本发明属于农作物遗传育种学领域，具体涉及利用长雄野生稻(Oryza longistaminata)无性繁殖特性培育多年生稻的方法。
背景技术：
针对人为长期过度耕作带来的水土流失、土壤肥力下降等问题，1989年国际稻作所(International Rice Research Institute，IRRI)提出发展多年生陆稻，在旱地上种植多年生陆稻获得粮食收入的同时达到防止水土流失、保护生态环境的双重目的。从那以后，国内外一些研究机构开始了多年生稻遗传改良的探索。多年生稻(Perennial Rice,PR)，顾名思义，就是种植一次可以连续收获多年的稻作品种及其生产技术。栽培稻，即通常说的现代改良稻作品种，无论是亚洲栽培稻(O.sativa)还是非洲栽培稻(O.glaberrima)，其野生种都具有多年生的特性。一般来说，多年生稻主要是利用栽培稻自身稻桩上的腋芽、普通野生稻(O.rufipogon)的匍匐茎、长雄野生稻(O.longistaminata)的地下茎等三种方式实现稻作的多年生性，然而腋芽和匍匐茎由于不能忍受冬季的低温和干旱等环境因素没有获得更多的进展，而利用长雄野生稻地下茎特性发展多年生稻，不论理论还是实践方面逐渐有了新的突破。
1991年，法国学者Ghesquiere研究认为长雄野生稻地下茎的表达和胚败育基因(D1)连锁在一起位于水稻第2号染色体；1998年，日本学者Maekawa研究认为长雄野生稻的地下茎(Rhizome,Rhz)同位于第4染色体上和无叶舌基因(lg,liguleless)连锁；2003年，国际稻作所的Erik.J.Sacks研究认为地下茎的表达受到隐性或部分隐性基因控制。然而该系 列研究只停留在理论层面，未取得实质性进展，没有真正用于生产。
技术实现要素：
本发明提供了利用长雄野生稻无性繁殖特性培育具有多年生性的多年生稻的方法，实现了多年生稻种植一次能够连续生长2年及2年以上，还可以利用不同多年生性遗传位点的组合，培育出适应不同生态类型的多年生稻，提高了稻作生产效益。
本发明通过以下技术方案予以实现：
利用长雄野生稻无性繁殖特性培育多年生稻的方法，包括如下步骤：
(1)以长雄野生稻为父本，以第一栽培稻为母本进行杂交获得第一F1代；
(2)将所述第一F1代自交，得到第一F2代；
(3)筛选出携带多年生性遗传位点的第一F2代，其中所述多年生性遗传位点包括主效位点和微效位点；
(4)携带多年生性遗传位点的第一F2代连续自交得到后代材料，从中选育出多年生稻品系，所述多年生稻品系携带多年生性遗传位点，即具有多年生性状。
在本发明的一个方面，所述方法还包括以下步骤：
(5)利用步骤(4)选育出的具有多年生性状的多年生稻品系做供体，以第二栽培稻做母本，通过杂交将多年生性遗传位点导入至栽培稻中，获得第二F1代；
(6)所述第二F1代与第二栽培稻为父本进行回交，再自交，筛选出携带多年生性遗传位点的多年生稻。
在本发明的再一个方面，所述第一栽培稻是RD23。
在本发明的再一个方面，所述第二栽培稻为楚粳28。
在本发明的再一个方面，所述主效位点包括Rhz2和Rhz3，所述微效位点包括QRl1、QRbd2、QRn2、QRn3、QRn5、QRn6、QRl6、QRn7、QRl7和QRl10。
在本发明的再一个方面，所述具有多年生性状的多年生稻品系携带选自Rhz2、Rhz3、QRl1、QRbd2、QRn2、QRn3、QRn5、QRn6、QRl6、QRn7、QRl7和QRl10的一个或多个多年生性遗传位点。
在本发明的再一个方面，所述第一F2代连续自交得到的后代材料包括F3代、F4代、F5代、F6代、F7代、F8代、F9代、F10代、F11代和/或F12代中的一种或多种。
