一种快速扩繁三七愈伤组织的培养体系和培养方法与流程

本发明属于组织培养技术领域，具体地说，涉及一种快速扩繁三七愈伤组织的培养体系和培养方法。

背景技术

三七，又名田七，享有“金不换”、“南国神草”、“人参之王”等美誉，为五加科人参属植物三七的根及根茎，具有止血散瘀等功效，是我国特有的名贵中药材。

三七主要的化学成分包括皂苷类成分和非皂苷类成分两大类，皂苷类成分主要为达玛型四环三萜，而非皂苷类成分主要有三七素、蛋白质类、多糖类、黄酮类、炔、醇类、挥发油、微量元素及其一些其他的成分(夏鹏国，张顺仓，梁宗锁，等.三七化学成分的研究历程和概况.中草药，2014，45(17):2564-2570)。三七性甘、微苦，温，具有散瘀止血，消肿定痛的功效，多用于咯血、吐血、便血、崩漏、外伤出血、胸腹刺痛、跌扑肿痛(国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部).北京:中国医药科技出版社，2010:70)。现代药理研究表明三七具有抗炎、抗肿瘤、保护心血管系统(wangz，chenyy，panhj，etal.saponinaccumulationinflowerbudsofpanaxnotoginseng.chineseherbalmedicines，2015(2):179-184)、提高免疫力作用(马岩岩.三七皂甙成分对脂多糖诱导巨噬细胞炎性因子的影响及其机制的研究.暨南大学，2013)、改善血液循环(李媛，李强，姜泽.三七中黄酮类成分的研究进展.齐鲁药事，2012，32(2):109-111)、抑制肝肿瘤细胞转移(陈培丰，刘鲁明，陈震，等.三七醇提液对恶性肿瘤肝转移的干预作用.中西医结合学报，2006，4(5):500-503)等多种药理作用。

三七化学成分种类众多，药理作用广泛，成为云南白药、丹参滴丸、血塞通等中成药的主要原料药。近些年来对三七的开发利用逐渐深入，市场需求量大，三七的市场价值逐渐升高，导致供不应求。同时，人工栽培是满足三七市场需求的主要措施之一，但三七为多年生草本植物，对生态环境具有特殊要求性，生长分布区狭窄，加之连作障碍严重等问题，适宜其栽培的区域锐减。中药材质量主要是活性成分组成及其含量。活性成分多属于植物次生代谢物质，其合成积累受多种因素的影响，包括产地、品种、加工方法、采收期等。

通过愈伤组织培养技术，既可以快速繁殖三七种苗，又可以直接提取次生代谢产物，是解决上述问题的途径之一(黄勇，张铁，张文生，等.三七组织培养研究综述.文山学院学报，2012；25(6)：13-15)。

技术实现要素：

本发明的目的是在无菌条件下，采用幼嫩的外植体，通过调节激素比例，优化三七愈伤组织生长的最佳配方，提供一种快速扩繁三七愈伤组织的培养体系和培养方法。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种快速扩繁三七愈伤组织的培养体系，所述培养体系中仅加入两种激素，分别为2,4-d和kt。

作为优选，所述2,4-d和kt的质量浓度比为(1-4):(0.05-0.5)。

作为优选，所述培养体系中，2,4-d的浓度为1-4mg/l，kt的浓度0.05-0.5mg/l。

进一步优选，所述培养体系中，2,4-d的浓度为2-4mg/l，kt的浓度0.1-0.5mg/l。

更为优选，所述培养体系中，2,4-d的浓度为3mg/l，kt的浓度0.25mg/l。

进一步地，所述培养体系为按照上述浓度加入2,4-d和kt的ms培养基。

第二方面，本发明提供了一种快速扩繁三七愈伤组织的培养方法，采用本发明所提供的培养体系对三七愈伤组织进行培养。

所述三七愈伤组织可根据本领域常规采用的愈伤组织进行，例如，可采用三七的根、茎、叶、花、种子等作为外植体进行愈伤组织的培养。

在本发明的具体实施方式中，以三七的根为外植体进行愈伤组织的培养作为示例性说明。本领域技术人员依据本领域常规技术知识应当知晓，所述愈伤组织并不局限于该外植体。

所述培养方法具体为：

将外植体消毒洗净后，吸干表面的水分，切成2mm的切片，接入到含有上述激素的ms培养基(ph为5.6-6.0，优选5.8)中，培养箱温度为25℃，暗培养。

在本发明所述培养体系和培养方法中：

2,4-d(cas：d-7299)购买自sigma公司，精密称取10mg，先加naoh溶液(1mol/l)溶解后，加10ml水定容，配成1mg/ml溶液，并保存于-20℃冰箱；

kt(cas：k3378)购买自sigma公司，精密称取10mg，先加hcl溶液(1mol/l)溶解后，加10ml水定容，配成1mg/ml溶液，并保存于-20℃冰箱。6-ba(cas：b5478)购买自sigma公司，精密称取10mg，先加hcl溶液(1mol/l)溶解后，加10ml水定容，配成1mg/ml溶液，并保存于-20℃冰箱。

本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。

本发明的有益效果在于：

本发明采用不同浓度的激素比例，从细胞生长量和褐化情况指标确定最佳激素比例，建立一种快速扩繁三七愈伤组织的培养体系和培养方法。

附图说明

图1为实施例1中不同培养体系(配方)对三七愈伤组织生长量的影响；其中：a代表使用配方a；b代表使用配方b；c(1)代表使用配方c(1)；c(2)代表使用配方c(2)。

图2为实施例1中kt浓度为0.25mg/l时，不同浓度2,4-d在一个周期内(18天)对三七愈伤组织生物量的影响。

图3为实施例1中2,4-d浓度为3mg/l时，不同浓度kt在一个周期内(22天)对三七愈伤组织生物量的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

1、试验方法

本实施例采用三七的根作为外植体，筛选出三七最佳的愈伤组织培养配方体系，建立一种三七愈伤组织快速扩繁的方法。

外植体消毒程序：取根部，自来水充分冲洗，清水洗净后用吸水纸吸干表面的水分；后用75％酒精浸泡60s，0.1％hgcl2浸泡15min，用灭菌水冲洗4～5次彻底洗净残留的汞离子；再用吸水纸吸干表面的水分，切成2mm的切片，接入到不同比例激素的ms培养皿中。培养皿ph为5.8，培养箱温度为25℃，暗培养。

本实施例采用3种配方，比较不同激素比例下的三七愈伤组织生长量：

配方a(ms+2,4-d1mg/l+kt0.2mg/l+6-ba0.2mg/l)和配方b(ms+2,4-d2mg/l+6-ba0.5mg/l)为文献报道的配方(李云芳.三七细胞及毛状根液体培养的研究，大连工业大学，2014.潘妍.三七毛状根的诱导及液体培养技术，大连工业大学，2015)。

配方c(ms+ktxmg/l+2,4-dymg/l)为本发明提供的优化培养体系：(1)当kt浓度为x＝0.25mg/l时，2,4-d浓度(y)分别为1、2、3、4mg/l；(2)当2,4-d浓度为y＝3mg/l时，kt浓度(x)分别为0.05、0.1、0.25、0.5mg/l。

2、试验结果

2.1不同激素比例的配方比较

结果表明，不同激素比例配方对三七组织出愈和生长的影响不同(图1)。a配方诱导的愈伤组织出愈较慢，出愈时间长达2-3个月，且愈伤组织呈疙瘩状，不利于后续继代培养。b配方诱导的愈伤组织较a配方出愈快，出愈时间仅1个月，愈伤呈颗粒状，但褐化情况较严重，后期生长缓慢。c配方：(1)当kt浓度为x＝0.25mg/l时，2,4-d(y)浓度分别为1、2、3、4mg/l；(2)当2,4-d浓度为y＝3mg/l时，kt浓度分别为(x)0.05、0.1、0.25、0.5mg/l。c中两个配方诱导的愈伤组织出愈快，生长旺盛，出愈时间仅1个月，愈伤组织呈现颗粒状、结构疏松、且无褐化情况。

2.2kt浓度为0.25mg/l与不同浓度2,4-d组合对三七愈伤组织生物量的影响

文献已报道的b配方中(ms+2,4-d2mg/l+6-ba0.5mg/l)，三七愈伤组织褐化，生长缓慢。一个周期内(22天)愈伤组织的生物量为4.465g(三次生物量重复分别为4.520g，4.098g和4.776g)。c配方未出现褐化，在我们试验中，优化c配方，建立三七愈伤组织快速繁殖的体系。kt浓度为0.25mg/l时，不同浓度2,4-d对在一个周期内(18天)生物量的影响不同(图2)。当2,4-d浓度为1.00mg/l时，生物量最低，为4.731g；2,4-d浓度为2.00mg/l时，生物量增加，为6.478g；2,4-d浓度为3.00mg/l时，生物量最大，为8.912g；2,4-d浓度为4.00mg/l时，生物量减小，为6.422g。结果表明，2,4-d与kt激素配方的最佳浓度为3.00mg/l+0.25mg/l，三七愈伤组织增长较快。

kt与2,4-d不同浓度比例对细胞生长量的影响如表1所示，2,4-d浓度为1.00mg/l时，生物量三次重复为：4.594,4.855,4.731g；2,4-d浓度为2.00mg/l时，生物量三次重复为：5.588,6.893,6.954g；2,4-d浓度为3.00mg/l时，生物量三次重复为：9.194,8.546,8.997g；2,4-d浓度为3.00mg/l时，生物量三次重复为：6.066,6.531,6.669g。

表1kt与2,4-d不同浓度比例对细胞生长量的影响

2.32,4-d浓度为3mg/l与不同浓度kt组合对三七愈伤组织生物量的影响

在上述4.2.3结果基础之上，我们采用2,4-d浓度为3mg/l时，分析不同浓度kt在一个周期内(22天)对三七愈伤组织生物量的影响(图3)。当kt浓度为0.05mg/l时，生物量最低，为5.163g；kt浓度为0.1mg/l时，生物量增加，为7.598g；kt浓度为0.25mg/l时，生物量最大，为11.430g；kt浓度为0.5mg/l时，生物量减小，为7.426g。结果表明，2,4-d与kt激素浓度最佳浓度为3mg/l+0.25mg/l，三七愈伤组织生长速度最快。

2,4-d与kt不同浓度比例对细胞生长量的影响如表2所示，kt浓度为0.05mg/l时，生物量三次重复为：5.178,5.387,4.923g；kt浓度为0.1mg/l时，生物量三次重复为：7.778，7.902，7.114g；kt浓度为0.25mg/l时，生物量三次重复为：11.636,10.063，12.023g；kt浓度为0.5mg/l时，生物量三次重复为：7.978,7.234，7.065g。

表22,4-d与kt不同浓度比例对细胞生长量的影响

3、结论

数据表明：本发明中一种三七愈伤组织快速生长的配方体系为：ms+2,4-d3mg/l+kt0.25mg/l。该体系中最佳激素比例为：2,4-d3mg/l+kt0.25mg/l，该配方体系下，三七愈伤外观健康无褐化，生长速度快，一个周期22天愈伤组织生物量为11.430g。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。