专利名称:液体发酵法制作防治植物病虫害的真菌复合肥及其生产工艺的制作方法
本发明属于微生物发酵技术领域：
。具体是指将有益真菌哈茨木霉或绿色木霉放入含有液态复合肥培养液的发酵罐中进行深层发酵，以获取大量的厚垣孢子。再通过浓缩、混合干制等制作工艺，生产出既具防治植物病、虫害，又促进植物生长等多功能的环保型复合菌肥。
山东省济南科贝尔生物工程有限公司王立民等人于1996年11月共同申请了“液体发酵法制备防治植物病毒的农药及其生产工艺”的发明专利(专利公开号CN 1136393A)。其生产工艺是通过液体深层发酵将真菌群体量增大。此发明对真菌的产业化生产具有相对的稳定性和可行性。但是此发明并未说明最终产品中活性真菌的菌株形态以及活性真菌的有效存活期。此外，此农药对植物病毒病的抑制与防治见效较慢，且功能单一。又如由浙江省王井宝等人于2001年2月共同申请的“速效抗病真菌有机肥料及其生产方法”的发明专利(专利公开号CN1283599A)。该项发明对土壤改良以及植物土传病害具有一定的功能。但是该产品的制作工艺烦琐，且在产品生产过程中产品的质量很难得以保证。
本发明为农业生产提供了作物所需的复合肥料，能显著地促进各类植物的生长，从而起到了保质增产的作用。该复合菌肥不仅能在多种植物，不同的生长期使用，而且施用的方法简易，可通过裹种、混种、混土、浸根等方法施入土壤中，同时也能对植物的地上部分进行喷施。
本发明的另一个特点是含有两种活性有益真菌。哈茨木霉Trichoderma harzianum在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏菌号为CGMMCC N0.0730；绿色木霉Trichoderma viride在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏菌号为CGMMCC N0.0731。有益真菌在产品中的形态为厚垣孢子，即真菌的休眠孢子。休眠孢子能在恶劣的环境条件下存活一年半以上，当遇到合适的环境条件如水、温度等，就能萌发生长。本发明的突破点在于解决了现有发酵技术中存在的问题，即如何将真菌的菌丝体或分生孢子在液体发酵过程中转化为厚垣孢子。厚垣孢子作为本发明中活性真菌的形态，能大大的延长产品的保存货架期。此外，本发明中的两种有益真菌均属植物根际土壤寄生微生物。它们能通过寄生和占位起到抑制或杀死多种植物病原菌、保护各类作物正常生长的作用，同时能有效改善土壤的生态平衡，提高作物对土壤中有效养分的吸收。
本发明的另一个特点是产品中的填充物是一种天然的具有一定抑制或杀死植物有害昆虫的矿物土粉末。从而使本产品除了具有防治植物病害、促进生长等功能外，还具有防治植物有害昆虫的作用。
本发明属于纯正的绿色产品。长久以来，无机化学或有机磷农药以及无机化肥被大量用在农业生产中，对人类赖以生存的水、土壤和空气造成了极大的，甚至是毁灭性的污染。然而，在农业生产中使用本发明所生产的产品能够减少或取代以上所述的对环境造成污染的各类农用产品，从而起到了保护、绿化环境的作用。
本发明的目的在于公开一种液体发酵法生产含有厚垣孢子的复合菌肥。具体生产工艺如下1.一种液体发酵法制备真菌厚垣孢子复合肥的工艺。
(1)培养皿菌种制备将哈茨木霉和绿色木霉的纯菌株在无菌操作条件下分别接种在固体土豆汁培养基的平面上，然后将培养皿放入恒温培养箱中，在25～28℃条件下培养3～5天。哈茨木霉(Trichoderma harzianum)，菌种编号CGMCC NO.0730。和绿色木霉(Trichodermaviride)菌种编号CGMCC N0.0731。固体土豆汁培养基配方如下土豆汁 20％蔗糖 0.2％琼脂 1.5％PH值 自然
(2)摇瓶菌种制备根据权利要求