在本发明的再一个方面，所述第二F1代与第二栽培稻父本进行回交4次，然后连续自交4代。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的多年生稻的培育方法，以栽培稻/长雄野生稻杂交获得后代分离群体，可准确检测到12个控制多年生性(地下茎表达及其丰度)的遗传位点；通过携带不同多年生性遗传位点的材料为供体，采用分子标记辅助选择技术(MAS)培育出了种植一次，可以连续收获多年(多次)的多年生稻品种(系)；且本发明通过不同多年生性遗传位点的组合，可以培育出适应不同生态类型的多年生水/陆稻，如具有长地下茎的多年生稻适于旱地种植(如PR12-1375)；而具有短地下茎的多年生稻品种(如PR24)适合普通水田种植。
根据本发明提供的方法培育的多年生稻与再生稻相比，其再生机制有本质区别。本发明提供的多年生稻是利用长雄野生稻多年生性遗传位点控制的地下茎的腋芽重新生长，稻作生产能力恢复正常，具有种植一次收获多年(多季)的生产优势；本发明提供的多年生稻与现有再生稻技术相比，多年生稻实践意义更高。
利用本发明提供的方法培育的多年生稻连续多年产量高，经济效益好，极具推广价值：多年生稻生产技术展现出了一种新型、高效、环境友好、绿色农业、轻简化的稻作生产经营方式，不需要重复购买种子，育秧、移栽以及犁田耙田等田间栽培过程，大幅度降低劳动力和资金的投入，据统计，种植该多年生稻的生产成本可降低45％，每亩减少大约600元的生 产成本，且产量高，收益好，极具推广价值。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。
在本发明中，用作父本的是长雄野生稻(Oryza longisatminata)，其为广泛生长在热带非洲的一个野生种，具有长柱头和花药(Oka，1967)、自交不亲和(Nayar，1968；Chu，1969)、异花授粉(Causse，1991)和地下茎(Porteres，1949；Bezancon，1977；Ghesquiere，1985)特性。在长雄野生稻中，由于地下茎特有的无性繁殖作用，是发展多年生稻的理想性状，本发明正是基于长雄野生稻的该特性成功培育成多年生稻。
在本发明中用作母本的栽培稻可以是本领域技术人员熟知的包括籼稻和粳稻在内的多数水稻品种。在本发明中，所述第一栽培稻和第二栽培稻可以相同，也可以不同。在优选的实施方式中，所述第一栽培稻是RD23，其为来自泰国的广泛种植的籼稻品种；所述第二栽培稻是楚粳28,其是来自云南省楚雄农科所培育并广泛种植的粳稻品种。
在本文中，术语“多年生”，“多年生性”或相似术语是指通过长雄野生稻与栽培稻杂交后代选育的具有种植一次通过无性繁殖可以生长并收获多年(2年及以上)的品系特性，从而具有良好的多年生能力。
采用本领域技术人员所熟知的技术，例如但不限于杂交，回交和分子标记辅助选择技术(MAS)，以长雄野生稻为父本，栽培稻为母本获得第一F1代，在优选的实施方式中，所述第一F1代是F1(RD23/O.longistaminata)。
在本文中，术语“自交”是指来自同一个体的雌雄配子的结合或具有相同基因型个体间的交配或来自同一无性繁殖系的个体间的交配。
在本文中，术语“回交”指子一代与两个亲本中的任意一亲本进行杂交，这种方法叫做回交。在育种工作中，常利用回交的方法来加强杂种个体中某一亲本的性状表现。用回交方法所产生的后代称为回交杂种。被用来回交的亲本称为轮回亲本，未被用来回交的亲本称为非轮回亲本。
在本发明中，通过对第一F1代进行自交，得到第一F2代。在本发明中，还可以包括通过对第一F1代进行回交，得到BC1(轮回亲本为母本，在优选的实施方式中优选为母本RD23)分离群体。
对第一F2代和/或BC1分离群体进行遗传分析，筛选出多年生性遗传位点，对长雄野生稻的多年生性遗传位点的鉴定和分析可以参见胡凤益所著“长雄野生稻地下茎分子定位和遗传研究”，西南农业大学2002届硕士论文。在本发明中全文引入该论文作为参考文献。其中所述多年生性遗传位点包括主效位点和微效位点，具体而言：
在本发明中，所述主效位点包括Rhz2和Rhz3，所述Rhz2和Rhz3分别定位在第3染色体上的SSR分子标记OSR16和OSR13之间，其距离分别是1.3cM和8.1cM，和第4染色体上的SSR分子标记RM119和RM237之间，其距离分别是2.2cM和7.4cM，须说明的是，OSR16等标记名称是本领域技术人员应该都知晓的，属于基于水稻基因组序列开发公开发布的水稻SSR分子标记术语。
