本发明涉及植物组织培养领域，具体地说是涉及一种促进马铃薯幼苗壮根的植物组织培养方法。
背景技术：
：植物组织培养技术是20世纪初发展起来的技术，是指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞、原生质体等在合适的条件进行离体培养，诱导产生愈伤组织、不定芽等，之后形成完整植株的过程。组织培养技术因其具有可以利用各种人工培养条件控制细胞的生长、分化等优点，有力地推动了植物生理学、病理学、药学、遗传学、育种以及生物化学等学科的交叉发展，并广泛应用于农业、林业、园艺、工业、医药业等多种行业，产生巨大的经济效益和社会效益，归纳起来，有以下几个方面：1、苗木的离体快繁；2、培育脱毒苗；3、应用于植物育种如单倍体育种、原生质体融合、胚和胚乳的培养基转基因育种等；4、生产次生代谢产物如中药成分等；5、人工种子和种质保存；6、基因功能研究等。马铃薯是一种分布广泛，适应性强、产量高、营养丰富的宜粮、宜菜、宜饲、宜做工业原料的高产经济作物，也是世界十大营养食品之一。马铃薯中含有蛋白质、碳水化合物、脂肪、钙、磷、锌、铁、硫胺素、核苷酸、维生素等。而且其含有丰富的氨基酸，备受当代营养食品发展的重视。此外，马铃薯还含有碳水化合物、脂肪、糖类、粗纤维、灰分和各种维生素等营养素，这些营养素对人体是不可缺少的物质。目前以马铃薯叶片、茎段、叶柄、根等多种外植体进行的再生植株培养，均采用多步成苗培养。而现在马铃薯的大田栽培主要是采用块茎繁殖，块茎繁殖有着诸多优势，但也存在明显的弊端，即种薯用量大、繁殖系数低和病毒易积累，导致了严重的品质退化。而且组织培养所获得的试管苗往往长势较弱，根系不发达，移栽后成活率低，严重影响试管苗的培养效率和进一步的应用效果。因此，建立一种促进马铃薯细苗壮根的组织培养方法，就显得尤为重要。技术实现要素：为了克服现有技术中存在的问题，本发明提出了一种促进马铃薯幼苗壮根的组织培养方法，该方法以茎尖离体培养，克服了种薯用量大的问题；且本发明优化了初代培养和生根培养的培养基及培养条件，既能使马铃薯生根多、生根快，还能使马铃薯组培苗健壮，更易移栽成活。本发明是通过以下技术方案实现的：一种促进马铃薯幼苗壮根的植物组织培养方法，包括以下步骤：(1)材料采集与消毒：于6月份剪取田间生长旺盛的马铃薯苗顶芽，切去叶片，自来水冲洗40-50min，用无菌滤纸吸干水分，置于超净工作台上用75％酒精浸洗25s，再用0.1％升汞消毒3-6min，最后用无菌水冲洗7-8次，备用；(2)茎尖剥离：在双目解剖镜下，将消毒后的马铃薯顶芽剥去外层叶片，仅留1-2个叶原基；(3)初代培养：将5-6个大小为0.1-0.2mm的茎尖接种在初代培养基上进行培养；所述初代培养基组成为：在1/2MS培养基中添加6-BA、ZT、乙烯利和烯效唑，所述6-BA的终浓度为1.2-2.5mg/L，ZT的终浓度为0.08-0.18mg/L，乙烯利的终浓度为0.2-0.4mg/L，烯效唑的终浓度为0.1-0.2mg/L；(4)生根培养：将步骤(3)中无菌苗按单株接种于生根培养基中进行培养，即得脱毒试管苗；所述生根培养基组成为：MS培养基+0.5～3mg/L土菌消+25～30g/L蔗糖+0.5～1.0mg/L细胞分裂素+4.5～5.5g/L琼脂，pH＝5.5～6.0。进一步地，所述升汞溶液中滴加有吐温80，所述吐温80的终浓度为0.02％。进一步地，所述初代培养的条件为：培养温度为25℃，光照强度2000-3000lx，光照时间12h/d，培养40天。进一步地，所述生根培养的条件为：每天光照12～14h，光照强度为1500～2000LX，培养温度为23～27℃。进一步地，所述初代培养基组成为：在1/2MS培养基中添加6-BA、ZT、乙烯利和烯效唑，所述6-BA的终浓度为1.5-1.8mg/L，ZT的终浓度为0.12-0.15mg/L，乙烯利的终浓度为0.25-0.3mg/L，烯效唑的终浓度为0.16-0.18mg/L。进一步地，所述生根培养基组成为：MS培养基+1.5～2mg/L土菌消+25～30g/L蔗糖+0.7～0.8mg/L细胞分裂素+5～5.2g/L琼脂，pH＝5.5～6.0。与现有技术相比，本发明的有益效果在于：(1)发明提出的一种促进马铃薯幼苗壮根的组织培养方法，该方法以茎尖离体培养，克服了种薯用量大的问题；(2)本发明所采用的预处理和灭菌处理结合，可有效对马铃薯苗顶芽进行消毒，从而有效降低了外植体的污染率，且不会对外植体造成伤害。(3)本发明的初代培养基满足马铃薯在芽段诱导、继代增值、试管微型薯诱导以及生根壮苗等阶段对培养基的要求，对马铃薯芽外植体的诱导率和愈伤组织的分化率、出芽率以及生根效果都有显著的促进作用。(4)本发明的生根培养基既能使马铃薯生根多、生根快，还能使马铃薯组培苗健壮，更易移栽成活。具体实施方式展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。实施例1：一种促进马铃薯幼苗壮根的植物组织培养方法，包括以下步骤：(1)材料采集与消毒：于6月份剪取田间生长旺盛的马铃薯苗顶芽，切去叶片，自来水冲洗40-50min，用无菌滤纸吸干水分，置于超净工作台上用75％酒精浸洗25s，再用0.1％升汞消毒3-6min，最后用无菌水冲洗7-8次，备用；(2)茎尖剥离：在双目解剖镜下，将消毒后的马铃薯顶芽剥去外层叶片，仅留1-2个叶原基；(3)初代培养：将5-6个大小为0.1-0.2mm的茎尖接种在初代培养基上进行培养；其中初代培养基组成为：在1/2MS培养基中添加6-BA、ZT、乙烯利和烯效唑，6-BA的终浓度为1.2mg/L，ZT的终浓度为0.08mg/L，乙烯利的终浓度为0.2mg/L，烯效唑的终浓度为0.1mg/L；初代培养温度为25℃，光照强度2000-3000lx，光照时间12h/d，培养40天。(4)生根培养：将步骤(3)中无菌苗按单株接种于生根培养基中进行培养，即得脱毒试管苗；其中生根培养基组成为：MS培养基+0.5mg/L土菌消+25g/L蔗糖+0.5mg/L细胞分裂素+5g/L琼脂，pH＝5.5～6.0。生根培养的条件为：每天光照12h，光照强度为1500～2000LX，培养温度为23℃。实施例2：一种促进马铃薯幼苗壮根的植物组织培养方法，包括以下步骤：(1)材料采集与消毒：于6月份剪取田间生长旺盛的马铃薯苗顶芽，切去叶片，自来水冲洗40-50min，用无菌滤纸吸干水分，置于超净工作台上用75％酒精浸洗25s，再用0.1％升汞消毒3-6min，最后用无菌水冲洗7-8次，备用；其中升汞溶液中添加2滴吐温80；(2)茎尖剥离：在双目解剖镜下，将消毒后的马铃薯顶芽剥去外层叶片，仅留1-2个叶原基；(3)初代培养：将5-6个大小为0.1-0.2mm的茎尖接种在初代培养基上进行培养；其中初代培养基组成为：在1/2MS培养基中添加6-BA、ZT、乙烯利和烯效唑，6-BA的终浓度为1.5mg/L，ZT的终浓度为0.12mg/L，乙烯利的终浓度为0.25mg/L，烯效唑的终浓度为0.16mg/L；初代培养温度为25℃，光照强度2000-3000lx，光照时间12h/d，培养40天。(4)生根培养：将步骤(3)中无菌苗按单株接种于生根培养基中进行培养，即得脱毒试管苗；其中生根培养基组成为：MS培养基+1.5mg/L土菌消+25g/L蔗糖+0.7mg/L细胞分裂素+5g/L琼脂，pH＝5.8。生根培养的条件为：每天光照12h，光照强度为1500～2000LX，培养温度为25℃。