一种生物组织培养制备秦岭岩白菜的方法与流程

本发明属于生物学领域，涉及秦岭岩白菜，具体来说是一种生物组织培养制备秦岭岩白菜的方法。

背景技术：

秦岭岩白菜(bergeniascopulosat.p.wang)为虎耳草科岩白菜属多年生草本，该属植物全世界有10种，我国产7种，其中秦岭岩白菜(其根状茎在陕西眉县及秦岭山区称为盘龙七)不仅是我国3个特有种之一，而且为本属最原始的种。国内野生种多分布于陕西、四川及甘肃东南部，进人冬季，在原产地多枯萎落叶，但开花较早，花朵粉色，观赏价值高(图1～图2)。全草含有岩白菜素，根茎含药量比较高，已被《中华本草》和《陕西中草药》所收载，是陕西民间常用药，涩、味苦、平；具有补脾健胃，收涩固肠，除湿利水，活血的功效；主治急慢性肠胃炎、浮肿、秃疮、疥癣等，是治疗呼吸系统疾病的特效药。

近些年，学者们对其开花特性、传粉适应性及繁育系统进行了分析研究，认为其存在自交退化现象,故自然结实率极低，种子萌发率不高，主要靠地下根状茎分株繁殖，繁殖率低，生长缓慢。暂未见到有关秦岭岩白菜离体培养及标准化生产的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种生物组织培养制备秦岭岩白菜的方法，所述的这种秦岭岩白菜的培养方法要解决现有技术中野生秦岭岩白菜繁殖率低的技术问题。

本发明提供了一种生物组织培养制备秦岭岩白菜的方法，包括如下步骤：

1)一个制备无菌母本的步骤：将秦岭岩白菜茎尖外植体用自来水冲洗干净后，去掉叶片和肥厚的肉质根茎，切割成直径为0.4～0.6cm，高度为0.4～0.6cm的圆柱状结构，使茎尖生长点位于中央，留2片短的叶柄基部保护中间的生长点；用质量百分比浓度为60～75％的酒精消毒，再用含vc0.5mg/l的升汞液浸泡10～20分钟，在所述的升汞液中，升汞的质量百分比浓度为0.1～0.2％，再用无菌水冲洗，然后接种到初代培养基中；

2)一个初代培养的步骤：所述的初代培养基为ms+zt0.05～0.5mg/l+iba0.02～0.05mg/l+核黄素2～10mg/l，培养25～35d后获得无菌试管苗；

3)一个分化和增殖的步骤:将步骤1)培养出的试管苗，挑选大小一致、颜色嫩绿的试管苗，转入增殖培养基中培养25～35天，所述的增殖培养基为ms+zt0.5～2mg/l+kt0.05～1mg/l+iba0.02～0.2mg/l+核黄素2～10mg/l；

4)一个生根培养的步骤:将试管苗基部的杂物切除干净，切口平整，保留2对叶片，转入生根培养基ms+iba0.5～2.0mg/l+核黄素2～10mg/l中，生根培养25～35天；

5)一个移栽试管苗的步骤：试管苗根系长至0.4～0.6cm时，选择根系发达生长健壮的无菌苗，室内开瓶炼苗3d，取出后洗净根部琼脂，移栽入混合基质中，所述的混合基质由珍珠岩、草炭土和泥炭组成，所述的珍珠岩、草炭土和泥炭的质量比为2:1:2，通气，在温室中驯化45d后，即可移栽室外。

进一步的，外植体取自温室里培养半年后，秦岭岩白菜母本分株苗的顶芽；

进一步的，所述的升汞液中，还添加有吐温-80；升汞液可以为0.1～0.2％区间的任一浓度；升汞液浸泡时间可以为10～20分钟区间的任一时间。

进一步的，所述的初代培养基中，zt可以为0.05～0.5mg/l区间的任一浓度；iba可以为0.02～0.05mg/l区间的任一浓度；核黄素可以为2～10mg/l区间的任一浓度；

进一步的，所述的增殖培养基中，zt可以为0.5～2mg/l区间的任一浓度；kt可以为0.05～1mg/l区间的任一浓度；iba可以为0.01～0.2mg/l区间的任一浓度；核黄素可以为2～10mg/l区间的任一浓度；

进一步的，所述的生根培养基中，iba可以为0.5～2.0mg/l区间的任一浓度；核黄素可以为2～10mg/l区间的任一浓度。

本发明和已有技术相比，技术效果是积极和明显的。本发明提高了秦岭岩白菜的成活率，使得秦岭岩白菜可以进行标准化的生产和规模化的栽培。

附图说明

图1显示了秦岭岩白菜早春开花的照片。

图2显示了秦岭岩白菜春季生长情况的照片。

图3显示了分株苗的照片。

图4显示了增殖培养的照片。

图5显示了生根试管苗的照片。

图6显示了标准化繁殖的照片。

具体实施方式

下述的实施方式统计数据时，每种处理调查20个，统计诱导率、芽增殖系数、生根率。

诱导率＝出芽外植体数/接种数，芽增殖系数＝增殖芽数/接种数，生根率＝生根株数/接种数。

采用excel2003和dps14.5数据处理系统对数据进行统计分析。采用完全随机单因素试验统计法和lsd法进行方差分析和多重比较(α＝0.05)

实施例1

1材料与方法

1.1试验材料

秦岭岩白菜取自秦岭山脉海拔1800m处。在上海栽培半年后，选择生长健壮，无病虫害植株作为取样母本，取母本顶芽以及分株出来的幼苗顶芽作为起始外植体，去掉根叶，修切后取其茎尖消毒后进行初代培养。

1.2培养条件

无菌苗于光照条件下培养，光照度1500～2500lx，光周期10～14h/d，温度25℃。各种培养基的ph调为5.75，蔗糖3％，琼脂0.64％，分装后在高压灭菌锅中121℃条件下保持18min。

1.3无菌苗获得

秦岭岩白菜外植体修切及处理如下：自来水冲洗干净后，去掉叶片和肥厚的肉质根茎，切为直径大约0.5cm，高度大约0.5cm的近圆柱状，茎尖生长点位于中央，并留2片极短的叶柄基部保护中间的生长点，以减弱消毒处理时消毒液对生长点分生细胞的伤害；先用72％的酒精消毒30s，无菌水冲洗3次，再用含0.5mg/lvc的升汞液(0.1～0.2％，加数滴吐温-80)浸15min，无菌水冲洗5次后，接种到初代培养基上。外植体来源有两种，一是原来母株的顶芽，二是温室里培养半年后分株苗的顶芽(图3)，修切大小、方式、处理方式相同的情况下，无菌苗得率不同(表1)，二者差异显著。

表1不同来源外植体对无菌苗获得的影响

*表中数据为平均值±标准误差(n＝3)，同列数字后不同的字母表示0.05水平差异显著性(p﹤0.05)，下同。

1.4初代诱导

初代诱导培养基中，ms为基础培养基，zt设0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0mg/l计6种浓度；iba设0.01、0.02、0.04、0.05、0.1mg/l计5种浓度梯度；核黄素设0.5、1、2、4、5、6、8、10、12mg/l计8种浓度。试验结果显示，当zt浓度为0.05～0.5mg/l时，外植体都可以萌发生长，其中浓度为0.2mg/l时，外植体萌发诱导率达到60％，培养一个月之后，没有出现分化现象，有利于后期增殖培养的统计分析；当浓度为0.5mg/l及以上时，诱导率虽然也超过65％，但培养后期出现分化现象，不利于增殖培养的统计分析。筛选zt0.05～0.5mg/l为zt的适宜浓度，其中0.2mg/l为最佳浓度，与低于此浓度的其它处理比较，差异显著(表2)。

表2不同zt水平对初代诱导的影响

在培养基ms+zt0.2mg/l的基础上，添加不同浓度的iba，发现添加iba对于外植体诱导率没有明显影响(表3)，但对于外植体的伸长培养影响显著。培养一个月后，在0.02～0.05mg/l范围内，伸长明显，在iba0.04mg/l的培养基中，外植体生长至1cm，基部没有生根现象；当iba浓度到达0.05mg/l及以上时候，外植体虽然也有伸长，但基部出现生根现象，不利于后期的统一生根。筛选0.02～0.05mg/l为iba的适宜浓度，其中0.04mg/l为iba的最佳浓度，与低于此浓度的其它处理组比较，差异显著(表3)。

表3不同iba水平对初代诱导的影响

在培养基ms+zt0.2mg/l+iba0.04mg/l的基础上，添加不同浓度的核黄素，发现其可以促进外植体的萌发，利于秦岭岩白菜试管苗的生长分化。当核黄素浓度在2～10mg/l范围时，诱导率在65％～70％；其中浓度为5mg/l时，诱导率达到最高为85％，与低于此浓度的其它处理比较，差异显著(表4)。筛选2～10mg/l为核黄素的适宜浓度，5mg/l为最佳浓度。

表4不同核黄素浓度水平对初代诱导的影响

实施例2分化和增殖培养

1.培养基配方设计

增殖阶段，采用ms为基础培养基，zt设置为0.1、0.5、1.0、2.0、3.0mg/l计5种浓度；kt设置为0.01、0.05、0.1、0.5、1、2mg/l计6种浓度；iba设置0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3mg/l计6种浓度；同时添加核黄素2～10mg/l。