如表1所示，在本发明中，所述微效位点包括QRl1、QRbd2、QRn2、QRn3、QRn5、QRn6、QRl6、QRn7、QRl7和QRl10。
在本发明中所使用的，Rhz代表地下茎表达主效位点；Q代表微效位点(QTL)；RN:单株地下茎多少；RBD：地下茎分枝程度；RBN：二次分枝程度；RL:地下茎平均长度；RIL:地下茎节间的平均长度；RIN：地下茎节间数；RDW：单株地下茎干重；TN：单株分蘖数；数字代表该位点位于第几号染色体。
表1地下茎相关基因/QTLs及性状
在本发明中，将携带多年生性遗传位点的第一F2代自交获得包括F3代、F4代、F5代、F6代、F7代、F8代、F9代、F10代、F11代和/或F12代中的一种或多种后代材料，基因组基本稳定纯合形成株系，从而可以用作携带 多年生性遗传位点的第一多年生稻品系，其中所述第一多年生稻品系根据品系基因型(携带不同多年生遗传位点)和表现型的不同可以包括一种或多种稻品系，可以根据需要选择任一种多年生稻品系进行育种。在本发明中优选使用的第一多年生稻品系是采用分子标记辅助选择培育的具有多年生性状的稻作品系，如本发明中的PR12-1375、PR23、PR24等稻作品系，即多年生稻12-1375、多年生稻23，多年生稻24，根据英文Perennial Rice 12-1375、Perennial Rice 23，Perennial Rice 24命名，在优选的实施方式中，不同品系携带不同多年生性遗传位点，获得不同类型的多年生稻，如带有较长地下茎的多年生稻，如PR12-1375，携带了多年生性位点Rhz2(Chr3)、Rhz3(Chr4)、QRn3(Chr3)、QRbd2(Chr2)、QRl7(Chr7)、QRn10(Chr10)，种植在山地上，可以防止水土流失、保护生态，同时可以获得一定的产量；而带有短地下茎品系，例如PR24携带了多年生性遗传位点Rhz2(Chr3)、Rhz3(Chr4)、QRn2(Chr2)、QRbd2(Chr2)、QRn7(Chr7)、QRn10(Chr10)，具有很短的地下茎，可以实现多年生性，并具有较高的产量。
在本发明中，将上述具有不同多年生性遗传位点的第一多年生稻品系为供体，在优选实施方式中以所述PR23和/或PR24多年生稻品系作为供体，以栽培稻做母本，通过杂交方法将多年生性遗传位点导入至其它栽培稻中，进行多年生性遗传改良，进而获得性状更优良的多年生稻。
在本发明中采用MAS技术，所述MAS技术即分子标记辅助选择(Molecular Marker-Assisted Selection MAS)是利用与目标性状基因紧密连锁的分子标记进行间接选择，是对目标性状在DNA水平的选择，不受环境影响，不受等位基因显隐性关系干扰，选择结果可靠，同时又可避免等位基因间显隐性关系的干扰，从而达到作物产量、品质和抗性等综合性状的高效改良；分子标记辅助选择育种具有标记基因型鉴定可以在低世代和植株生长的任何阶段进行、共显性的分子标记允许在杂合体阶段进行鉴定隐性基因、对目的基因的选择不受基因表达和环境条件的影响等优点。 分子标记辅助选择育种是将分子标记应用于作物改良的一种手段，其基本原理是利用与目标基因紧密连锁或表现共分离的分子标记对选择个体进行目标以及全基因组筛选，从而减少连锁累赘，获得期望的个体，达到提高育种效率的目的。
MAS根据分子标记的不同，如常用的有SSR标记、SNP标记、CAPS标记等，但原理和步骤基本相同，虽然操作方式会有差异，在本领域中有大量的相关文章和书籍，在育种领域已经成为很常用的技术，为本领域技术人员所熟知。基本步骤包括DNA提取、PCR标记的扩增、凝胶电泳、和/或结果(带型)分析。
本发明参考Temnykh等(2000年)的DNA提取方法，对各株系的代表单株分别提取基因组DNA。
对多年生性遗传位点紧密连锁多态的SSR标记进行各单株基因组DNA为模板的聚合酶链式反应(PCR)。
PCR反应的产物通过8％的非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳进行分离，银染后，参考双亲的扩增条带，对带型进行判别记录，筛选目的基因型单株。