(1)所述将培养皿制备的菌种在无菌操作条件下转移到装有1L真菌培养液的2L摇瓶中。将摇瓶放在摇床上，在23～27℃，转速180rpm的条件下培养4～5天。培养结束后可获得厚垣孢子液，厚垣孢子数为5×108～3×109/ml。真菌培养液的配方为玉米淀粉(北京淀粉厂) 2.5％/L干酵母(北京燕京啤酒厂) 0.25％/L液态复合肥(美国Actagro LLC.) 3％/L添加剂(美国Ag Biosience Corp) 0.1％/L(3)一级种子制备根据权利要求
(2)所述配制相同的真菌培养液。将9立升的培养液放入16立升的一级种子发酵罐中，并加适量消泡剂(旅顺化工厂)然后进行高温(121℃)高压(15磅)蒸汽灭菌，灭菌时间为1小时。间隔24小时后再以同样的条件灭菌一次，待培养液冷却后将发酵罐的罐压调整为0，同时将无菌空气(0.2～0.4磅)通入权利要求
(2)中所述的真菌培养摇瓶中，将1L厚垣孢子液转入到一级种子发酵罐中。在25～28℃，罐压为0.4～0.6Kg，空气量为1～1.2∶0.5～0.7/m3，转速为190～210rpm的条件下发酵培养3～4天。培养结束后可获得厚垣孢子液，厚垣孢子数为2×108～8×108/ml。
(4)二级种子制备根据权利要求
(3)中所述配制相同的23真菌培养液。将120L～150L的培养液放入250L的发酵罐中，并进行权利要求
(3)中所述的灭菌消毒处理，然后通过无菌管道将一级种子发酵罐中的厚垣孢子液转入二级种子发酵罐中，在与权利要求
(3)中发酵参数相同的条件下发酵培养4～5天。培养结束后可获得厚垣孢子液，厚垣孢子数与一级种子发酵液相似。
(5)厚垣孢子生产根据权利要求
(3)中所述配制相同的真菌培养液。将1.2吨～1.5吨的培养液放入2.5吨的发酵罐中，并进行权利要求
(3)中所述的灭菌消毒处理，然后通过无菌管道将二级种子发酵罐中的厚垣孢子液转入三级发酵罐中，在与权利要求
(3)中发酵参数相同的条件下发酵培养4～5天。培养结束后可获得厚垣孢子液，厚垣孢子数与一级/二级发酵液相似。
2.浓缩工艺将培养完成的厚垣孢子发酵液倒入洁净的塑料桶中。将连续操作离心机的进口管放入装有发酵液的塑料桶中，启动离心机，转速为7000～8000rpm，流量为2～3L/分钟。
3.混合干制工艺根据权利要求
2中所述，将离心后的两种有益真菌的浓缩厚垣孢子发酵液按1∶1的比例进行混合，混合后的厚垣孢子发酵液再与硅藻土(吉林长白硅藻土总公司)或其它载物进行混合，混合比例为1.1～1.3∶5～6(重量/重量)，混合器的转速为30转/分钟，混合3～5分钟后将混合物转入碾磨器中再进行碾磨混合，所出的混合物为最终产品。
综上所述，本发明为微生物发酵工业提供了一个非常稳定的、大规模产业化生产的工艺。本发明的多功能性与长效性使其具有广阔的市场前景，并将为社会、经济、环保和生态带来明显的效益。
表1草莓叶面积增长情况(cm2)
表2草莓株高生长情况(cm)
表3草莓果实增产及防病效果情况
从以上试验结果可以刊出，本发明对草莓的叶子、株高和果实都有明显的促生增产效果，田间施用本发明菌肥300倍，对草莓叶面积和株高的增加率达到35％以上，对果实的平均增产效果达到25％左右，同时对草莓白粉病的防治效果也达到60％左右。
实施例2本发明对油菜的促生、增产和防病试验结果。表1油菜促长、增产试验结果
表2油菜病害防治试验结果
从试验结果可以看出本发明对油菜的生产有显著的增产作用，与空白对照相比，150倍增产效果达到38％，300倍增产效果达到26％；与基质对照相比，150倍增产25％，300倍增产13％。同时对油菜菌核病有一定的控制效果。
权利要求
