把大豆根瘤菌转移到玉米根系上的方法
【专利摘要】本发明涉及一种在农作物领域的培育技术，特别是利用超远缘复式育种技术把大豆的根瘤菌转移到玉米根系上的方法，本发明通过玉米与大豆的有性繁殖（杂交），把大豆的固氮酶转移到玉米上，使禾本科植物玉米的根系结瘤，但是超远缘关系的玉米和大豆是不能杂交授粉的，必须首先进行无性繁殖（嫁接），从而拉近彼此的亲缘关系，才能使有性繁殖成为可能，这种复式育种技术的关键在于必须首先保证玉米和大豆的嫁接成功，特别是要在其幼苗刚刚出土时进行嫁接，因为只有这时的幼苗才相互交流最活跃，变异的可能性也最大。但是，刚出土的幼苗极其脆弱，植株嫩小，嫁接难度是很高的，至今国外尚无成功的案例。
【专利说明】把大豆根瘤菌转移到玉米根系上的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种在农作物领域的培育技术，特别是利用超远缘复式育种技术把大豆的根瘤菌转移到玉米根系上进行生物固氮的新方法，即通过玉米与大豆的有性繁殖，把大豆的固氮酶转移到玉米上，从而使玉米根系上能够结瘤，但是超远缘关系的玉米和大豆是不能杂交授粉的，为了使玉米和大豆能够成功杂交，必须使玉米和大豆首先进行无性繁殖，因为无性繁殖可以提闻~者之间的未和力，这样在提闻二者未和力的基础上，才能使有性繁殖杂交成功，这种复式育种技术的关键在于必须首先保证玉米和大豆的嫁接成功。
[0002]
【背景技术】
[0003]生物科学技术是当前最活跃的高新科技之一，已广泛应用于农业领域，取得了巨大的经济效益，具有广阔的发展前景。而生物固氮工程则是生物科技的前沿领域，被列为国际农业组织的重点课题。
[0004]空气主要由氧气和氮气组成，氮气约占空气的80%。自然界中有一些生物能够直接吸收空气中的氮素作为养料，它们将分子态氮先还原成氨，再转化为氨基酸和蛋白质。这就是生物固氮。豆科植物的根部长有许多小球，它们是由根瘤菌共生形成的根瘤，就具有固氮作用，这些根瘤能直接吸收空气中的氮气，把它转化为氮肥，供植物吸收使用。但是世界上大部分土壤都缺乏氮素养分，为了使农作物高产，就需要施用大量氮肥。可是人工合成氮素肥料(化肥)要料耗费大量的能源，不仅成本高，而且污染水源和空气，破坏生态环境，危及人类健康，进口化肥也需要巨额资金，长期使用化肥还会破坏土地结构，使土壤板结。而生物固氮则能克服上述缺点，由前述可知，豆科植物的每一个根瘤都是一座小化肥厂，这些小化肥厂的原料来自空气，取之不尽，这种小化肥厂不需设备，也不污染环境，能源则是用之不竭的太阳能。如果能让其它非豆科作物特别是禾本科植物也具有固氮能力，不再施用化肥，用生物固氮取而代之，其意义是非常重大的。目前国内尚有一例“利用远缘嫁接进行根瘤菌转移的方法”申请号为201010046310.9的专利技术，该技术利用嫁接进行根瘤菌转移的思路是正确的，但有两点不足:一，砧木玉米如果长到6片叶子，过了苗期，已经完全不能嫁接了，事实上超过3片叶子就基本上不能嫁接了。二，该技术只有嫁接，没有杂交，本来嫁接的目的是为杂交创造条件的，因为只有杂交才能培育出新品种，嫁接是培育不出新品种的，嫁接只是手段而不是目的。
[0005]本发明则是克服了以上不足，经过多年试验，完成了利用超远缘复式育种技术把大豆的根瘤菌转移到玉米根系上进行生物固氮的新方法。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种操作简单，成本低廉的超远缘复式育种技术从而把大豆的根瘤菌转移到玉米根系上进行生物固氮的新方法。所谓超远缘是指玉米和大豆是两种没有任何亲缘关系，其属性是相差很远的两种植物，玉米是禾本科属于单子叶植物纲，而大豆是豆科属于双子叶植物纲，因属性相差太远，属于纲间嫁接，学术界视为嫁接禁区，国外至今尚无嫁接成活的先例。
[0007]本发明的第一步是无性繁殖(嫁接):首先保证玉米和大豆的嫁接成活，嫁接时机必须是在砧木玉米和接穗大豆都是幼苗刚刚出土，其中砧木玉米只长出一片叶子，而接穗大豆只长出子叶尚未长出真叶时，就要立即进行嫁接，因为这时幼苗的可塑性最强，其相互之间的交流最活跃，变异的可能性也最大。但是，由于刚出土的幼苗极其脆弱，植株嫩小，嫁接是非常困难的，本发明就是连续反复试验多年，最终掌握了技术秘诀，才取得了嫁接的成功。第二步是有性繁殖(杂交):在玉米和大豆嫁接成活后，其植株逐渐长大，直到砧木玉米的花穗开花，则及时收集大豆的花粉，将其撒到玉米的花穗上，进行杂交授粉。一般在接穗大豆进入结荚到鼓粒期，玉米有了花穗授粉后，其根系上开始生长根瘤，并逐渐长大。
[0008]本发明的机理是通过玉米与大豆的有性繁殖(杂交)，把大豆的固氮酶转移到玉米上，从而使玉米的根系上能够结瘤，但是超远缘关系的玉米和大豆是不能杂交受粉的，为了使玉米和大豆能够成功杂交，必须使玉米和大豆首先进行嫁接，即无性繁殖，因为无性繁殖可以提闻二者之间的未和力，拉近彼此的未缘关系，这样，两者从没有关系到建立起未缘关系的基础上，才能使有性繁殖成为可能，这种复式育种技术的关键在于必须首先保证玉米和大豆的嫁接成功，也就是首先完成玉米和大豆的无性繁殖，在此基础上才能进行玉米和大豆的有性繁殖。
[0009]本发明的技术方案是:
把纯种大豆的种子和纯种玉米的种子播种到试验田里，待玉米和大豆幼苗刚刚出土，则以玉米为砧木，大豆为接穗进行嫁接，嫁接成功后，等到砧木玉米长出花穗时，则收集大豆的花粉，将其撒到玉米的花穗上，进行杂交授粉。这种通过首先无性繁殖然后再有性繁殖的复合培育技术即可选育出优良的H)代杂种，在H)代玉米的根系上就会长出根瘤。
[0010]本发明具有如下特点:
1，该超远缘复式育种技术操作简单，成本低廉，当年即可在玉米的根系上长出根瘤。
[0011]2，该超远缘复式育种技术属于常规育种范畴的超远缘嫁接和杂交技术，不存在转基因育种在国际上发生的关于食品安全的争议。
[0012]
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为已经嫁接成活的幼苗植株，大豆接穗已长出第一对真叶。
[0014]图2为已经长大的嫁接植株。
[0015]图3为玉米和大豆嫁接的结合部特写。
[0016]图4为大豆已经结荚，玉米还未长出花穗的植株。
【具体实施方式】
[0017]下面对本发明做进一步的说明，其【具体实施方式】如下:
1，播种:
选用外形饱满，无瑕疵的纯种大豆的种子和纯种玉米的种子(不可使用转基因大豆和玉米)，点播在试验田里，试验田以沙壤为宜，湿度50%-60%，播深2-3厘米，虚土覆盖。[0018]2，嫁接:
①嫁接前的准备:单面刀片、医用酒精(75%)、无静电塑料条(I厘米宽)、不锈钢镊子、竹针(粗细如缝衣针，长度I厘米)、无菌手套。嫁接时必须佩戴无菌手套，所有工具均要酒精消毒，尤其是竹针要提前消毒干燥后放入无菌袋中备用。
[0019]②嫁接的时机:玉米和大豆的幼苗刚出土 2-3天，玉米要只长出一片叶子，不得长出第二片叶子，而大豆要只长出子叶尚未长出真叶时，子叶也必须是尚未展开时(形同黄豆芽)，则以玉米为砧木，大豆为接穗进行嫁接。
