本发明属于甘薯组织培养技术领域，涉及一种甘薯组织培养外植体的灭菌方法。
背景技术：
甘薯是无性繁殖的块根作物，常规种质资源繁殖、保存和交换等主要通过甘薯块根进行。但因薯块不耐藏、体积大、不易运输等缺点，通过薯块进行保存和交换材料存在诸多弊端。随着植物组织培养技术日趋成熟，采用组织培养方式可在短时间内快速扩繁大量种苗，且不受季节和环境等因素的约束，实践证明，每茎段每月可扩繁5倍，一年可繁殖58～510。
在外植体选择上，理论上植株所有器官均可作为组织培养外植体，目前甘薯组织培养外植体主要是茎尖。外植体灭菌主要利用氯化汞和酒精，具体方法是外植体用清水洗净后，先用75％乙醇灭菌30s，然后用0.1％氯化汞(HgCl)灭菌10min，最后用无菌水冲洗4～5次。该方法虽灭菌效果好，但灭菌过程繁琐，且消毒液升汞含重金属离子，大部分实验室升汞消毒液不经处理直接填埋或排入下水管道，对地下水和环境造成严重汞污染。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种安全且高效的甘薯组织培养外植体的灭菌方法。该方法利用NaClO和浓盐酸反应获得Cl2的方法对甘薯组织培养外植体表面进行灭菌。5min可对上百个株系灭菌处理，灭菌效果高、效率高。
实现本发明目的的技术方案如下：
甘薯组织培养外植体的灭菌方法，采用氯气对甘薯组织培养外植体进行表面灭菌。
在具体实施例中，本发明利用NaClO溶液和浓盐酸反应所得Cl2对甘薯组织培养外植体进行表面灭菌。
所述的甘薯组织培养外植体可以是甘薯茎段。
为提高灭菌效率，采用浓度为0.33～1.3mol/m3的Cl2对甘薯组织培养外植体表面进行灭菌，优选Cl2浓度为0.66～1.3mol/m3。
为获得较好的处理效果，采用Cl2灭菌外植体的时间分别为1～10min，优选为
5～10min。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明采用NaClO和浓盐酸反应获得Cl2的方法对甘薯茎段外植体进行灭菌，可同时对大量不同的外植体材料一次性灭菌，灭菌耗时短，过程简便，不需无菌水进行冲洗，灭菌效率高。灭菌后外植体5d左右即可生根发芽，茎段再生率100％。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面通过实施例，对本发明进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的范围。
下述实施方式中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施方式中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
甘薯品种为江苏徐州甘薯研究中心选育的高花青素甘薯新品种徐紫薯8号。试验地点为江苏徐州农业部甘薯生物学与遗传育种重点实验室。
本发明所提供的药剂为通过商业途径获得。NaClO采购于上海生工，每100ml含有5.68g活性氯，换算NaClO摩尔浓度为1.6mol/L。浓盐酸采购于上海生工，浓度为12mol/L。
实施例1
1.甘薯茎段外植体灭菌处理
试验于江苏徐州农业部甘薯生物学与遗传育种重点实验室。从甘薯中心试验基地剪取徐紫薯8号植株，去除叶片、洗净表面灰尘后备用。将待用植株茎剪成分别含2个节间的茎段，长度约4cm。将茎段放入5ml离心管中，每个离心管放3个茎段。将所有离心管分别放入试管架中，每个试管架放置5个离心管。
取带盖塑料泡沫盒24个，泡沫盒规格长30cm，宽20cm，高20cm，容器体积0.012m3。将放置外植体的试管架放入泡沫盒中。准备小烧杯，按表1分别加入NaClO和浓盐酸。加入方法：先将NaClO倒入烧杯然后放入泡沫盒中，吸取相应体积浓盐酸加入装有NaClO小烧杯中，迅速盖上泡沫盒盖子。各个浓度处理灭菌时间分别为：1min，5min，10min，30min，60min，120min。灭菌结束后将离心管盖上盖子并取出。所有操作均在生物安全柜中进行。
表1获得不同浓度Cl2所需NaClO和浓盐酸体积
2.外植体灭菌效果和再生率统计
将不同浓度和处理时间的甘薯茎段外植体直接转入MS培养基中，统计外植体灭菌效果和再生率。结果表明，0.66mol/m3Cl2灭菌10min或1.3mol/m3Cl2灭菌5min，灭菌率可达100％，茎段3-5d左右即可生根、发芽，灭菌时间高于30min外植体茎段出现褐化，生根和发芽明显减慢。当Cl2浓度为2.6mol/m3时，灭菌10min甘薯茎段即出现褐化，转入MS培养基后茎段8d左右才开始生根，说明高浓度Cl2抑制了外植体的萌芽和生根。以上结果表明，Cl2浓度1.3mol/m3，处理时间5min是最佳的灭菌参数。
表2不同浓度Cl2处理后外植体灭菌率和再生率统计