黑老虎的组织培养快速繁殖方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及黑老虎的培育领域。更具体地说，本发明涉及一种黑老虎的组织培养 快速繁殖方法。
【背景技术】
[0002] 黑老虎为木兰科植物厚叶五味子Kadsuracoccinea(Lem)A.C.Smith。又叫钻朗 风、大钻、冷饭团等，生于山谷、疏林中。具有镇痛、镇静、消炎的作用，中医临床用于治疗风 湿骨痛、跌打肿痛、胃痛、急性肠炎、疝气、产后腹痛、痛经等症疗效显著，多次被国家列为中 药保护品种。黑老虎为多年生木质常绿藤本植物，茎蔓茂盛，叶片终年翠绿，遮阴效果好，适 合套种阴生药材，其幼果青绿色，成熟时颜色深红，极具观赏性，因此颇受世人青睐。一直以 来，黑老虎药材完全依赖野生资源，以采挖全株为代价，植物的繁殖主要以实生繁殖为主， 由于植株结实性差，野生动物爱吃其果实，因此种子存有量少且出芽率低，导致其繁殖速度 十分缓慢，更有甚者，民间灭绝式采挖，已造成国内外野生资源濒危。目前有关黑老虎的组 织培养报道较少，特别是尚未有采用叶片作为外植体培养的相关报道。
【发明内容】
[0003] 本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
[0004] 本发明还有一个目的是提供一种黑老虎的组织培养快速繁殖方法，以黑老虎茎尖 顶端的幼嫩叶片为外植体，通过多次防褐化处理的操作使外植体的褐化率控制在7%以下， 并通过在生根培养基中加入促生根营养液将黑老虎外植体的生根率达到95%，以及通过适 时定量喷施促生长营养液使成苗率达到97%以上。
[0005] 为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种黑老虎的组织培养快速 繁殖方法，包括以下步骤：
[0006] A、外植体的选择与处理：取靠近黑老虎茎尖顶端的幼嫩叶片，消毒处理后得无菌 外植体；
[0007] B、外植体的诱导：用刀片将无菌外植体去掉叶脉组织，切成1.Ocm-2. 0cm的正方 形叶块，边缘用刀片划伤，接种到诱导培养基中，在培养温度为24-26Γ，黑暗条件下培养 7d，然后在光照强度1500LUX，光照时间为10-12小时/天的条件下诱导培养21d，获得第 一愈伤组织，其中诱导培养基中的配方为：MS、TDZL0-L5mg/L、2, 4-DL0-3.Omg/L、NAA 0. 1-1.Omg/L、琼脂4. 5g/L和蔗糖25g/L，调整诱导培养基的pH值为5. 8 ;
[0008]C、愈伤组织的防褐化处理：将第一愈伤组织转接到防褐化培养基中，在培养温 度为20-25Γ，黑暗条件下培养7天，得第二愈伤组织，其中防褐化培养基的配方为：MS、 6-BA0. 1-0. 5mg/L、硝酸银1. 0-8.Omg/L、琼脂4. 5g/L和蔗糖25g/L，调整防褐化培养基的pH 值为5. 8 ;
[0009] D、愈伤组织的分化：将第二愈伤组织用刀片切成2. 0cm的正方形叶块，接种到 分化培养基中，在培养温度为24-26°C，光照强度1500LUX，光照时间为10-12小时/天的 条件下培养21天，获得丛生芽苗，其中分化培养基的配方为：MS、6-BA1. 0-2.Omg/L、IBA 0. 5-1. 5mg/L、琼脂4. 5g/L和蔗糖25g/L，调整分化培养基的pH值为5. 8 ;
[0010] E、继代增殖培养：将丛生芽苗置于增殖培养基中，在培养温度24-26°C，光照强度 2000Lux，光照时间为10-12小时/天的条件下培养30天得到增殖苗，其中增殖培养基的配 方为：MS、KT0· 1-0. 5mg/L、6-BA0· 5-1. 5mg/L、NAA0. 2-1.Omg/L、琼脂 4. 5g/L和蔗糖 25g/ L，调整增殖培养基的pH值为5. 8 ;
[0011] F、壮苗培养：将增殖苗置于壮苗培养基中，在培养温度24-26 °C，光照强度 2000LUX，光照时间为10-12小时/天的条件下培养21天得到健壮苗，其中壮苗培养基的配 方为：MS、粉状活性炭 0· 5-1. 5g/L、6-BA0· 1-0. 5mg/L、IBA0. 1-0. 5mg/L、琼脂 4. 5g/L和蔗 糖25g/L，调整壮苗培养基的pH值为5. 8 ;