在本发明中，用多年生稻品系做供体，在优选实施方式中以所述PR23和/或PR24和多年生稻品系作为供体，第二栽培稻做受体获得的第二F1代，在优选实施方式中，所述第二F1代是F1(楚粳28/PR24)。所述第二F1代与所述第二栽培稻母本进行回交和/或自交，每代都通过相应遗传位点紧密连锁分子标记(SSR标记，表1)进行遗传位点的追踪与鉴定，筛选获得携带长雄野生稻多年生性遗传位点的多年生稻。此处，回交目的是遗传背景的清除，利用MAS留下需要的性状，其它则和轮回亲本一致。因此，在本发明中所述第二F1代与所述第二栽培稻进行回交和/或自交的先后顺序以及重复次数没有特别限制，只要最终能筛选出获得携带长雄野生稻多年生性遗传位点的多年生稻即可。其中，在优选的实施方式中，进行回交1次，或者连续回交2次、3次、4次或更多次；在优选的实施方式中，进行自交1次，或者连续自交2次、3次、4次或更多次。在优选的实施方式中，单次或连续的回交和单次或连续的自交可以交替进行。
在本发明中，所述遗传位点的追踪与鉴定是MAS过程，从而获得带有长雄野生稻多年生性(无性繁殖特性)遗传位点的单株。
本发明通过在本领域的一年生栽培稻中引入长雄野生稻中控制无性繁殖特性(多年生性)的遗传位点，培育并获得所期望的多年生稻，实现了多年生稻种植一次能够连续生长2年及以上，还可以利用不同多年生性遗传位点的组合，培育出适应不同生态类型的多年生稻，从第二季开始省去了重新播种、育秧、插秧等环节，降低了稻作生产成本，提高了稻作生产效益。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
实验材料与方法
实验材料包括以下：
长雄野生稻：从尼日尔收集，由日本物理与化学研究所的Hiroshi Hyakutake博士友好提供；
栽培稻RD23：来自泰国的籼稻品种；
栽培稻楚粳28：云南楚雄农科所培育，云南省主栽品种。
杂交方法在本领域中广泛已知，完全在本领域技术人员的能力范围之内，具体可以参考作物育种学-中国农业大学出版社。
MAS及多年生性遗传位点的分子标记检测参考Temnykh等(2000年)的DNA提取方法，对各株系的代表单株分别提取基因组DNA。对多年生性遗传位点紧密连锁多态的SSR标记进行各单株基因组DNA为模板的聚合酶链式反应(PCR)。PCR反应的产物通过8％的非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳进行 分离，银染后，参考双亲的扩增条带，对带型进行判别记录，筛选目的基因型单株。
本案例所涉及材料与方法，如无特殊说明，均为常规材料与方法。
实施例1 F1(RD23/O.longistaminata)代的培育
以RD23为母本去雄后，长雄野生稻为父本直接授粉后通过幼胚挽救得到F1(RD23/O.longistaminata)植株，其开花时期表现出花药不开裂，具有约30％左右的花粉育性、地下茎表现介于父本和母本之间。
实施例2多年生稻品系PR24、PR12-1375的培育
种植实施例1中所获得的F1(RD23/O.longistaminata)代，通过对F1植株进行强制自交授粉获得了F2种子,这些种子用1/4MS培养基(3％蔗糖+0.7％琼脂，pH值5.8)进行胚培养获得株苗，通过练苗后移栽种植，最终获得分离的F2单株进行筛选。
利用选自Rhz2和Rhz3中的一个或多个主效位点，选自QRl1、QRbd2、QRn2、QRn3、QRn5、QRn6、QRl6、QRn7、QRl7和QRl10中的一个或多个微效位点对分离的F2单株进行筛选，选育出具有短地下茎的多年生稻品系PR24(Perennial Rice 24,PR24)，经分子检测，该品系携带了来自长雄野生稻多年生性遗传位点Rhz2(Chr3)、Rhz3(Chr4)、QRn2(Chr2)、QRbd2(Chr2)、QRn7(Chr7)、QRn10(Chr10)(表2),经过水稻生产实践证实，其产量表现稳定，农艺性状优良，具有很好的多年生性；选育具有较长地下茎的多年生稻品系PR12-1375，经分子检测，该品系携带了来自长雄野生稻多年生性遗传位点Rhz2(Chr3)、Rhz3(Chr4)、QRn3(Chr3)、QRbd2(Chr2)、QRl7(Chr7)、QRn10(Chr10)(表2)获得一定产量的同时具有较强的环境适应能力，适应旱地种植，同时由于地下茎能增加土壤覆盖度，减少了水土流失，保护了生态环境。