实施例3：一种促进马铃薯幼苗壮根的植物组织培养方法，包括以下步骤：(1)材料采集与消毒：于6月份剪取田间生长旺盛的马铃薯苗顶芽，切去叶片，自来水冲洗40-50min，用无菌滤纸吸干水分，置于超净工作台上用75％酒精浸洗25s，再用0.1％升汞消毒3-6min，最后用无菌水冲洗7-8次，备用；(2)茎尖剥离：在双目解剖镜下，将消毒后的马铃薯顶芽剥去外层叶片，仅留1-2个叶原基；(3)初代培养：将5-6个大小为0.1-0.2mm的茎尖接种在初代培养基上进行培养；其中初代培养基组成为：在1/2MS培养基中添加6-BA、ZT、乙烯利和烯效唑，6-BA的终浓度为1.8mg/L，ZT的终浓度为0.15mg/L，乙烯利的终浓度为0.3mg/L，烯效唑的终浓度为0.18mg/L；初代培养温度为25℃，光照强度2000-3000lx，光照时间12h/d，培养40天。(4)生根培养：将步骤(3)中无菌苗按单株接种于生根培养基中进行培养，即得脱毒试管苗；其中生根培养基组成为：MS培养基+2mg/L土菌消+30g/L蔗糖+0.8mg/L细胞分裂素+5.2g/L琼脂，pH＝5.8。生根培养的条件为：每天光照123，光照强度为1500～2000LX，培养温度为24℃。实施例4：一种促进马铃薯幼苗壮根的植物组织培养方法，包括以下步骤：(1)材料采集与消毒：于6月份剪取田间生长旺盛的马铃薯苗顶芽，切去叶片，自来水冲洗40-50min，用无菌滤纸吸干水分，置于超净工作台上用75％酒精浸洗25s，再用0.1％升汞消毒3-6min，最后用无菌水冲洗7-8次，备用；其中升汞溶液中添加2滴吐温80；(2)茎尖剥离：在双目解剖镜下，将消毒后的马铃薯顶芽剥去外层叶片，仅留1-2个叶原基；(3)初代培养：将5-6个大小为0.1-0.2mm的茎尖接种在初代培养基上进行培养；其中初代培养基组成为：在1/2MS培养基中添加6-BA、ZT、乙烯利和烯效唑，6-BA的终浓度为2.5mg/L，ZT的终浓度为0.18mg/L，乙烯利的终浓度为0.4mg/L，烯效唑的终浓度为0.20mg/L；初代培养温度为25℃，光照强度2000-3000lx，光照时间12h/d，培养40天。(4)生根培养：将步骤(3)中无菌苗按单株接种于生根培养基中进行培养，即得脱毒试管苗；其中生根培养基组成为：MS培养基+3mg/L土菌消+30g/L蔗糖+1.0mg/L细胞分裂素+5.2g/L琼脂，pH＝5.8。生根培养的条件为：每天光照14h，光照强度为1500～2000LX，培养温度为27℃。效果验证1、分化成芽率对上述实施例1、2、3、4的外植体初代培养分化成芽率进行观察统计，结果见表1所示。表1各实施例外植体分化成芽率组别实施例1实施例2实施例3实施例4分化成芽率(％)95.698.698.495.8由表1可知，实施例1-4中外植体的分化成芽率均较高，说明本发明的初代培养基可有效促进外植体诱导分化。同时，可看出实施例2和3中分化成芽率明显高于实施例1和实施例4，说明初代培养基组成中6-BA的终浓度为1.5-1.8mg/L，ZT的终浓度为0.12-0.15mg/L，乙烯利的终浓度为0.25-0.3mg/L，烯效唑的终浓度为0.16-0.18mg/L时，外植体诱导分化效果更好。2、生根率对上述实施例1-4经过继代增殖培养获得的无菌苗进行7d的生根培养的生根情况进行观察统计，结果见表2所示。表2各实施例中无菌苗生根培养的生根情况组别实施例1实施例2实施例3实施例4生根数(％)100100100100生根数(根)6.36.86.96.4根形情况较粗壮粗壮粗壮较粗壮由表2可知，各组无菌苗的生根率均为100％，生根数多且粗壮，说明本发明的生根培养基对无菌苗的生根具有好的促进效果，从而利于提高马铃薯后续定植时的成活率和生长速度。同时，可看出实施例2和3中根形情况明显优于于实施例1和实施例4，说明MS培养基+1.5～2mg/L土菌消+25～30g/L蔗糖+0.7～0.8mg/L细胞分裂素+5～5.2g/L琼脂对无菌苗的促生根及壮根效果更好。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3