[0012] G、生根培养：将健壮苗置于生根培养基中，在培养温度24-26 °C，光照强度 2000LUX，光照时间为10-12小时/天的条件下培养21天得到带根幼苗，其中生根培养基包 括：1/2MS、粉状活性炭 0· 1-0. 5g/L、IBA0. 5-1. 5mg/L和NAA0. 5-1. 5mg/L、琼脂 4. 5g/L和蔗 糖25g/L，调整生根培养基的pH值为5. 8 ;
[0013]H、炼苗与移栽。
[0014] 优选的是，所述的黑老虎的组织培养快速繁殖方法，炼苗与移栽具体是指将带根 幼苗连同培养瓶移出培养室，转入大棚，在温度为25-27°C下，放置7天，然后打开瓶盖，炼 苗3-4天，取出，洗净根部培养基，移栽到由腐殖土、蛭石和椰糠按体积比为3:1:1混合组成 的基质中，移栽后7-10天覆盖塑料薄膜，再覆盖一层报纸，控制遮光率为60 % -70 %，空气 湿度 85 % -90%。
[0015] 优选的是，所述的黑老虎的组织培养快速繁殖方法，在外植体诱导培养之前，将外 植体置于浸泡液中，在4°c黑暗条件下超声波处理4-5h，超声功率为300W，所述浸泡液的 配方为：维生素C1. 2-1. 6g/L、芸香苷0. 5-0. 7g/L、聚乙烯吡咯烷酮0. 7-0. 9g/L、活性炭 1. 2-L4g/L、咖啡碱(λ1-0. 3g/L、木犀草素L6-L8g/L和石决明粉 100-120mg/L。
[0016] 优选的是，所述的黑老虎的组织培养快速繁殖方法，在步骤B中用刀片将无菌外 植体去掉叶脉组织，切成1.Ocm-2. 0cm的正方形叶块之前，以及步骤D中将第二愈伤组织 用刀片切成2. 0cm的正方形叶块接种到分化培养基前，将刀片两侧涂抹0. 5-lmm厚的凝 胶剂，所述凝胶剂由以重量份计的如下原料制成：魔芋精粉10-12份、蜂蜜4-5份、杨梅素 0. 15-0. 18份、迷迭香酸0. 36-0. 42份、竹醋液1. 3-1. 5份、木耳多糖4-8份和磁化水100 份。
[0017] 优选的是，所述的黑老虎的组织培养快速繁殖方法，所述生根培养基中还包括 3-5mL/L的促生根营养液，所述促生根营养液的配方为：玉米素50-70mg/L、无水乙醇30mL/ L、磷酸二氢铵200-220mg/L、小檗碱2-4mg/L和芦荟汁液10-14g/L。
[0018] 优选的是，所述的黑老虎的组织培养快速繁殖方法，带根幼苗移栽后的第10天 起，每间隔7-9天喷施促生长营养液1次，共计5次，每次喷施量为每1株带根幼苗喷施 50-80mL，所述促生长营养液由以重量份计的如下原料组成：取48-58重量份的圣女果破碎 榨汁得圣女果汁，将3-5重量份的筋骨草干燥粉碎后加入到圣女果汁中，加入20-34重量份 的蔗糖，混匀后密闭于10-15Γ下放置7-10天，取出，加入其重量的5倍的磁化水磨浆，得第 一混合物，按照第一混合物、竹醋液和磁化水以质量比为20-25:3:200加入竹醋液和磁化 水，混匀后即得所述促生长营养液。
[0019] 优选的是，所述的黑老虎的组织培养快速繁殖方法，所述消毒处理在指将黑老虎 茎尖顶端的幼嫩叶片用1%洗洁精水溶液浸泡5-10min，线状自来水冲洗10-15min，无菌水 润洗一次，再用添加了 2-3滴吐温-20的150mL质量分数为0. 1 %的升汞浸泡6-8min，无菌 水冲洗3-5次，得无菌外植体。
[0020] 本发明至少包括以下有益效果：
[0021] 1)本发明的组培方法简单、根质量好，易于移栽成活，采用叶片为外植体，不仅取 材方便，而且节约了茎段避免了整株采集，有利于黑老虎资源的保护，也能满足市场对黑老 虎药材的需求；
[0022] 2)繁殖速度快，培育周期短，不受季节限制，可实现工厂化育苗，且组织培养育苗 的种苗遗传稳定性好；
[0023] 3)采用防褐化培养基处理，降低了外植体的褐化率，另外，外植体诱导培养之前， 将外植体置于浸泡液中超声处理，利用维生素C、芸香苷为抗氧化剂，聚乙烯吡咯烷酮、活性 炭为抗吸收剂抗褐化处理，咖啡碱有助于减轻伤口处的褐化程度，木犀草素和石决明粉具 有抑制多种病菌以及增强外植体的免疫功能的作用。
[0024] 组织培养的pH在4. 0-5. 0外植体排出的褐化物较多，本发明的发明人发现哎不影 响外植体生长的情况下培养基的pH设定在5. 8时，褐化率最低；
[0025] 外植体消毒一般采用酒精结合升汞处理，但是酒精消毒会增加褐化率，并且消毒 时间越长，褐化率越高，本发明将消毒和灭菌分为2步，一个为升汞浸泡，另一个为结合具 有防褐化作用的