — 7.3，装液量为60ml/300ml。121°C灭菌20min,备用。
[0052]1.2 方法
[0053]1.2.1种子准备牛肉汁液体培养基，pH为7.0，装瓶量为100ml/300ml三角瓶，1211:灭菌201^11。将牛肉汁液体培养基接菌后37°C过夜摇菌。
[0054]1.2.2培养基配方筛选上述4种培养基中接种种子菌液1.5ml，在31°C条件下，摇菌36h后取5ml发酵完毕的菌液，在12000r/min下离心5分钟，倒掉上清，冷冻干燥沉淀18h后,称重量。
[0055]1.2.3发酵培养条件优化每次只改变测定的一个发酵条件，其它方法同1.2.2。
[0056]2 结果
[0057]2.1培养基配方筛选结果
[0058]从表1可以看出，3次重复中5ml培养液中菌体干重的平均值大小依次为④号(0.0094g) >③号(0.0089g) >①号(0.0059g) >②号(0.0054g),因此④号培养基较适合该菌的发酵。
[0059]表1 :培养基配方筛选结果
[0060]
【权利要求】
1.生防枯草芽孢杆菌株SH7的发酵培养方法，其特征在于，按顺序包括如下步骤: (1)种子准备:将生防枯草芽孢杆菌SH7菌株接种于牛肉汁液体种子培养基中，灭菌，37°C过夜摇菌得种子菌液，所述牛肉汁液体种子培养基包含酵母粉、葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏； (2)发酵培养:于发酵培养基中接种步骤(1)的种子菌液,摇菌36h后取发酵完毕的菌液，离心5分钟,倒掉上清液,冷冻干燥后，称重。
2.根据权利要求1所述的发酵培养方法，其特征在于，所述发酵培养基包含牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、氯化钠、淀粉、30.8mg/L的硫酸猛溶液。
3.根据权利要求2所述的发酵培养方法，其特征在于，所述发酵培养基中含有牛肉膏0.3份、蛋白胨1份、葡萄糖1份、氯化钠0.5份。
4.根据权利要求3所述的发酵培养方法，其特征在于，所述发酵培养基各成分重量份配比为牛肉膏0.3份、蛋白胨1份、葡萄糖1份、氯化钠0.5份、淀粉0.3份、30.8mg/L的硫酸锰溶液0.1份。
5.根据权利要求1-4任一所述的发酵培养方法，其特征在于，步骤(2)中，发酵培养基的PH值为7.9-8.2 ；300ml的三角瓶的装瓶量为40_80ml ;接种量4%_8% ;培养温度为28-3TC ;培养转速为 150r/min-240r/min ;发酵时间为 24h_60h。
6.根据权利要求5所述的发酵培养方法,其特征在于，发酵培养基的pH值为8.2 ；300ml的三角瓶的装瓶量为60ml ;接种量8% ;培养温度为31 °C;培养转速为150r/min ;发酵时间为48h。
7.根据权利要求6所述的发酵培养方法，其特征在于，所述牛肉汁液体种子培养基按如下方法配制:将酵母粉0.5g、葡萄糖10g、蛋白胨5g、牛肉膏3g、加入容器定容至1L。
8.权利要求1-7任一所述的发酵培养方法在培养作物青枯病生防枯草芽孢杆菌株SH7中的应用。
9.由权利要求1-7任一所述的发酵培养方法直接培养的生防枯草芽孢杆菌SH7。
【文档编号】A01P1/00GK103642715SQ201310573461
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年11月13日 优先权日:2013年11月13日
【发明者】赵廷昌, 王静, 杨玉文, 王铁霖, 孔凡玉 申请人:中国农业科学院植物保护研究所