本发明涉及组织培养
技术领域：
，具体涉及一种番茄组培用诱导培养基及组织培养方法和应用。
背景技术：
：番茄红素是植物中所含的一种天然色素。主要存在于茄科植物西红柿的成熟果实中。它是目前在自然界的植物中被发现的最强抗氧化剂之一。番茄红素清除自由基的功效远胜于其他类胡萝卜素和维生素E，其淬灭单线态氧速率常数是维生素E的100倍。它可以有效的防治因衰老，免疫力下降引起的各种疾病，因此备受关注。番茄红素是衡量番茄品质优劣的一项重要指标。目前番茄温室种植是提高番茄产量的重要措施。然而由于温室蔬菜生产主要依靠肥水的大量投入来提高产量，不仅造成水资源和肥料的浪费，还导致蔬菜发病率高，品质下降。同时，少施或不施有机肥、偏施氮肥、重施磷肥、少施或不施钾肥的现象也比较普遍，这种长期高氮、富磷、少钾的营养状况，导致养分供应失调，已成为限制当前温室番茄品质提高的主要因素之一。目前对于提高番茄中番茄红素含量的方法多集中在氮磷钾及水分的合理供应上，但并没有从组培方向上对番茄组培苗进行诱导，进而提高番茄组培苗生产番茄中番茄红素含量的方法。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供了一种番茄组培用诱导培养基及组织培养方法和应用。在番茄组培阶段对番茄进行诱导，得到能够生产高番茄红素含量的番茄组培苗，提升番茄中的番茄红素含量及番茄品质。本发明的技术方案如下：本发明提供了一种番茄组培用诱导培养基，所述诱导培养基以MS基本培养基为基础，还含有3-吲哚乙酸0.02~0.05mg/L，6-苄氨基腺嘌呤0.5~1.5mg/L，茉莉酸甲酯1.5~3.7mg/L，聚乙烯吡咯烷酮5~10mg/L，琼脂5~8g/L，蔗糖30~40g/L。优选的，所述诱导培养基的pH值为5.5~6.5。本发明还提供一种番茄组织培养的方法，包括以下步骤：将番茄外植体接种于诱导愈伤组织和不定芽形成的上述任意一种技术方案所述诱导培养基中进行诱导培养，获得番茄不定芽；所述不定芽再转入生根培养基中培养，生根后得到番茄组培苗。优选的，所述生根培养基以MS基本培养基为基础，还包括吲哚丁酸0.8~1.2mg/L，琼脂5~10g/L，蔗糖30~40g/L。优选的，所述番茄外植体为番茄叶子或茎段。优选的，所述组织培养的条件为：温度25℃±2℃、光照强度1500~3200lux，光周期为12~18h光照/12~6h暗。优选的，所述番茄组培苗的长度不低于20cm。本发明还包括上述任意一项所述方法得到的番茄组培苗在生产高含量番茄红素番茄中的应用，其特征在于，将番茄组培苗置于改良的MS液体培养基中进行培养，直至番茄结果，成熟；所述改良的MS液体培养基中还包括30~40g/L的蔗糖。优选的，待番茄在液体培养基中长至形成花苞时，在所述液体培养基中加入茉莉酸甲酯和甘露醇，使茉莉酸甲酯在液体培养基中的终浓度为2.5~4.7mg/L，甘露醇的终浓度为0.3~1.0g/L，继续培养。进一步优选的，所述液体培养基中还通有空气。相对于现有技术，本发明具有以下优点：本发明提供了一种番茄组培用诱导培养基，所述诱导培养基以MS基本培养基为基础，还含有3-吲哚乙酸0.02~0.05mg/L，6-苄氨基腺嘌呤0.5~1.5mg/L，茉莉酸甲酯1.5~3.7mg/L，聚乙烯吡咯烷酮5~10mg/L，琼脂5~8g/L，蔗糖30~40g/L。本发明在诱导培养基中加入了茉莉酸甲酯和聚乙烯吡咯烷酮。茉莉酸甲酯起到调节番茄生长代谢的作用，调节植株体内水分平衡，促进番茄外植体的组织分化，激发番茄基因中番茄红素的表达。作为一种合成水溶性高分子化合物，聚乙烯吡咯烷酮具有优异的生理相容性，能够协同激发茉莉酸甲酯对番茄生长的调节作用，进一步促进番茄组培中组织的分化，全面激发番茄组培组织中番茄红素基因的表达，提高番茄组培苗生产高含量番茄红素番茄的能力。本发明还提供了一种利用上述诱导培养基进行番茄组织培养的方法。将番茄外植体接种于诱导愈伤组织和不定芽形成的所述诱导培养基中进行诱导培养，获得番茄不定芽；所述不定芽再转入生根培养基中培养，生根后得到番茄组培苗。得到的番茄组培苗具有生产高含量番茄红素番茄的能力，是一种高品质的番茄组培苗。本发明将上述番茄组培苗置于改良的MS液体培养基中进行培养，直至番茄结果，成熟。收获的番茄品质高，番茄红素含量要高于常规番茄组培苗。作为进一步优选的技术方案，本发明在番茄生长至形成花苞时，在液体培养基中加入茉莉酸甲酯和甘露醇，进一步诱导番茄开花结果，促进番茄果实成熟，提高收获期番茄内的番茄红素含量。茉莉酸甲酯起到调节番茄生长代谢，增强光合作用，提高番茄植株对水、肥的吸收，调节植株体内水分平衡的作用，激发番茄基因中番茄红素的表达。甘露醇能够协同激发茉莉酸甲酯对番茄的调节作用，进一步促进番茄中番茄红素的表达，提高番茄中番茄红素的含量。具体实施方式本发明提供了一种番茄组培用诱导培养基，所述诱导培养基以MS基本培养基为基础，含有3-吲哚乙酸0.02~0.05mg/L，6-苄氨基腺嘌呤0.5~1.5mg/L，茉莉酸甲酯1.5~3.7mg/L，聚乙烯吡咯烷酮5~10mg/L，琼脂5~8g/L，蔗糖30~40g/L。本发明所述番茄组培用诱导培养基中，3-吲哚乙酸用于刺激番茄形成层细胞分裂，刺激番茄芽或茎的细胞伸长。优选3-吲哚乙酸在MS基本培养基中的质量浓度为0.03~0.04mg/L。本发明所述番茄组培用诱导培养基中，6-苄氨基腺嘌呤促进番茄细胞生长，具有抑制叶绿素的降解，提高氨基酸的含量，延缓叶片衰老等作用。优选6-苄氨基腺嘌呤在MS基本培养基中的质量浓度为0.8~1.2mg/L。本发明所述番茄组培用诱导培养基中，茉莉酸甲酯起到调节番茄生长代谢的作用，调节植株体内水分平衡，促进番茄外植体的组织分化，激发番茄基因中番茄红素的表达。本发明中，优选茉莉酸甲酯在MS基本培养基中的质量浓度为2.0~3.0mg/L。本发明所述番茄组培用诱导培养基中，还添加有聚乙烯吡咯烷酮。作为一种合成水溶性高分子化合物，聚乙烯吡咯烷酮具有优异的生理相容性，能够协同激发茉莉酸甲酯对番茄生长的调节作用，进一步促进番茄组培中组织的分化，全面激发番茄组培组织中番茄红素基因的表达，提高番茄组培苗生产高含量番茄红素番茄的能力。同时还有助于3-吲哚乙酸和6-苄氨基腺嘌呤作用的发挥，提高番茄组培苗的分化能力。本发明中，优选聚乙烯吡咯烷酮在MS基本培养基中的质量浓度为6.0~8.0mg/L。本发明所述番茄组培用诱导培养基中，还添加有一定量的琼脂，优选琼脂在MS基本培养基中的质量浓度为6~7g/L。本发明所述番茄组培用诱导培养基中，还添加有蔗糖，为番茄组织分化提供原料及营养补充，提高番茄组织分化的效率。本发明中，优选所述番茄在MS基本培养基中的质量浓度为32~37g/L。本发明所述番茄组培用诱导培养基的pH值优选为5.8~6.2。本发明还提供了利用上述诱导培养基的番茄组织培养方法，包括以下步骤：将番茄外植体接种于诱导愈伤组织和不定芽形成的上述诱导培养基中进行诱导培养，获得番茄不定芽；所述不定芽再转入生根培养基中培养，生根后得到番茄组培苗。本发明对番茄外植体的种类没有特殊限定，可以为番茄种子、番茄植株任意部分的组织或器官。本发明对番茄的品种类型没有特殊限定，采用本领域中存在的任何番茄品种均可。本发明优选以番茄叶子或茎段作为外植体进行组织培养。本发明番茄外植体优选为1cm×1cm的番茄叶片或番茄茎段。本发明优选先对番茄外植体进行消毒。本发明对番茄外植体消毒的方式没有特殊限定，采用本领域中的常规消毒方式即可，如升汞、酒精或次氯酸消毒。本领域技术人员可以根据消毒效果对浸泡时间或冲洗次数或消毒液浓度进行适当调整，得到无菌的番茄外植体。本发明将番茄不定芽转入生根培养基中进行生根培养，优选所述生根培养基以MS基本培养基为基础，还包括吲哚丁酸0.8~1.2mg/L，琼脂5~10g/L，蔗糖30~40g/L，进一步优选包括吲哚丁酸0.9~1.0mg/L，琼脂6~8g/L，蔗糖32~36g/L。当生根培养得到的番茄组培苗根长长于10cm，优选为15~25cm时，即得到高产番茄红素含量的番茄组培苗。本发明的番茄组织培养过程中，对培养基的配制方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的培养基配制方法进行配制。本发明所述番茄组培苗的培养过程优选在组织培养室内进行，所述组织培养室的温度优选为23~27℃，更优选为24~26℃；所述组织培养室的湿度优选为40~60%；光照强度优选为1500Lx~3200Lx，更优选为2000Lx~2500Lx；光照时间为每天12~18h，更优选为13~16h。所述组织培养愈伤组织阶段为暗培养。本发明所述番茄组培苗栽培生产番茄，可以采用常规陆地栽培，也可以无土栽培，或水培。由于水培环境与番茄组培苗生长环境相似，因此不需要缓苗过程即可直接进行栽培，避免了因环境的改变而造成成活率低。且水培过程中营养因素可控，易调节，根部吸收效果好，有利于番茄的生长。因此，在本发明具体实施例中，优选采用水培方式对番茄组培苗进行栽培，生产高番茄红素含量的番茄。本发明提供了上述番茄组培苗在生产高含量番茄红素番茄中的应用，包括以下步骤：将上述技术方案所述番茄组培苗置于改良的MS液体培养基中进行培养，直至番茄结果，成熟；所述改良的MS液体培养基中还包括30~40g/L的蔗糖。作为优选的技术方案，本发明待番茄在液体培养基中长至形成花苞时，在所述液体培养基中加入茉莉酸甲酯和甘露醇，使茉莉酸甲酯在液体培养基中的终浓度为2.5~4.7mg/L，优选为3.0~4.0mg/L，甘露醇的终浓度为0.3~1.0g/L，优选为0.5~0.8g/L，继续培养至番茄结果，成熟，番茄中的番茄红素含量高。茉莉酸甲酯起到调节番茄生长代谢的作用，促进番茄开花结果，提高番茄成熟时番茄红素的含量。甘露醇协同激发茉莉酸甲酯对番茄的调节促进作用，提高番茄的生长品质。本发明优选采用番茄组培苗进行水培。组培苗脱去了番茄种子或外植体中携带的病毒，且根系发达，有利于养分的吸收，提高番茄的生长速率。本发明将番茄组培苗直接置于液体培养基中进行培养，可有效保持培养环境的一致性，避免了苗圃种植前的炼苗过程，有利于番茄的快速生长，提高成活率。