本发明属于植物的组织培养
技术领域：
，尤其涉及一种蓝莓组织培养的再生培养基及培养方法和应用。
背景技术：
：蓝莓为杜鹃花科越橘属植物，是具有较高的经济价值和广阔开发前景的新兴果树树种。蓝莓果实营养丰富，既可鲜食，也可深加工，低能量且含有多种抗氧化成分，尤其是其抗氧化能力为所有果品蔬菜之首。蓝莓果实不仅具有增强人体免疫力、防癌抗癌的奇特功效、并可以显著降低心血管疾病、糖尿病、帕金森病等的发病率；因此，蓝莓被誉为“黄金浆果”，是联合国粮农组织(fao)重点推荐的人类五大健康食品之一。我国蓝莓种植和研究较晚，从20世纪80年代才开始引进种植，但近几年发展呈迅猛态势。随着近来市场对蓝莓的需求量不断增长，传统的扦插、压条等繁殖方法繁殖系数和出苗率低，生根难，繁殖规模受限等缺点，难以满足迅速推广优良品种的需要。采用组织培养方法可以在短期内快速繁殖种苗，不仅繁殖率高，而且可以保持原繁殖母株的优良性状，生产出的苗木质量好，均匀一致，容易脱去病毒，为后期树体生长结果奠定良好的基础，组织培养技术近来来在生产上应用越来越广泛。在蓝莓组织培养中再生培养基的配方以及外源植株激素的加入至关重要。目前所公开的培养基的配方都是针对不同的品种而言的，并不是一种培养基配方就适合所有的蓝莓初代培养或再生培养。由于蓝莓品种差异对培养基的营养成分需求略有不同，因此通过组织培养方式生产蓝莓种苗时，需依据品种使用不同的培养基。同时，外源植物激素作为生长调节剂对离体外植体的分化存在明显促进作用，不同的植物激素种类及浓度对于离体外植体细胞的分化和不同器官发生起着不同的作用。目前，对于蓝莓外植体的再生技术尤其是蓝莓叶片离体再生技术的研究并不多，而且还存在着诸多问题。为进一步改良蓝莓品质，建立稳定的、高效的叶片离体再生体系是进行遗传转化的重要基础的前提，有助于对蓝莓进行遗传改良。因此，研究出适宜的蓝莓外植体再生技术中激素种类、浓度配比、再生培养基以及培养条件具有重要的现实意义。鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的第一目的在于提供一种蓝莓组织培养的再生培养基，具有针对性强、适应性好，成本低廉的优点，能够有效提高愈伤组织的诱导率和不定芽的分化率。本发明的第二目的在于提供一种蓝莓叶片离体再生的培养方法，该方法通过使用上述的蓝莓组织培养的再生培养基进行蓝莓叶片离体再生的培养，具有操作简便，成本低，诱导效率高，周期短的优点。本发明的第三目的在于提供一种上述的蓝莓组织培养的再生培养基在培养蓝莓布里吉塔方面的应用。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：根据本发明的一个方面，本发明提供一种蓝莓组织培养的再生培养基，包括初代培养基、增殖培养基和叶片不定芽诱导培养基；所述初代培养基包含：改良wpm培养基+0.5～2mg/l6－ba+15～40g/l蔗糖+5～15g/l植物凝胶，ph为5.2～5.4；所述增殖培养基包含：改良wpm培养基+0.5～2mg/lzt+15～40g/l蔗糖+5～15g/l植物凝胶，ph为5.2～5.4；所述叶片不定芽诱导培养基包含：改良wpm培养基+2～4mg/ltdz+15～40g/l蔗糖+5～15g/l植物凝胶，ph为5.2～5.4；其中，改良wpm培养基，是将wpm培养基中的cacl2·2h2o替换为糖醇钙。作为进一步优选技术方案，各培养基的原料及其含量分别是：所述初代培养基包含：改良wpm培养基+1～1.5mg/l6－ba+20～30g/l蔗糖+5～10g/l植物凝胶，ph为5.2～5.3；所述增殖培养基包含：改良wpm培养基+1～1.5mg/lzt+20～30g/l蔗糖+5～10g/l植物凝胶，ph为5.2～5.3；所述叶片不定芽诱导培养基包含：改良wpm培养基+3～4mg/ltdz+20～30g/l蔗糖+5～10g/l植物凝胶，ph为5.2～5.3。作为进一步优选技术方案，各培养基的原料及其含量分别是：所述初代培养基包含：改良wpm培养基+1mg/l6－ba+20g/l蔗糖+5g/l植物凝胶，ph为5.2；所述增殖培养基包含：改良wpm培养基+1mg/lzt+20g/l蔗糖+5g/l植物凝胶，ph为5.2；所述叶片不定芽诱导培养基包含：改良wpm培养基+4mg/ltdz+20g/l蔗糖+5g/l植物凝胶，ph为5.2。