[0020]③嫁接的要领:在玉米出土的幼苗距离根部15-20毫米的部位用刀片横向切断，即切去叶子，只留幼苗的下部，然后从玉米幼苗的中间垂直向下切开，切深12±1毫米，接穗大豆则把下部切成楔形长11±1毫米，幼苗切口部位必须预先用消毒酒精擦拭，两者迅速插接在一起，再用竹针横穿结合部固定，然后用塑料条包扎结合部防止水分蒸发。嫁接过程越快越好，整个过程不宜超过20秒钟，以防氧化失败。砧木和接穗要粗细一致，嫁接不得错位，砧木和接穗的表皮必须对齐，至少要有一边对齐，否则会造成营养不能交流而失败。横穿竹针的工序必不可少，其作用有二，一是防止嫁接后的排异现象使接穗从接口中被推出而脱落，二是促进生成愈伤组织，提高嫁接结合部的愈合能力，嫁接成活的幼苗见图1，图1是已经嫁接成活的幼苗植株，大豆接穗已长出第一对真叶。[0021]④成活后的管理:嫁接成活后，必须抑制砧木玉米的长势，促进接穗大豆的长势，必须保证在大豆进入结荚期以后，玉米才开始生长花穗，如果玉米先生长花穗，然后大豆才开花结荚，则会造成根瘤转移的失败，必须是大豆开花结荚在先，玉米生长花穗在后，图4就是大豆已经结荚，玉米还未长出花穗的植株。
[0022]⑤杂交的操作:嫁接成功的植株开始逐渐长大，长大的嫁接植株见图2,玉米和大豆嫁接的结合部特写见图3，在植株生长到砧木玉米有了花穗时，此时要及时收集大豆的花粉，将其撒到玉米的花穗上，进行杂交授粉，待其成熟后，其果实就是H)代杂种，然后从中选出优良杂种供Fl代继续培育使用。
⑥根瘤的形成:在玉米花穗授粉之后，其根系上就开始结瘤，随着玉米的生长其根系上的根瘤开始逐渐长大直到成熟，颜色也逐渐变深而成褐色，当玉米完全成熟后，其根瘤则自行破裂脱落，增加了土壤中的氮素。
【权利要求】
1.一种把大豆的根瘤菌转移到玉米根系上的方法，其特征在于首先使玉米和大豆进行无性繁殖，要求嫁接的时机是必须在玉米和大豆的幼苗刚出土 2-3天，玉米要只长出一片叶子，不得长出第二片叶子，而大豆要只长出子叶尚未长出真叶，并且子叶也必须是尚未展开时(形同黄豆芽)，则以玉米为砧木，大豆为接穗进行嫁接。
2.根据权利要求1所述的把大豆的根瘤菌转移到玉米根系上的方法，其特征在于嫁接时在玉米出土的幼苗距离根部15-20毫米的部位用刀片横向切断，即切去叶子，只留幼苗的下部，然后用刀片从玉米幼苗的中间垂直向下切开，切深12±1毫米，接穗大豆则把下部切成楔形长11 ± I毫米，幼苗切口部位必须预先用消毒酒精擦拭，两者迅速插接在一起，再用竹针横穿结合部固定，然后用塑料条包扎结合部防止水分蒸发。
3.根据权利要求1或2所述的把大豆的根瘤菌转移到玉米根系上的方法，其特征在于砧木和接穗要粗细 一致，嫁接不得错位，砧木和接穗的表皮必须对齐，至少要有一边对齐，否则会造成营养不能交流而失败，嫁接过程越快越好，整个过程不得超过20秒钟，以防氧化失败。
4.根据权利要求1、2或3所述的把大豆的根瘤菌转移到玉米根系上的方法，其特征在于嫁接成活的植株必须严格控制砧木和接穗的长势进度，具体的要求是其生长进度必须做到接穗大豆开花结荚在先，砧木玉米生长花穗在后。
5.根据权利要求1、2、3或4所述的把大豆的根瘤菌转移到玉米根系上的方法，其特征在于嫁接成活的砧木玉米植株生长到有了花穗时，要及时收集大豆的花粉，进行杂交授粉，杂交授粉成功到玉米完全成熟后，则为H)代果实，从中选出优良杂种，以便供Fl代继续培育使用。
【文档编号】A01H1/02GK103947443SQ201410203629
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年5月15日 优先权日:2014年5月15日
【发明者】王孚望 申请人:王孚望