2.分化和增殖

初代诱导培养基上诱导出的试管苗，待其逐渐长大，获得一定量试管苗时，挑选0.5cm高度、颜色嫩绿的试管苗，同批次转入增殖培养基中，筛选适宜增殖培养基。结果显示，当zt浓度为0.5～2mg/l时，增殖系数都达到了2以上，其中浓度为1mg/l时，增殖系数达到最高为2.4，与其它处理比较，差异显著(表5)。筛选0.5～2mg/l为zt的适宜浓度，其中1.0mg/l为最佳浓度。

表5不同zt浓度水平对芽增殖的影响

在ms+zt1.0+iba0.01mg/l培养基的基础上，添加不同浓度的kt，观察不同kt浓度对秦岭岩白菜增殖的影响，培养一个月后统计。结果显示，在0.05～1mg/l的范围内，增殖系数都可以达到3以上；其中当kt浓度为0.5mg/l时，增殖系数最高达到3.4，与其它处理比较，差异显著(表6)；当kt浓度达到2mg/l时，试管苗基部出现愈伤组织，不利于后期生根。筛选0.05～1mg/l为kt适宜浓度，0.5mg/l为kt的最佳浓度。

表6不同kt浓度水平对芽增殖的影响

在ms+zt1.0+kt0.5mg/l培养基的基础上，添加不同浓度的iba，观察iba浓度对秦岭岩白菜增殖的影响，培养一个月后统计。结果显示，iba对秦岭岩白菜试管苗的增殖培养没有明显影响，但对试管苗的伸长生长影响显著。在0.02～0.2mg/l浓度范围内，试管苗高度可以达到1.1～1.8cm，其中当iba浓度为0.1mg/l时，试管苗高度可以达到2cm，健壮整齐(图4)，与其它处理组比较，差异显著(表7)；当浓度达到0.3mg/l时，试管苗出现生根现象，不利于后期统一生根培养。筛选0.02～0.2mg/l为iba的适宜浓度，最佳浓度为0.2mg/l。

表7不同iba浓度水平对芽增殖的影响

实施例3生根培养

生根阶段，采用ms为基础培养基，iba分别设0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0mg/l计6种浓度，添加核黄素2～10mg/l。附加的生长素iba浓度低于2.0mg/l时，生根率随浓度的增加而增加，产生不定根的时间随浓度的增加而缩短，当超过这一域值时，生根率开始下降，同时产生少量愈伤组织。在0.5～2.0mg/l浓度范围内，培养15d左右幼苗基部分化出根原基，30d后可以长至2～4cm，生根率达到65％以上，叶色浓绿舒展，形成了完整的试管苗。筛选0.5～2.0mg/l为秦岭岩白菜生根的适宜浓度，其中iba为1.0mg/l时，生根率达到最高90％(图5)，与其它处理相比较，差异显著(表8)。切割不定芽进行诱根培养时，基部要切除干净，切口平整，保留2对叶片。

表8不同激素及不同激素水平对生根的影响

实施例4试管苗移栽

根系长至0.5cm左右时，选择根系发达生长健壮的无菌苗，室内开瓶炼苗3d，取出后洗净根部琼脂，移栽入珍珠岩:草炭土:泥炭＝2:1:2的混合基质中，该混合基质，通气、保水、保肥性好、营养充足。秦岭岩白菜试管苗在温室中驯化45d后，即可移栽室外，给予肥水管理。在4月份或者10月份移栽，成活率最高可达85％(图6)。实施例5试管苗标准化生产

通过研究探索，建立了秦岭岩白菜离体培养体系，并开始移交工厂进行试管苗标准化生产，生产已经历时一年，实现了以下技术指标：(1)繁殖系数3.0～3.5；(2)组培苗生根率85％以上；(3)移栽成活率75％。(4)无变异植株。目前生产了株性一致的秦岭岩白菜20000株，并将持续生产。

上述实施方式，旨在举例说明本发明可为本领域专业技术人员实现或使用，故本发明包括但不限于上述实施方式，任何符合本发明权利要求书或说明书描述，均落入本发明的保护范围内。

本发明组织培养快速繁殖秦岭岩白菜成苗的方法，不仅比种子和根茎速度快，繁殖系数高，而且不受季节气候限制，可周年生产，随时满足生产用苗，保护了该濒危物种。进一步的，本发明结合人工诱变和转基因技术，可创造新种质，为秦岭岩白菜新品种培育奠定基础。