一种大叶藻愈伤组织的诱导方法
【技术领域】
[0001]本发明所属植物组织培养研究领域，本发明涉及一种大叶藻愈伤组织的诱导方法。
【背景技术】
[0002]大叶藻(Zostera marina L.)是全球海草的代表种,也是我国北方海域泥沙海域海草场的优势种。由其构建的海草场具有极其重要的生态服务功能:为许多经济鱼类等海洋生物提供栖息、繁殖和藏身场所；其众多的腐殖质为浮游生物、幼小鱼虾等海洋动物提供了优良的天然饵料；能吸收海洋污染物，起到净化海水水质、改善海水的透明度的作用；可抗击风浪与海潮，是保护海岸的天然屏障。
[0003]但近一个世纪里，由于种种人为因素的影响，大叶藻种群在全球范围内大面积衰退，如山东省在近二十年里有超过90%的大叶藻草场消失。因此，大叶藻草场的修复已成为了全球海洋生态系统修复中不可或缺的一项内容，草场修复中需要大量的种苗，利用植物组织培养技术在室内培养出无菌苗无疑是缓解目前大叶藻修复移栽中种苗短缺的一个有效方法。
[0004]愈伤组织的诱导是多数植物的无菌苗再生必需经历的一个中间环节，因此，愈伤组织的成功诱导是植物无菌苗再生的重要技术支撑。国际上对大叶藻等海草的组织培养研究已有一段时间，研究进展却并不大，日本学者2001年以大叶藻茎尖为外植体，历经180d的培养获得了少量的愈伤组织；中国海洋大学2011年8月公开了“一种大叶藻属愈伤组织的诱导方法”专利，采用无菌实生苗的胚根、胚轴、子叶为外植体诱导出了愈伤组织。
[0005]本发明以大叶藻的胚为外植体，短时间内诱导出愈伤组织，目前采用该技术方案的相关专利和文献未见报导。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种大叶藻愈伤组织的诱导方法，采用大叶藻胚为外植体，可有效地获得愈伤组织，为大叶藻的快速繁殖和无菌组培苗再生提供重要的技术支撑。
[0007]本发明所采用的技术方案为:
本发明的一种大叶藻愈伤组织的诱导方法，是以大叶藻的胚为诱导体细胞胚的外植体。
[0008]本发明的具体步骤如下:
1、外植体的选取:采集大叶藻的果实或种子，清洗后在超净工作台内进行消毒处理，得到无菌果实或种子，剥去果实或种皮，取出无菌胚；
2、愈伤组织的诱导培养:在无菌条件下将大叶藻胚接种于诱导培养基中，于15-25°C、黑暗条件下进行培养。培养20-30d时，可见子叶发出，随子叶的发出可见子叶发出处膨大，约50d后形成愈伤组织。诱导培养基是盐度为20-35%。、且添加了有机添加物、碳源、生长素的MS或1/2MS固体培养基。
[0009]本发明中，所采果实为近乎成熟的果实，种子为健康成熟种子。
[0010]本发明中，优选培养基为MS培养基，并添加水解酪蛋白500mg/L、蔗糖30g/L、
2.4-D0.2mg/L 琼脂 5 g/L、海盐 20 g/L，pH=6_7。
[0011]本发明中，优选培养条件为15-18°c。
[0012]本发明的优点在于:大叶藻果实和种子易于表面消毒，因此容易获得无菌胚；愈伤组织诱导率较高，为42.25%，且诱导时间较短。本发明为大叶藻无菌组培菌再生提供了重要的技术支撑，也为海草组织培养的成功奠定了基础。
[0013]
【具体实施方式】
本发明所述的一种有效的大叶藻愈伤组织的诱导方法包括以下实施例，下面的实施例可进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明。然而这些依据本发明实施例所作的种种等效替换及修改，均属于本发明的发明精神及由权利要求所界定的专利范围内。
[0014]实施例1:一种大叶藻愈伤组织的诱导方法，其实施步骤包括:
1、外植体的选取:在大叶藻果实几近成熟时，采集其健康佛焰苞花序，剥去佛焰苞花序外的苞叶，仅留里面的花序及其上的果实，清洗后在超净工作台内用15%的过氧化氢浸泡消毒20min，再用灭菌海水冲洗3-5次，得到无菌花序，逐个取下花序上果实，切开果皮，取出无菌胚；
2、愈伤组织的诱导培养:在无菌条件下将无菌胚接种于诱导培养基中，于18°C、黑暗条件下进行培养。培养近30d时，可见子叶发出，随子叶的发出可见子叶发出处膨大，约50d后形成愈伤组织。诱导培养基是盐度为20%。、且添加了水解酪蛋白500mg/L、蔗糖30g/L、
2.4-D0.2mg/L、琼脂5 g/L、海盐20 g/L，pH=6_7的MS固体培养基。愈伤组织诱导率为42.25%。
[0015]实施例2:—种大叶藻体细胞胚的诱导方法，其实施步骤为:
1、外植体的选取:以成熟种子为外植体，挑选外形饱满、种皮呈褐色的成熟大叶藻种子，用海水冲洗干净，于超净工作台内用15%的过氧化氣浸泡20min,再用灭菌海水冲洗3_5次，用无菌滤纸吸干水分，用解剖刀割破种皮，取无菌胚；
2、体细胞胚的诱导培养:在无菌条件下将无菌胚接种于诱导培养基中，于15°C、黑暗条件下进行培养。培养至20d时，可见胚下部组织膨大，同时子叶发出，随子叶的发出可见子叶发出处也开始膨大，约50d后在胚部及子叶上均可见形成愈伤组织。诱导培养基是盐度为20%。、且添加了水解酪蛋白1000mg/L、蔗糖30g/L、2，4-D 0.2mg/L、琼脂5 g/L、海盐20g/L, pH=6-7的1/2MS固体培养基。愈伤组织诱导率为27.33%。
【主权项】
1.一种大叶藻愈伤组织的诱导方法，其特征在于，是以大叶藻的胚为诱导体细胞胚的外植体。2.如权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，步骤如下: 1)外植体的选取:采集大叶藻的果实或种子，清洗后在超净工作台内进行消毒处理，得到无菌果实或种子，剥去果实或种皮，取出无菌胚； 2)愈伤组织的诱导培养:在无菌条件下将大叶藻胚接种于诱导培养基中，于15-25°C、黑暗条件下进行培养；培养20-30d时，可见子叶发出，随子叶的发出可见子叶发出处膨大，约50d后形成愈伤组织；诱导培养基是盐度为20-35%。、且添加了有机添加物、碳源、生长素的MS或1/2MS固体培养基中的任一种。3.如权利要求2所述的诱导培养方法，其特征在于，所采果实为近乎成熟的果实，种子为健康成熟种子。4.如权利要求2所述的诱导培养方法，其特征在于，优选培养基为MS培养基，添加水解酪蛋白 500mg/L、蔗糖 30g/L、2，4-D 0.2mg/L、琼脂 5 g/L、海盐 20 g/L，pH=6_7。5.如权利要求2所述的诱导培养方法，其特征在于，优选培养条件为15-18°C。
【专利摘要】本发明涉及一种大叶藻愈伤组织的诱导方法，是以大叶藻的胚为外植体，将无菌胚从已表面消毒的种子或果实中取出，接种到愈伤组织诱导培养基上，在15-25℃、黑暗条件进行诱导培养，每半月转接一次，培养近20-30d时，可见子叶发出，随子叶的发出可见子叶发出处膨大，约50d后形成愈伤组织。诱导培养基是以MS、1/2MS培养基为基础培养基、并添加有机添加物、碳源、生长素和海盐的固体培养基。本发明的方法可快速有效地诱导出大叶藻的愈伤组织，为大叶藻无菌组培苗再生和组培快速繁殖体系的建立提供了重要的技术支撑，也为海草组织培养的成功奠定了基础。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105393913
【申请号】CN201410462547
【发明人】郑凤英, 陈玉, 刘雪芹, 金艳梅, 张伟, 李乐乐
【申请人】山东大学（威海）
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2014年9月12日