表2列出了在实施例中所使用的品系的基因型。
表2所用品系基因型列表
注：A为母本带型，B为父本带型，H为杂合带型,Rhz代表地下茎表达主效位点；Q代表微效位点(QTL)；Rn代表单株地下茎个数多少；Rbd：地下茎分枝程度；Rl:地下茎平均长度；数字代表该位点位于第几号染色体。
实施例3多年生稻遗传改良
以第二栽培稻楚粳28为母本进行人工去雄，以多年生稻PR24为父本进行杂交获得F1(楚粳28/PR24)代。
用F1(楚粳28/PR24)代和楚粳28进行回交4次，然后连续自交4次。在回交和自交过程中利用基于SSR的分子标记辅助选择(Molecular Marker-Assisted Selection,MAS)育种技术，对多年生性位点Rhz2(Chr3)、Rhz3(Chr4)、QRn2(Chr2)、QRbd2(Chr2)、QRn7(Chr7)、QRn10(Chr10)进行检测，选择携带这些位点的植株进行进一步的回交、自交，直至纯合稳定，获得多年生稻新品系，命名为Perennial Rice 2428，即PR2428(表2)。
实施例4多年生稻生产试验
多年生稻PR24，该品系携带了多年生性遗传位点Rhz2(Chr3)、Rhz3(Chr4)、QRn2(Chr2)、QRbd2(Chr2)、QRn7(Chr7)、QRn10(Chr10)，除了具有多年生性外，该品系还具有株型紧凑、丰产稳产等优良特性，适于生产应用。多年生稻PR2428，除具有多年生性外，同时具备了楚粳28的优良特性，如株型紧凑、抗性强、高产稳产等优良性状。
将多年生稻品种PR24、PR2428和RD23(一年生稻对照)在西双版纳试验田进行同田种植，经过2年4季的田间试验，结果如下表(表3)所示：
表3多年生稻田间试验结果表
注：第一季为第一年早稻，第二季为第一年晚稻，第三季为第二年早稻，第四季为第二年晚稻；地点1种植条件及密度：自然条件，0.7万株/亩；地点2种植条件及密度：自然条件，1.1万株/亩。
由上表可知：多年生稻可以实现种植一次，通过无性繁殖连续收获2年共4次，具有多年生性；通过MAS技术进行遗传改良可以获得更多适应性广、高产优质多年生稻新品种。
实施例5多年生稻生产试验
多年生稻品系PR12-1375，该品系携带了多年生性遗传位点Rhz2(Chr3)、Rhz3(Chr4)、QRn3(Chr3)、QRbd2(Chr2)、QRl7(Chr7)、QRn10(Chr10)，具有较长的地下茎，可以实现多年生性，该品系还具有抗旱性强、抗病性强等优良特性，尽管产量相对低于普通栽培稻，但PR12-1375适于旱/山地生产应用，并能获得一定的产量。
将多年生稻品种PR12-1375、一年生陆稻IRAT104(对照)在澜沧或孟连山坡地上进行种植，经过2年4季的生产试验，结果证明，相对于IRAT104，PR12-1375具有多年生性、连续多季都可以获得一定的产量，可以有效防止水土流失(表4)。
表4多年生稻品系PR12-1375山地产量
由上表可知：多年生稻可以实现种植一次，通过无性繁殖连续收获2年共4次，具有多年生性；通过MAS技术进行遗传改良可以获得抗旱性强、抗病性强的多年生稻新品种。
应当理解的是，本发明的上述具体实施方式仅仅用于示例性说明或解释本发明的原理，而不构成对本发明的限制。因此，在不偏离本发明的精神和范围的情况下所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。此外，本发明所附权利要求旨在涵盖落入所附权利要求范围和边界、或者这种范围和边界的等同形式内的全部变化和修改例。