作为进一步优选技术方案，所述改良wpm培养基包括大量元素和微量元素；所述大量元素包括(nh4)2so4、糖醇钙、kh2po4、kno3和mgso4·7h2o；所述微量元素包括h3bo3、namoo4·2h2o、mnso4·h2o、znso4·7h2o和cuso4·5h2o。作为进一步优选技术方案，所述改良wpm培养基包括元素a液、元素b液、元素c液、元素d液、元素e液和有机物；元素a液的组分及含量为：400mg/l(nh4)2so4，684mg/l糖醇钙；元素b液的组分及含量为：6.2mg/lh3bo3，170mg/lkh2po4，0.25mg/lnamoo4·2h2o；元素c液的组分及含量为：190mg/lkno3；元素d液的组分及含量为：370mg/lmgso4·7h2o，22.3mg/lmnso4·h2o，8.6mg/lznso4·7h2o，0.25mg/lcuso4·5h2o；元素e液的组分及含量为：27.8mg/lfeso4·5h2o，37.3mg/lna2edta；有机物的组分及含量为：100mg/l肌醇，0.5mg/l烟酸，0.5mg/l磷酸吡哆醇(vb6)，0.5mg/l磷酸硫胺素(vb1)，2.0mg/l甘氨酸。根据本发明的另一个方面，本发明还提供一种使用以上所述的蓝莓组织培养的再生培养基进行蓝莓叶片离体再生的培养方法，包括以下步骤：外植体的选取与消毒处理：选用生长健壮的蓝莓枝条作为外植体，对外植体进行消毒处理；初代培养：将消毒后的蓝莓茎段切成2～3cm的茎段，每段带有1～2个腋芽，接种于初代培养基上进行初代培养，培养28～32天长出新枝；增殖培养：将初代培养长出的新枝切割后转接到新鲜的增殖培养基上进行增殖培养，每隔15～20天更换1次新鲜增殖培养基；叶片离体再生培养，包括外植体的选取和叶片不定芽的诱导；外植体的选取：选用增殖诱导的嫩叶作为外植体；叶片不定芽的诱导：切取距叶柄2/3的幼嫩叶片，近轴面朝上平放，并接种于叶片不定芽诱导培养基中，先进行黑暗培养5～8天，再进行正常光照培养。作为进一步优选技术方案，所述的消毒处理是将采集的枝条去掉叶片，并保留叶柄，剪成6～8cm带腋芽的茎段；将茎段用流动水冲洗20～40min，用质量浓度为0.08％～0.2％的洗涤剂溶液浸泡3～10min，再用流动水冲洗20～40min；随后用体积比为75％的酒精浸泡10～30s，再用体积分数为10％～30％的次氯酸钠浸泡20～40min，用无菌水冲洗2～5次，每次1～4min，沥干水分，备用。作为进一步优选技术方案，所述初代培养、增殖培养和叶片不定芽的诱导的正常光照培养条件均是，培养温度为22～28℃，光照强度为2000～3000lx，光照时间为12～18h/d。作为进一步优选技术方案，所述叶片离体再生培养还包括生根培养，将不定芽的小苗接种到生根培养基中进行生根培养；优选地，所述生根培养基包含：改良1/2wpm培养基+0.5～2mg/liba+15～40g/l蔗糖，ph为5.2～5.4；优选地，所述生根培养基为液体培养基，将液体培养基放置于穴盘式生根装置中进行生根培养；所述穴盘式生根装置包括托盘和穴盘，所述托盘内设置有用于容纳液体培养基的第一腔体，所述穴盘设置于所述第一腔体内，所述穴盘上设置有多个呈阵列布置的穴孔，在每个所述穴孔内放入一颗或多颗不定芽的小苗进行生根培养。根据本发明的另一个方面，本发明还提供以上所述的蓝莓组织培养的再生培养基在培养蓝莓布里吉塔方面的应用。与现有技术相比，本发明的有益效果在于：1、本发明的提供的蓝莓组织培养的再生培养基，包括初代培养基、增殖培养基和叶片不定芽诱导培养基，各阶段培养基中，采用的是改良wpm培养基，即将wpm培养基中的cacl2·2h2o替换为糖醇钙，从而有效减少氯离子对蓝莓生长的不利影响，而且还极大满足植物生长对钙元素的需求。同时，本发明的激素种类和配比合理，尤其在叶片不定芽诱导培养基中，采用tdz代替现有技术中常用的zt或naa，不仅诱导效率高，不定芽的分化率高，而且成本低，大大节约了组培成本，为企业创造更大的经济价值。2、本发明提供的蓝莓叶片离体再生的培养方法，操作简便，针对性强、适应性好，成本低廉，周期短，有效提高了愈伤组织的诱导率和不定芽的分化率；建立了稳定高效的蓝莓叶片再生体系，进而为建立蓝莓遗传转化体系提供了植株培养技术上的有利准备。3、本发明提供的蓝莓组织培养的再生培养基在培养蓝莓布里吉塔方面的应用，以填补现有技术还没有专门针对“布里吉塔”组织组织培养快繁而试验的再生培养基配方及外源植株激素种类的空白，为更好的推广蓝莓“布里吉塔”奠定坚实的基础。具体实施方式下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。需要说明的是，本发明中的英文字母缩写以及单位符号等的表示，均为本为本领域技术人员所公知的，均按常规理解即可，如无特殊说明，均为常规表达方式，例如wpm为woodplantmedium，代表木本植物用培养基；zt为zeatin，代表玉米素；h/d为hour/day，代表小时/天。根据本发明的一个方面，本实施方式提供一种蓝莓组织培养的再生培养基，包括初代培养基、增殖培养基和叶片不定芽诱导培养基；初代培养基包含：改良wpm培养基+0.5～2mg/l6－ba+15～40g/l蔗糖+5～15g/l植物凝胶，ph为5.2～5.4；增殖培养基包含：改良wpm培养基+0.5～2mg/lzt+15～40g/l蔗糖+5～15g/l植物凝胶，ph为5.2～5.4；叶片不定芽诱导培养基包含：改良wpm培养基+2～4mg/ltdz+15～40g/l蔗糖+5～15g/l植物凝胶，ph为5.2～5.4；其中，改良wpm培养基，是将wpm培养基中的cacl2·2h2o替换为糖醇钙。本发明中的改良wpm培养基，是在已经报道的wpm培养基配方的基础上，根据蓝莓生长的特殊需要改进得到的。其中，所述的已经报道的wpm培养基配方典型但非限制的例如为：400mg/lnh4no3，556mg/lca(no3)2·4h2o，96mg/lcacl2·2h2o，900mg/lk2so4，170mg/lkh2po4，370mg/lmgso4·7h2o，0.25mg/lnamoo4·2h2o，22.4mg/lmnso4·h2o，8.6mg/lznso4·7h2o，0.25mg/lcuso4·5h2o，27.8mg/lfeso4·5h2o，37.3mg/lna2edta，100mg/l肌醇，0.5mg/l烟酸，0.5mg/l磷酸吡哆醇(vb6)，0.5mg/l磷酸硫胺素(vb1)，2.0mg/l甘氨酸。与原来的wpm培养基相比，本发明的改良wpm培养基将原有的cacl2·2h2o替换为糖醇钙，ca(钙)是构成细胞壁的一种成分，ca对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著的作用，因此在培养基中需要添加大量的ca元素，现有的ca元素的提供方式，都是通过cacl2·2h2o提供。然而，cacl2·2h2o中含有cl(氯)离子，cl离子对于蓝莓植物生长有一定的毒害或阻碍作用，不利于植物的生根，组织液中过量的cl离子的积累往往会造成危害。本发明将cacl2·2h2o替换为糖醇钙，不仅极大满足植物对ca元素的需求，而且减少cl离子的迫害作用。本发明提供的植物生长调节剂中：6－ba即6－苄基氨基嘌呤(6－benzylaminopurine)，具有促进细胞分裂，促进非分化组织分化，促进生物体内物质的积累，诱导芽的分化，促进侧芽萌发，防止老化等作用，还能减少植物体内叶绿素的分解，具有抑制衰老、保绿等作用。本发明中的6－ba添加量为0.5～2mg/l，在一个具体实施方式中，可选的，6－ba添加量为0.5mg/l、1mg/l、1.5mg/l或2mg/l。zt即玉米素(zeatin)，是存在于高等植物的一种天然植物细胞分裂素，不仅促进侧芽生长，刺激细胞分化(侧端优势)，促进愈伤组织和种子发芽，还能防止叶片老化，逆转芽部受到的毒素伤害和抑制过度根部形成；高浓度的zt还能产生不定芽分化。本发明中的zt添加量为0.5～2mg/l，在一个具体实施方式中，可选的，zt添加量为0.5mg/l、1mg/l、1.5mg/l或2mg/l。tdz即噻苯隆(thidiazuron，又名脱叶灵)，具有很强的细胞分裂素活性(ctk)，它的ctk活性要比一般ctk高几十倍至几百倍；它可以促进植物芽的再生和繁殖，可以促进种子萌发，促进愈伤组织生长，延缓植物衰老；并且可以对其它的植物激素和生理活性物质的作用来调节植物的生长发育过程。本发明中的tdz添加量为2～4mg/l，在一个具体实施方式中，可选的，tdz添加量为2mg/l、2.5mg/l、3mg/l、3.5mg/l或4mg/l。蔗糖，是最为常用也是较好的碳源，可为细胞提供合成新化合物的碳骨架，为细胞的呼吸代谢提供底物与能源，能够使得蓝莓植株生长更健壮。本发明中的蔗糖添加量为15～40g/l，在一个具体实施方式中，可选的，蔗糖添加量为15g/l、20g/l、25g/l、30g/l、35g/l或40g/l。植物凝胶，是从假单胞菌分泌而来的一种琼脂的替代物，是葡萄糖醛酸、鼠李糖和葡萄糖的混合物，具有无色、透亮和高韧性的特点，能够克服传统琼脂在植物组织培养中的固有缺陷。将植物凝胶用于蓝莓的组织培养中能够使培养基的酸碱度更加稳定，蓝莓植株生长的更好。本发明中的植物凝胶添加量为5～15g/l，在一个具体实施方式中，可选的，植物凝胶添加量为5g/l、6g/l、7g/l、8g/l、9g/l、10g/l、11g/l、12g/l、13g/l、14g/l或15g/l。本发明的培养基ph为5.2～5.4，蓝莓组织培养对ph值的要求比较严格，过高或过低都会对植株生长和生根造成影响，因此要精准调节ph值。其ph值优选为5.2，也可以为5.3或5.4。需要注意的是，各培养基的配制过程中，在培养基中加入各激素、蔗糖和植物凝胶，调节ph值，121℃高压灭菌20min，备用；尤为注意的是，zt须在60℃以下超净工作台中加入。与现有技术相比，本发明的蓝莓组织培养的再生培养基，采用改良wpm培养基，针对性强，适应性好，且各阶段的激素种类选取与配比合理，使得植株生长健壮，尤其是在叶片不定芽诱导培养基中，采用tdz代替现有技术中常用的zt或naa，有效提高了愈伤组织的诱导率和不定芽的分化率，而且成本低，效果好，经济效益好。此外，在初代培养基、增殖培养基和叶片不定芽诱导培养基中，分别采用6－ba、zt和tdz作为植物生长调节剂，三者配合使用，更适宜于蓝莓“布里吉塔”品种的培育，使得诱导效率更高，育苗周期短，降低了成本，提高了苗木的繁殖效率。作为一种可选实施方式，各培养基的原料及其含量分别是：初代培养基包含：改良wpm培养基+1～1.5mg/l6－ba+20～30g/l蔗糖+5～10g/l植物凝胶，ph为5.2～5.3；增殖培养基包含：改良wpm培养基+1～1.5mg/lzt+20～30g/l蔗糖+5～10g/l植物凝胶，ph为5.2～5.3；叶片不定芽诱导培养基包含：改良wpm培养基+3～4mg/ltdz+20～30g/l蔗糖+5～10g/l植物凝胶，ph为5.2～5.3。作为一种可选实施方式，各培养基的原料及其含量分别是：初代培养基包含：改良wpm培养基+1mg/l6－ba+20g/l蔗糖+5g/l植物凝胶，ph为5.2；增殖培养基包含：改良wpm培养基+1mg/lzt+20g/l蔗糖+5g/l植物凝胶，ph为5.2；叶片不定芽诱导培养基包含：改良wpm培养基+4mg/ltdz+20g/l蔗糖+5g/l植物凝胶，ph为5.2。通过对各阶段培养基中各附加量的用量的进一步调整和优化，从而进一步优化了本发明中植物激素等附加物的功效，使得效果更好，更有益于植物的生长。作为一种可选实施方式，所述改良wpm培养基包括大量元素和微量元素；所述大量元素包括(nh4)2so4、糖醇钙、kh2po4、kno3和mgso4·7h2o；所述微量元素包括h3bo3、namoo4·2h2o、mnso4·h2o、znso4·7h2o和cuso4·5h2o。作为一种可选实施方式，所述改良wpm培养基包括元素a液、元素b液、元素c液、元素d液、元素e液和有机物；元素a液的组分及含量为：400mg/l(nh4)2so4，684mg/l糖醇钙；元素b液的组分及含量为：6.2mg/lh3bo3，170mg/lkh2po4，0.25mg/lnamoo4·2h2o；元素c液的组分及含量为：190mg/lkno3；元素d液的组分及含量为：370mg/lmgso4·7h2o，22.3mg/lmnso4·h2o，8.6mg/lznso4·7h2o，0.25mg/lcuso4·5h2o；元素e液的组分及含量为：27.8mg/lfeso4·5h2o，37.3mg/lna2edta；有机物的组分及含量为：100mg/l肌醇，0.5mg/l烟酸，0.5mg/l磷酸吡哆醇(vb6)，0.5mg/l磷酸硫胺素(vb1)，2.0mg/l甘氨酸。