1.一种液体发酵法制备真菌厚垣孢子复合肥的工艺，其特点在于以哈茨木霉和绿色木霉为菌种，采用如下步骤进行的(1)培养皿菌种制备将哈茨木霉和绿色木霉的纯菌株在无菌操作条件下分别接种在固体土豆汁培养基的平面上，然后将培养皿放入恒温培养箱中，在25～28℃条件下培养3～5天。哈茨木霉(Trichoderma harzianum Th-4)，菌种编号CGMCC N0.0730，和绿色木霉(Trichoderma viride Tv-3)菌种编号CGMCC N0.0731。固体土豆汁培养基配方如下土豆汁 20％蔗糖 0.2％琼脂 1.5％PH值 自然(2)摇瓶菌种制备根据权利要求
(1)所述将培养皿制备的菌种在无菌操作条件下转移到装有1L真菌培养液的2L摇瓶中。将摇瓶放在摇床上，在23～27℃，转速180rpm的条件下培养4～5天，培养结束后可获得厚垣孢子液，厚垣孢子数为5×108～3×109/ml，真菌培养液的配方为玉米淀粉(北京淀粉厂) 2.5％/L干酵母(北京燕京啤酒厂) 0.25％/L液态复合肥(美国Actagro LLC.) 3％/L添加剂(美国Ag Biosience Corp) 0.1％/L(3)一级种子制备根据权利要求
(2)所述配制相同的真菌培养液，将9立升的培养液放入16立升的一级种子发酵罐中，并加适量消泡剂(旅顺化工厂)然后进行高温(121℃)高压(15磅)蒸汽灭菌，灭菌时间为1小时，间隔24小时后再以同样的条件灭菌一次，待培养液冷却后将发酵罐的罐压调整为0，同时将无菌空气(0.2～0.4磅)通入权利要求
(2)中所述的真菌培养摇瓶中，将1L厚垣孢子液转入到一级种子发酵罐中，在25～28℃，罐压为0.4～0.6Kg，空气量为1～1.2∶0.5～0.7/m3，转速为190～210rpm的条件下发酵培养3～4天，培养结束后可获得厚垣孢子液，厚垣孢子数为2×108～8×108/ml；(4)二级种子制备根据权利要求
(3)中所述配制相同的真菌培养液，将120L～150L的培养液放入250L的发酵罐中，并进行权利要求
(3)中所述的灭菌消毒处理，然后通过无菌管道将一级种子发酵罐中的厚垣孢子液转入二级种子发酵罐中，在与权利要求
(3)中发酵参数相同的条件下发酵培养4～5天，培养结束后可获得厚垣孢子液，厚垣孢子数与一级种子发酵液相似；(5)厚垣孢子生产根据权利要求
(3)中所述配制相同的真菌培养液，将1.2吨～1.5吨的培养液放入2.5吨的发酵罐中，并进行权利要求
(3)中所述的灭菌消毒处理，然后通过无菌管道将二级种子发酵罐中的厚垣孢子液转入三级发酵罐中，在与权利要求
(3)中发酵参数相同的条件下发酵培养4～5天，培养结束后可获得厚垣孢子液，厚垣孢子数与一级/二级发酵液相似。
2.浓缩工艺将培养完成的厚垣孢子发酵液倒入洁净的塑料桶中，将连续操作离心机的进口管放入装有发酵液的塑料桶中，启动离心机，转速为8000rpm，流量为2～3L/分钟。
3.混合干制工艺根据权利要求
2中所述，将离心后的两种有益真菌的浓缩厚垣孢子发酵液按1∶1的比例进行混合，混合后的厚垣孢子发酵液再与硅藻土(吉林长白硅藻土总公司)或其它载物进行混合，混合比例为1.1～1.3∶5～6(重量/重量)，混合器的转速为30转/分钟，混合3～5分钟后将混合物转入碾磨器中再进行碾磨混合，所出的混合物为最终产品。
专利摘要
本发明属于微生物技术领域：
，主要内容是以哈茨木霉和绿色木霉为菌种，采取一步液体发酵法制备成真菌厚垣孢子复合肥的工艺，并将培养完成的厚垣孢子发酵液经过浓缩处理后，把两种有益真菌的浓缩孢子发酵液按一定比例与硅藻土或其它载物进行混合，成为最终产品。
文档编号C12P1/02GKCN1451635SQ02116870
公开日2003年10月29日 申请日期2002年4月18日
发明者孙连壮, 毛伟力 申请人:孙连壮, 毛伟力导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan