本发明属于2型糖尿病领域，特别涉及一种用于mTORC1通路的小鼠模型及其建立方法。
背景技术：
伴随着经济发展及生活方式的改变，在全球范围内2型糖尿病的发病率处于明显上升趋势。据估计，在2010年由糖尿病直接引起，或由大血管并发症造成的死亡人数可达1300万人以上。而同期中国的糖尿病患病率高达11.6％，其中仅有10％的患者通过治疗得到较好的血糖控制，可见加强对2型糖尿病的研究是十分必要和迫切的。一般认为，外周组织胰岛素抵抗及胰岛β细胞功能异常是2型糖尿病发病机制中的两个中心环节，而后者对于全身糖代谢稳态的维持尤为关键，β细胞功能和质量的机制研究是糖尿病基础研究领域的热点。
雷帕霉素理论性靶点蛋白(mechanistic Target of Rapamycin，mTOR)是一个高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，它可整合来自上游不同营养物质、激素、生长因子等信号，对细胞的生长、增殖、活力及功能等方面有着重要的调控作用。mTOR信号通路依赖于它的两个复合体mTORC1和mTORC2而起作用，两者对于雷帕霉素的敏感性及上下游调控方式均有着明显的差异。mTORC1对于雷帕霉素的抑制作用比较敏感。两个mTOR复合体均由多个蛋白组成，除两者共同含有的mTOR，mLST8，DEPTOR之外，mTORC1特异性含有Raptor及PRAS40，而Rictor和mSin1是mTORC2的特异组成部分。
在大鼠，小鼠，人胰岛β细胞的多项体外实验研究发现，雷帕霉素通过抑制mTORC1活性来调节β细胞的功能和凋亡，雷帕霉素可以降低胰岛β细胞的活力，加速其凋亡，并且能够负性调控糖刺激的胰岛素分泌。另外“活体胰岛代偿模型”(孕鼠模型、糖尿病Psammomys Obesus模型和60％胰腺切除小鼠模型)共同证实了mTORC1信号通路在胰岛β细胞功能代偿中的重要作用。其中，雷帕霉素通过抑制胰岛β细胞的代偿性增殖参与维持早期功能性β细胞质量的代偿。考虑到雷帕霉素除了影响β细胞功能，还能导致外周胰岛素敏感性改变，并且也只能抑制一部分mTORC1的活性，所以转基因小鼠模型对于研究mTORC1对于β细胞功能的作用更有价值。全身敲除mTORC1可导致致死型胚胎畸形，提示此通路在组织发育中的重要作用。通过β细胞特异性过表达Rheb或者敲除TSC1/2从而使mTORC1活性增强可以增加β细胞质量并且改善糖耐量。与之相反，在全身敲除S6K1和rpS6小鼠模型中，敲除小鼠表现为低胰岛素血症，糖耐量异常和β细胞大小减小等表型。以上研究都共同证明mTORC1在促进β细胞生长，胰岛素合成以及胰岛β细胞质量中的重要作用。然而在这些转基因小鼠模型在胰岛β细胞增殖和凋亡结果中存在不一致性。
最近，通过对不同组织(脂肪，肌肉，肝脏)特异性敲除mTORC1伴随蛋白Raptor的转基因小鼠研究，揭示了mTORC1通路在不同组织，对维持全身代谢稳态具有相对特异的功能。目前尚缺乏β细胞特异性mTORC1敲除小鼠。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种用于mTORC1通路的小鼠模型及其建立方法，该小鼠模型建立方法简单，经比较发现被β细胞特异性敲除Raptor的小鼠TORC1信号通路在胰岛中被特异性地抑制，为后续研究奠定了基础，具有良好的应用前景。
本发明的一种用于mTORC1通路的小鼠模型，所述小鼠模型为β细胞中特异性敲除Raptor小鼠。
所述小鼠模型通过PCR基因分型验证。
所述PCR所用引物为
Raptor：F：CTCAGTAGTGGTATGTGCTCAG；R：GGGTACAGTATGTCAGCACAG；
RIP-Cre：F：CGATGCAACGAGGATGAGG；R：GCATTGCTGTCACTTGGTCGT；
CD8：F：GGTGCATTCTCACTCTGAGTTCC；R：GCAGACAGAGCTGATTTCCTATGTG。
所述PCR反应体系为：组织提取液1μl，PCR缓冲液5μl，上下游引物各0.1μl，ddH2O 3.8μl。
所述PCR反应条件为：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，32个循环；72℃10min。
本发明的一种用于mTORC1通路的小鼠模型的建立方法，包括：
在C57品系的Raptor lox/lox小鼠上，与RIP-Cre小鼠交配，获得Raptor杂合型小鼠，即RIP-Cre Raptor lox/w小鼠；再通过Raptor杂合型小鼠的自身交配，获得带有RIP-Cre的Raptor lox/lox小鼠，即得β细胞中特异性敲除Raptor小鼠。
有益效果
本发明建立方法简单，经比较发现被β细胞特异性敲除Raptor的小鼠TORC1信号通路在胰岛中被特异性地抑制，为后续研究奠定了基础，具有良好的应用前景。
附图说明
图1A为βRapKO小鼠不同组织中的Raptor蛋白水平；图1B为WT和βRapKO小鼠胰岛中mTORC1信号通路的活性。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1、小鼠繁殖及交配方案
8周龄性成熟雄性小鼠与雌性小鼠合笼，所生小鼠满3周龄时进行编号分笼，同时剪取少量鼠尾组织以便后续基因分型。在C57品系的Raptor lox/lox小鼠上，与RIP-Cre小鼠交配，获得Raptor杂合型小鼠，即RIP-Cre Raptor lox/w小鼠，并通过Raptor杂合型小鼠的自身交配，获得带有或不带有RIP-Cre的Raptor lox/lox小鼠。前者即为在β细胞中特异性敲除Raptor小鼠(βRapKO小鼠)，而不带有RIP-Cre则作为对照组小鼠。
2、基因分型
1)DNA抽提
a)用干净无菌的剪刀将组织剪碎后加入100ul AD1缓冲液和25ul的AD2缓冲液；
b)室温孵育10分钟后，95℃金属浴3分钟；
c)加入100ul AD3缓冲液，混匀后冻存在-20℃冰箱或者直接用作模板进行PCR。
2)PCR引物
Raptor：
Forward：CTCAGTAGTGGTATGTGCTCAG
Reverse：GGGTACAGTATG TCA GCACAG
RIP-Cre：
Forward：CGATGCAAC GAG TGA TGA GG
Reverse：GCATTGCTG TCA CTT GGTCGT
CD8：(作为所加DNA样本的质控)
Forward：GGT GCA TTC TCA CTC TGA GTT CC
Reverse：GCA GAC AGA GCT GAT TTC CTA TGT G
3)PCR检测
a)反应体系：组织提取液1μl，PCR缓冲液5μl，上下游引物各0.1μl，ddH2O 3.8μl。
b)反应程序：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，32个循环；72℃10min。
4)琼脂糖凝胶电泳
a)称取DNA电泳用琼脂糖2g放入250ml的烧瓶中加入混有Gel-Red的100ml 1×TAE缓冲液，配置成浓度为2％，混匀后，将烧瓶置于微波炉加热煮沸，直至琼脂糖完全溶解。
b)取出烧瓶将其置室温下冷却至70℃左右(手握烧瓶可以耐受)，将凝胶溶液倒入胶板铺板。
c)半小时左右待琼脂糖凝固后拔出梳齿取出凝胶置入已加入1×TAE缓冲液的电泳槽中；
d)依次加样及DNA marker，注意加样器吸头应恰好置于凝胶点样孔中，不可刺穿凝胶，也要防止将样品溢出孔外。
e)接通电源，调节电压至130伏，电泳40分钟后，将凝胶板取出，在紫外灯下观察结果。
4、总蛋白的抽提
1)细胞蛋白抽提
a)用预冷PBS洗涤细胞2次后吸净残余液体；
b)6孔板每孔加200ul细胞裂解液，置于冰上5min；
c)用1ml枪头刮下细胞，移入离心管，冰上静置20min；
d)4℃13000g离心30min，取上清分装后－80℃保存备用。
2)胰岛蛋白抽提
a)取出-80℃保存的胰岛，加入适量蛋白裂解液，裂解液为RIPA与PMSF按照100:1的比例配比(如需检测磷酸化蛋白需加入磷酸酶抑制剂)；
b)冰上静置20min，
c)细胞超声仪(BioruptorTM UCD-200)H档超声10秒裂解胰岛；
d)取出标本，重新加入碎冰；
e)再放入标本，超声H档再超声10秒裂解胰岛；
f)将样本于4℃下，以13000g离心30min，取上清，分装至0.6ml离心管，-80℃保存。
3)蛋白定量(BCA法)
a)2mg/ml BSA标准品按梯度稀释；
b)从-80℃取出待测浓度的胰岛蛋白样本，冰上慢慢融化，用三蒸水10倍稀释；按说明书配好标准品：
c)在96孔酶标版中依次加入梯度稀释好的蛋白标准品以及稀释后的待测样本，25μl/孔，每个样品做副孔；
d)每孔加入200μl的BCA工作液，轻微振荡30s；
e)37℃孵育30min，570nm测定吸光度，根据标准曲线即可得到样本浓度。
5.结果
测定βRapKO小鼠不同组织中的Raptor蛋白水平(图1A)(其中，RAPTOR：雷帕霉素理论性靶点调控相关蛋白；ACTIN：肌动蛋白；PS6(240/244)：磷酸化核糖体蛋白S6(丝氨酸240/244位点)；4E-BP1：真核翻译起始因子4E结合蛋白1；TUBULIN：微管蛋白)，发现除了胰岛中Raptor蛋白表达有显著下降以外，在心脏、肝脏、肌肉、肾脏、脂肪以及下丘脑组织中表达都未受明显影响。然后，比较了WT和βRapKO小鼠胰岛中mTORC1信号通路的活性(图1B)。结果显示β细胞内Raptor的表达显著下降，mTORC1下游两个靶分子p-S6和4E-BP1(由高磷酸化β，γ状态向低磷酸化α状态转变)的磷酸化水平都降低。以上结果提示，mTORC1信号通路在胰岛中被特异性地抑制，证明已经成功建立了β细胞特异性敲除Raptor的小鼠模型。