本实施方式提供的改良wpm培养基，与原来的wpm培养基相比，将原来的wpm培养基中nh4no3400mg/l、ca(no3)2·4h2o556mg/l、cacl2·2h2o96mg/l和k2so4900mg/l四种组分去掉，而加入了(nh4)2so4400mg/l、糖醇钙684mg/l、h3bo36.2mg/l和kno3190mg/l四种组分，原来的四种组分营养不均衡，n(氮)元素含量偏低，而且cl(氯)元素含量高，很不利于蓝莓的生长，因此改良后添加糖醇钙，有效减少cl元素对蓝莓生长的毒害作用，同时充分提供蓝莓生长所需要的ca(钙)元素；此外，n元素能够在(nh4)2so4中能够充分提供，k(钾)元素在kno3中能够充分提供。因此，本实施方式提供的改良wpm培养基，更适合蓝莓“布里吉塔”品种，营养成分均衡，适应性好，更有益于蓝莓植物的生长，植物生长效果更好，而且母液的配置更加便利。根据本发明的另一个方面，本实施方式还提供一种使用以上所述的蓝莓组织培养的再生培养基进行蓝莓叶片离体再生的培养方法，所述方法包括以下步骤：外植体的选取与消毒处理：选用生长健壮的蓝莓枝条作为外植体，对外植体进行消毒处理；初代培养：将消毒后的蓝莓茎段切成2～3cm的茎段，每段带有1～2个腋芽，接种于初代培养基上进行初代培养，培养28～32天长出新枝；增殖培养：将初代培养长出的新枝切割后转接到新鲜的增殖培养基上进行增殖培养，每隔5～8天更换1次新鲜增殖培养基；叶片离体再生培养，包括外植体的选取和叶片不定芽的诱导；外植体的选取：选用增殖诱导的嫩叶作为外植体；叶片不定芽的诱导：切取距叶柄2/3的幼嫩叶片，近轴面朝上平放，并接种于叶片不定芽诱导培养基中，先进行黑暗培养5～8天，再进行正常光照培养。本实施方式采用蓝莓“布里吉塔”为叶片离体再生培养对象。外植体是指植物组织培养中的各种接种材料，可为植物的根、叶、茎、花药等。本发明中选择蓝莓生长旺盛季节健壮、无病虫害、树形好的半木质化“布里吉塔”新梢为外植体。需要注意的是，初代培养中，将消毒后的茎段接种于初代培养基上时，茎段要平放，动作要快，尽量减少外植体与外界空气的接触时间，以减少褐变，提高成活率。培养28～32天长出新枝，例如可以为28天、29天、30天、31天或32天。增殖培养过程中，每隔15～20天更换1次新鲜增殖培养基，例如可以为15天、16天、17天、18天、19天或20天。在叶片离体再生培养过程中，先进行黑暗培养5～8天，例如可以为5天、6天、7天或8天，再进行正常光照培养，并且每隔15天更换1次新鲜培养基，30天后统计平均出愈率，90天后统计不定芽的平均诱芽数。本发明建立了稳定、高效的蓝莓叶片离体再生体系，具有操作简便，针对性强、适应性好，成本低廉，周期短的优点，有效提高了愈伤组织的诱导率和不定芽的分化率，为建立蓝莓遗传转化体系提供了植株培养技术上的有利准备。作为一种可选实施方式，所述的消毒处理是将采集的枝条去掉叶片，并保留叶柄，剪成6～8cm带腋芽的茎段；将茎段用流动水冲洗20～40min，用质量浓度为0.08％～0.2％的洗涤剂溶液浸泡3～10min，再用流动水冲洗20～40min；随后用体积比为75％的酒精浸泡10～30s，再用体积分数为10％～30％的次氯酸钠浸泡20～40min，用无菌水冲洗2～5次，每次1～4min，沥干水分，备用。其中，带腋芽的茎段为6～8cm，例如可以为6cm、7cm或8cm。用流动水冲洗20～40min，例如可以为20min、25min、30min、35min或40min。所述的洗涤剂溶液为现有的市售的任一种洗涤灵溶液或洗衣粉溶液；其质量浓度为0.08％～0.2％，例如可以为0.08％、0.1％、0.12％、0.15％、0.18％或0.2％；浸泡3～10min，例如可以为3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min或10min。所述的次氯酸钠体积分数为10％～30％，例如可以为10％、15％、20％、25％或30％；浸泡20～40min，例如可以为20min、25min、30min、35min或40min。用无菌水冲洗2～5次，例如可以为2次、3次、4次或5次；每次1～4min，例如可以为1min、2min、3min或4min。