本发明优选番茄组培苗的根长不短于10cm，更优选为15~25cm。本发明的液体培养基优选为改良的MS液体培养基，所述改良的液体培养基为在MS液体培养基中加入蔗糖，使其终浓度为30~40g/L，更优选为32~37g/L。蔗糖的加入有利于在番茄体内积累番茄红素的前体活性物质，为番茄红素的转换提供物质基础。本发明所述改良的MS液体培养基的pH值优选为6.0~7.5，更优选为6.5~7.0。本发明所述番茄组培苗在液体培养基中培养的温度优选为23~30℃，更优选为25~27℃，光周期优选为12~18小时/天，更优选为14~16小时/天。为了保证番茄在液体培养基中的生长效率，本发明优选在液体培养基中通入空气，提高番茄根部的氧气含量，增加根系对液体培养基中的营养吸收，提高生长效率。待番茄生长至结果成熟时，测定番茄中的番茄红素含量。本发明优选用分光光度法测定本发明栽培方法番茄中番茄红素的含量。结果表明，本发明的方法能够显著提高番茄的番茄红素含量，大大提高栽培番茄的生长品质。下面将结合本发明中的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1：培养番茄组培苗番茄组织培养过程在培养室中进行。设置组织培养室培养温度为25℃，湿度为50%，光照强度为2000Lx，16小时的光周期，8小时的暗周期。按照下面配方配制培养基：诱导培养基：MS基本培养基+3-吲哚乙酸0.04mg/L+6-苄氨基腺嘌呤1.0mg/L+茉莉酸甲酯1.5mg/L+聚乙烯吡咯烷酮5mg/L+琼脂5g/L+蔗糖30g/L；pH值为6.0；生根培养基：MS基本培养基+吲哚丁酸0.8mg/L+琼脂5g/L+蔗糖30g/L。将京丹1号番茄的叶片作为外植体，自来水下彻底冲洗，然后放在5％的吐温-20中浸泡5分钟，用灭菌蒸馏水漂洗3-4次，0.1％升汞(HgCl2)表面灭菌4分钟，用灭菌蒸馏水漂洗4-5次。将叶片组织剪成大小为1cm×1cm左右作为外植体，接种到诱导培养基中进行培养。5天后长出愈伤组织，继续培养，7天时，愈伤组织分化为不定芽。将不定芽接种到转入生根培养基中培养，待番茄组培苗根长至10cm以上时，结束培养。实施例2培养番茄组培苗番茄组织培养过程在培养室中进行。设置组织培养室培养温度为24℃，湿度为55%，光照强度为2500Lx，15小时的光周期，9小时的暗周期。按照下面配方配制培养基：诱导培养基：MS基本培养基+3-吲哚乙酸0.05mg/L+6-苄氨基腺嘌呤1.5mg/L+茉莉酸甲酯2.5mg/L+聚乙烯吡咯烷酮8mg/L+琼脂7g/L+蔗糖35g/L，pH值为5.5；生根培养基：MS基本培养基+吲哚丁酸1.0mg/L+琼脂8g/L+蔗糖35g/L。将京丹1号番茄的叶片作为外植体，自来水下彻底冲洗，然后放在5％的吐温-20中浸泡6分钟，用灭菌蒸馏水漂洗3-4次，0.1％升汞(HgCl2)表面灭菌4分钟，用灭菌蒸馏水漂洗4-5次。将叶片组织剪成大小为1cm×1cm左右作为外植体，接种到诱导培养基中进行培养。5天后长出愈伤组织，继续培养，7天时，愈伤组织分化为不定芽。将不定芽接种到转入生根培养基中培养，待番茄组培苗根长至10cm以上时，结束培养。实施例3培养番茄组培苗番茄组织培养过程在培养室中进行。设置组织培养室培养温度为26℃，湿度为60%，光照强度为3000Lx，14小时的光周期，10小时的暗周期。按照下面配方配制培养基：诱导培养基：MS基本培养基+3-吲哚乙酸0.02mg/L+6-苄氨基腺嘌呤0.8mg/L+茉莉酸甲酯3.7mg/L+聚乙烯吡咯烷酮10mg/L+琼脂8g/L+蔗糖40g/L，pH值为6.5；生根培养基：MS基本培养基+吲哚丁酸1.2mg/L+琼脂10g/L+蔗糖40g/L。将京丹1号番茄的叶片作为外植体，自来水下彻底冲洗，然后放在5％的吐温-20中浸泡8分钟，用灭菌蒸馏水漂洗3-4次，0.1％升汞(HgCl2)表面灭菌4分钟，用灭菌蒸馏水漂洗4-5次。将叶片组织剪成大小为1cm×1cm左右作为外植体，接种到诱导培养基中进行培养。5天后长出愈伤组织，继续培养，7天时，愈伤组织分化为不定芽。将不定芽接种到转入生根培养基中培养，待番茄组培苗根长至10cm以上时，结束培养。对比例1诱导培养基中不含有茉莉酸甲酯和聚乙烯吡咯烷酮，其余方法和步骤同实施例1。实施例4将实施例1~3及对比例1培养得到的番茄组培苗置于含有35g/L蔗糖的MS培养基中进行培养。控制培养温度为26℃，湿度为50%，光周期为16h光照/8h黑暗，并在液体培养基中通入空气。直至番茄果实成熟。记录番茄不同生理期的天数。结果见表1。表1番茄不同生理期天数花苞开花果实转色果实成熟实施例119385573实施例218375472实施例317365369对比例120406080由表1可以看出，诱导培养基中添加茉莉酸甲酯和聚乙烯吡咯烷酮能够提高番茄的生长速度，番茄现蕾及开花的时间提前，且果实转色和成熟期的时间明显缩短。说明本发明诱导培养基培养得到的番茄组培苗具有早熟特征。检测实施例1~3及对比例1的成熟番茄中番茄红素含量：将新鲜番茄清洗后，切块捣碎得到番茄糊。取3个150mL的碘量瓶，各加入20g番茄糊和20mL香油，封口、避光，于室温下萃取4h，得到萃取液。取萃取液2mL，用无水乙醚定容至50mL，以香油作参比，于502nm处测定吸光度。结果见表2。表2番茄萃取液在502nm下的吸光度值实施例吸光度实施例10.158*实施例20.162*实施例30.174**对比例10.132由于吸光度与番茄红素的含量呈正比例关系，本发明中根据番茄萃取液中的吸光度大小确定番茄红素的含量多少。由表2可以看出，本发明在诱导培养基中添加了茉莉酸甲酯和聚乙烯吡咯烷酮，得到的番茄组培苗栽培出的番茄中番茄红素的含量明显增加，且随着茉莉酸甲酯和聚乙烯吡咯烷酮浓度的提高，番茄红素的含量也增加。说明茉莉酸甲酯和聚乙烯吡咯烷酮对番茄组培苗的诱导作用与浓度有一定关系，在一定范围内，随着浓度的提高，对番茄品质的提升作用增加。实施例5将实施例1的番茄组培苗置于含有35g/L蔗糖的MS培养基中进行培养。控制培养温度为26℃，湿度为50%，光周期为16h，并在液体培养基中通入空气。直至番茄果实成熟。番茄19天形成花苞，第38天开花，55天果实转色，73天果实成熟。实施例6将实施例1的番茄组培苗置于含有35g/L蔗糖的MS培养基中进行培养。控制培养温度为26℃，湿度为50%，光周期为16h，并在液体培养基中通入空气。待番茄形成花苞时，在液体培养基中加入茉莉酸甲酯和甘露醇，使茉莉酸甲酯在液体培养基中的终浓度为4.5mg/L，甘露醇的终浓度为0.8g/L，继续培养。番茄16天形成花苞，第35天开花，51天果实转色，67天果实成熟。实施例7将实施例1的番茄组培苗置于含有30g/L蔗糖的MS培养基中进行培养。控制培养温度为28℃，湿度为40%，光周期为14h，并在液体培养基中通入空气。待番茄形成花苞时，在液体培养基中加入茉莉酸甲酯和甘露醇，使茉莉酸甲酯在液体培养基中的终浓度为4.0mg/L，甘露醇的终浓度为0.3g/L，继续培养。番茄17天形成花苞，第36天开花，52天果实转色，69天果实成熟。实施例8将实施例1的番茄组培苗置于含有40g/L蔗糖的MS培养基中进行培养。控制培养温度为25℃，湿度为60%，光周期为12h，并在液体培养基中通入空气。待番茄形成花苞时，在液体培养基中加入茉莉酸甲酯和甘露醇，使茉莉酸甲酯在液体培养基中的终浓度为3.0mg/L，甘露醇的终浓度为1.0g/L，继续培养。番茄18天形成花苞，第37天开花，53天果实转色，71天果实成熟。对比例2将实施例1的番茄组培苗置于含有35g/L蔗糖的MS培养基中进行培养。控制培养温度为26℃，湿度为50%，光周期为16h，并在液体培养基中通入空气。待番茄形成花苞时，在液体培养基中加入茉莉酸甲酯，使茉莉酸甲酯在液体培养基中的终浓度为4.5mg/L，继续培养。番茄17天形成花苞，第36天开花，52天果实转色，69天果实成熟。对比例3将实施例1的番茄组培苗置于含有35g/L蔗糖的MS培养基中进行培养。控制培养温度为26℃，湿度为50%，光周期为16h，并在液体培养基中通入空气。待番茄形成花苞时，在液体培养基中加入甘露醇，使甘露醇在液体培养基中的终浓度为0.8g/L，继续培养。番茄19天形成花苞，第38天开花，54天果实转色，73天果实成熟。通过实施例4~5及对比例2~3，说明茉莉酸甲酯能够调节番茄的生长速率，缩短番茄的开花结果时间，加快番茄成熟，且与茉莉酸甲酯浓度有一定关系；甘露醇能够协同激活茉莉酸甲酯对番茄的生长调节能力，提高番茄生长品质。实施例5采用实施例4的方法检测实施例5及对比例2~4的成熟番茄中番茄红素含量。结果见下表：表3不同处理番茄提取得到的萃取液在502nm下的吸光度值实施例处理吸光度实施例4常规液体培养0.158实施例5茉莉酸甲酯+甘露醇0.216**对比例2茉莉酸甲酯0.194*对比例3甘露醇0.159由表3可以看出，在液体培养基中加入甘露醇处理与不加甘露醇对收获番茄中的番茄红素含量影响不大，两者没有显著差异。在番茄的液体培养基中加入茉莉酸甲酯，能够显著提高番茄中番茄红素的含量。用含有茉莉酸甲酯和甘露醇的液体培养基栽培番茄后，得到的番茄红番茄红素含量最高，显著高于单独茉莉酸甲酯处理得到的番茄中番茄红素含量。说明本发明的番茄组培苗自花苞期开始在液体培养基中加入茉莉酸甲酯和甘露醇，能够进一步调节番茄的生长性能，提高收获番茄中的番茄素含量，进而提高番茄品质。上述实施方式旨在举例说明本发明可为本领域专业技术人员实现或使用，对上述实施方式进行修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，故本发明包括但不限于上述实施方式，任何符合本权利要求书或说明书描述，符合与本文所公开的原理和新颖性、创造性特点的方法、工艺、产品，均落入本发明的保护范围之内。当前第1页1 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