可选的，本发明中的消毒处理过程为：将采集的枝条去掉叶片，并保留叶柄，剪成6～8cm带腋芽的茎段；将茎段用流动水冲洗30min，用质量浓度为0.1％的洗涤剂溶液浸泡5min，再用流动水冲洗30min；随后在超净工作台用体积比为75％的酒精浸泡20s，再用体积分数为30％的次氯酸钠浸泡30min，用无菌水冲洗3次，每次2min，沥干水分，备用。作为一种可选实施方式，所述初代培养、增殖培养和叶片不定芽的诱导的正常光照培养条件均是，培养温度为22～28℃，光照强度为2000～3000lx，光照时间为12～18h/d。本发明中，可采用微电脑时控开关控制培养室每日光照时间。可选的，叶片离体再生培养中，黑暗培养时，温度为18～22℃，湿度为60％～80％；正常光照培养的条件与初代培养的条件相同。本发明中各组织培养阶段的培养培养温度为25±3℃，优选为25℃，例如可以为22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃或28℃。光照强度为2000～3000lx，优选为2500lx，例如可以为2000lx、2100lx、2200lx、2300lx、2400lx、2500lx、2600lx、2700lx、2800lx、2900lx或3000lx。光照时间为12～18h/d，优选为16h/d，例如可以为12h/d、13h/d、14h/d、15h/d、16h/d、17h/d或18h/d。作为一种可选实施方式，所述叶片离体再生培养还包括生根培养，将不定芽的小苗接种到生根培养基中进行生根培养；优选地，所述生根培养基包含：改良1/2wpm培养基+0.5～2mg/liba+15～40g/l蔗糖，ph为5.2～5.4；优选地，所述生根培养基为液体培养基，将液体培养基放置于穴盘式生根装置中进行生根培养；所述穴盘式生根装置包括托盘和穴盘，所述托盘内设置有用于容纳液体培养基的第一腔体，所述穴盘设置于所述第一腔体内，所述穴盘上设置有多个呈阵列布置的穴孔，在每个所述穴孔内放入一颗或多颗不定芽的小苗进行生根培养。更优选地，所述生根培养基包含：改良1/2wpm培养基+1～1.5mg/liba+20～30g/l蔗糖，ph为5.2～5.3；更优选地，所述生根培养基包含：改良1/2wpm培养基+1mg/liba+20g/l蔗糖，ph为5.2。本实施方式还提供了不定芽的生根培养，进而建立一个完整的蓝莓“布里吉塔”组培快速繁殖技术，为大量推广蓝莓“布里吉塔”奠定更好的基础。其中，改良1/2wpm培养基是指将改良wpm培养基中的无机盐成分含量减半，其他成分不变。iba即吲哚丁酸，是组织培养中常用的植物生长调节剂，能够促进植物生根，是促进发根能力较强的生长调节物质。所述生根培养的条件为：培养温度为23～27℃，光照强度为3000lx，光照时间为12～16h/d，培养30～45天，生根率可达95％以上。生根培养温度为23～27℃，优选为25℃，例如可以为23℃、24℃、25℃、26℃或27℃。光照时间为12～16h/d，优选为14h/d，例如可以为12h/d、13h/d、14h/d、15h/d或16h/d，可采用微电脑时控开关控制培养室每日光照时间。本实施方式在生根培养中采用的生根装置为发明人自己研发的培养装置，即穴盘式生根装置。具体的讲，该穴盘式生根装置包括托盘和穴盘，托盘内设置有用于容纳液体培养基的第一腔体，穴盘设置于第一腔体内，穴盘上设置有多个呈阵列布置的穴孔；沿穴盘的高度方向，穴盘具有相对应的第一表面和第二表面；穴孔沿高度方向的一端在第一表面上形成第一开口；穴盘的第二表面上设置有第二开口，且第二开口与穴孔连通；第一表面远离第一腔体的底面，第二表面与第一腔体的底面之间有距离；当第一腔体内设置有液体培养基时，第二开口浸没于液体培养基中。进一步地，该穴盘式生根装置还包括设置有杯腔的滤纸杯；穴孔呈锥台体，且穴孔贯穿穴盘，并在穴盘的第一表面形成第一开口，在第二表面形成第二开口，且第一开口的直径大于第二开口的直径；滤纸杯呈圆柱体，且圆柱体的直径大于第二开口的直径，且小于第一开口的直径；滤纸杯搭设于穴孔内，且杯腔的底面位于穴孔内。进一步地，该穴盘式生根装置还包括吸水滤纸；吸水滤纸与滤纸杯连接，且吸水滤纸通过第二开口与第一腔体内的生根营养液接触。沿所述穴盘的高度方向，滤纸杯的高度高于第一开口。采用上述穴盘式生根装置进行生根培养的优势在于，穴盘上设置有多个穴孔，每个穴孔中可以放入一棵或者多棵不定芽，因而不定芽的培育密度增大，使得单位面积上不定芽的数量远远大于使用营养杯培育不定芽的数量，因而实现了可在有限面积内诱导大量不定芽生根，大大节省了育苗空间。将不定芽放置于穴孔内，由于第二开口浸没于液体培养基中，因而液体培养基能够为不定芽提供营养物质，且可以方便的通过调节液体培养基的浓度和数量对不定芽的营养供给，使得液体培养基液能够满足不定芽的正常生长；另外，不定芽的根可以通过第二开口进入穴盘和第一腔体的底面之间的空间，此空间一方面能够提供不定芽生根所需要的的足够的空间，另一方面，穴盘和第一腔体的底面之间的液体培养基能够继续为伸出第二开口的不定芽的生根提供营养物质。也就是说，本实施方式提供的生根装置能够在满足不定芽正常生根生长的前提下，提高不定芽的培育密度，实现了在有限面积内诱导大量不定芽生根，节省空间，且操作方便，经济效益好。根据本发明的另一个方面，本实施方式还提供一种以上所述的蓝莓组织培养的再生培养基在培养蓝莓布里吉塔方面的应用。目前所公开的培养基的配方都是针对不同的品种而言的，并不是一种培养基配方就适合所有的蓝莓初代培养或再生培养。而本发明经过多次试验，筛选出适合于蓝莓“布里吉塔”组织培养的再生培养基配方。“布里吉塔”品种原产于澳大利亚，树势强，树体紧凑，酸甜适度，土壤适应性强，是同一时期品种中果味较好的品种；且在我国浙江等地的适应性强。目前已发表的相关文献资料中，还没有专门针对“布里吉塔”组织培养快繁而试验的培养基配方。因此，布里吉塔的组织培养的培养基配方目前还属空白；而本发明通过多次试验，研究出最适合蓝莓“布里吉塔”组织培养的再生培养基配方，填补了此项空白，为更好的推广蓝莓“布里吉塔”奠定坚实的基础。下面结合具体实施例、对比例、实验例和效果例，对本发明作进一步说明。实施例1－4一种蓝莓组织培养的再生培养基，包括初代培养基、增殖培养基和叶片不定芽诱导培养基，实施例1－4各阶段培养基的配方如表1所示。表1实施例1－4各阶段培养基的配方其中，改良wpm培养基包括元素a液、元素b液、元素c液、元素d液、元素e液和有机物；元素a液的组分及含量为：400mg/l(nh4)2so4，684mg/l糖醇钙；元素b液的组分及含量为：6.2mg/lh3bo3，170mg/lkh2po4，0.25mg/lnamoo4·2h2o；元素c液的组分及含量为：190mg/lkno3；元素d液的组分及含量为：370mg/lmgso4·7h2o，22.3mg/lmnso4·h2o，8.6mg/lznso4·7h2o，0.25mg/lcuso4·5h2o；元素e液的组分及含量为：27.8mg/lfeso4·5h2o，37.3mg/lna2edta；有机物的组分及含量为：100mg/l肌醇，0.5mg/l烟酸，0.5mg/l磷酸吡哆醇(vb6)，0.5mg/l磷酸硫胺素(vb1)，2.0mg/l甘氨酸。对比例1－3一种蓝莓组织培养的再生培养基，包括初代培养基、增殖培养基和叶片不定芽诱导培养基，与实施例3不同的叶片不定芽诱导培养基，其余均与实施例3相同。对比例1－3中，叶片不定芽诱导培养基中所采用的激素与实施例3不同，对比例1－3在叶片不定芽诱导培养基中所采用的激素种类及配比如表2所示。表2对比例1－3在叶片不定芽诱导培养基中所采用的激素种类及配比项目激素种类及配比对比例1zt4.0mg/l+naa0.5mg/l对比例2tdz2.0mg/l+naa0.5mg/l对比例3tdz4.0mg/l+naa0.5mg/l对比例4一种蓝莓组织培养的再生培养基，包括初代培养基、增殖培养基和叶片不定芽诱导培养基，与实施例3不同的改良wpm培养基，其余均与实施例3相同。对比例4中，采用原有的wpm培养基，即将改良wpm培养基中的400mg/l(nh4)2so4、684mg/l糖醇钙、6.2mg/lh3bo3和190mg/lkno3四种组分去掉，而加入nh4no3400mg/l、ca(no3)2·4h2o556mg/l、cacl2·2h2o96mg/l和k2so4900mg/l四种组分；其余组分含量不变。实验例1一种蓝莓叶片离体再生的培养方法，包括以下步骤：(1)外植体的选取与消毒处理：选择蓝莓生长旺盛季节健壮、无病虫害、树形好的半木质化“布里吉塔”新梢为外植体，对外植体进行消毒处理；消毒处理过程为：将采集的枝条去掉叶片，并保留叶柄，剪成6cm带腋芽的茎段；将茎段用流动水冲洗30min，用质量浓度为0.1％的洗涤剂溶液浸泡5min，再用流动水冲洗30min；随后在超净工作台用体积比为75％的酒精浸泡20s，再用体积分数为30％的次氯酸钠浸泡30min，用无菌水冲洗3次，每次2min，沥干水分，备用。(2)初代培养：将消毒后的蓝莓茎段切成3cm的茎段，每段带有2个腋芽，接种于初代培养基上进行初代培养，培养30天长出新枝；培养条件为，培养温度为25℃，光照强度为2500lx，光照时间为16h/d。(3)增殖培养：将初代培养长出的新枝切割后转接到新鲜的增殖培养基上进行增殖培养，每隔15天更换1次新鲜增殖培养基；培养条件为，培养温度为25℃，光照强度为2500lx，光照时间为16h/d。(4)叶片离体再生培养，包括外植体的选取和叶片不定芽的诱导；外植体的选取：选用增殖诱导的嫩叶作为外植体；叶片不定芽的诱导：切取距叶柄2/3的幼嫩叶片，近轴面朝上平放，并接种于叶片不定芽诱导培养基中，先进行黑暗培养7天，再进行正常光照培养，正常光照培养的条件与初代培养的条件相同。本实验例中，采用的是实施例3所述的蓝莓组织培养的再生培养基。实验例2－8与实验例1不同的是，实验例2－8所采用的蓝莓组织培养的再生培养基分别为实施例1、2、4和对比例1－4所提供的再生培养基。具体培养方法与实验例1均相同。实验例9本实验例中，叶片离体再生培养还包括生根培养，将不定芽的小苗接种到生根培养基中进行生根培养；生根培养的条件为：培养温度为25℃，光照强度为3000lx，光照时间为16h/d，培养30天，生根率可达96.5％，根系发达，生根效果好，植株生长势强，且生长均一。其中的生根培养基包含：改良1/2wpm培养基+1mg/liba+20g/l蔗糖，ph为5.2。实验例10与实验例9不同的是，本实施例中采用的生根装置为穴盘式生根装置，生根培养条件与实验例9相同。该穴盘式生根装置包括托盘和穴盘，托盘内设置有用于容纳液体培养基的第一腔体，穴盘设置于第一腔体内，穴盘上设置有多个呈阵列布置的穴孔；沿穴盘的高度方向，穴盘具有相对应的第一表面和第二表面；穴孔沿高度方向的一端在第一表面上形成第一开口；穴盘的第二表面上设置有第二开口，且第二开口与穴孔连通；第一表面远离第一腔体的底面，第二表面与第一腔体的底面之间有距离；当第一腔体内设置有液体培养基时，第二开口浸没于液体培养基中。每个穴孔中可以放入1～4棵不定芽小苗，培养30天，生根率可达98.2％，根系发达，生长均一，培育密度增大，增强了生长势强，提高了繁殖效率。效果例1分别对实验例1－8的培养方法进行统计分析。观察愈伤的生长情况，并统计诱导分化出的不定芽的出芽数以及愈伤组织的出愈率。外植体接种于叶片不定芽诱导培养基30天后统计平均出愈率，90天后统计不定芽的平均诱芽数，统计分析结果如表3所示。表3实验例1～8的统计分析结果由表3可以看出，实验例1提供的初代培养基、增殖培养基和叶片不定芽诱导培养基采用的是实施例3的配方，在该配方条件下进行的蓝莓叶片离体再生的培养，能够在短时期内有效促进离体外植体再生，其产生的不定芽除叶片伤口的愈伤组织上，并且在叶片表面也产生了一定数量不定芽，诱导效率高，出芽率高。而实验例2－4分别采用了实施例1、2和4的培养基配方进行的蓝莓叶片离体再生的培养，其在各阶段的激素配比与ph值略有不同，对于愈伤组织生长和出芽率有一定的影响，但在本发明所限定的范围内均能获得较好的再生培养效果。实验例5－7分别采用了对比例1－3的培养基配方进行的蓝莓叶片离体再生的培养，其在叶片不定芽的诱导过程中采用了不同的激素，对于叶片不定芽的诱导却得到了较差的效果。由此可见，植物生长调节物质作为再生培养基中的关键物质之一，起到了极为重要的生长调节作用。而本发明采用的tdz能够在叶片伤口形成不定芽的过程中起到了积极的促进作用。实验例8采用了对比例4的培养基配方进行的蓝莓叶片离体再生的培养，其采用的是原有的wpm培养基，再生培养效果比本发明提供的改良wpm培养基效果差。由此可见，本发明提供的改良wpm培养基针对性更强，适应性更好，更有利于不定芽的分化。综上，采用本发明提供的蓝莓组织培养的再生培养基，针对性强，适应性好，各阶段的激素种类选取与配比合理，使得植株生长健壮，尤其是在叶片不定芽诱导培养基中，采用tdz激素，能够有效提高了愈伤组织的诱导率和不定芽的分化率。最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。当前第1页12