培养基1(含2%大豆汁 液、0.1 皿ol/L NiCl2、1.5皿ol/L KC1、0.祉mol/L CrCl3)重新悬浮菌体;然后，5000g离屯、 3min收集菌体，用培养基1再次重新悬浮菌体；然后接种于20ml培养基1中（初始ODsoo S 0.1)，20化pm、28°C摇床上振荡培养;每隔4h检测1次菌体浓度；
[0037] CKl:将步骤(3)中的培养基1替换成培养基2(含2%大豆汁液、0.1皿ol/L NiCb), 其他条件不变；
[003引CK2:将步骤(3)中的培养基1替换成培养基3(含2%大豆汁液、1.5皿ol/L KC1)，其 他条件不变；
[0039] CK3:将步骤(3)中的培养基1替换成培养基4(含2%大豆汁液、0.祉mol/L化Cl3)， 其他条件不变；
[0040] CK4:将步骤(3)中的培养基1替换成培养基5(2%大豆汁液），其他条件不变；
[0041]
[0043] 表1中的数据表明：本发明的抑制剂组合物能够显著地抑制下香假单胞菌大豆致 病变种（Pseudomonas syringae pv.glycinea)菌体生长，且抑制效果大于单剂的抑制效 果，本发明的抑制剂组合物具有协同增效作用。
[0044] 比较试验B
[0045] 1、致病性检测
[0046] (1)挑选了香假单胞菌大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.glycinea)菌落 接种于20ml邸液体培养基中，于28°C、200巧m摇床上振荡培养20h(OD6〇() - 1.0);
[0047] (2)用移液器吸取上述菌液200ul，重新接种于新鲜的KB液体培养基中，继续振荡 培养直到OD日日日达到约1.0为止；
[004引（3)将步骤(2)中的菌液5000g离屯、3min收集菌体，然后用灭菌去离子水重新悬浮 菌体;然后，5000g离屯、3min收集菌体，用灭菌去离子水再次重新悬浮菌体;调ODsgg至0.2; [0049] (4)在步骤(3)得到的菌液中加入化(：12、1((：1、灯(：13，调整化(：12、雌1、化(：13的终浓 度分别为0.1皿〇1/1、1.5^11〇1/1、0.8曲1〇1/1;将混合后的菌液喷雾接种大豆植株(感病品种 (缓农14)，六周龄）；
[0化0] CK5:在步骤(3)得到的菌液中加入NiCh,调整NiCh的终浓度为0.1皿ol/L，将混合 后的菌液喷雾接种大豆植株(感病品种(缓农14)，六周龄）；其他条件不变；
[0051 ] CK6:在步骤(3)得到的菌液中加入KCl，调整KCl的终浓度为1.5皿ol/L，将混合后 的菌液喷雾接种大豆植株(感病品种(缓农14)，六周龄）；其他条件不变；
[0052] CK7:在步骤(3)得到的菌液中加入化C13，调整化Cl 3的终浓度为0.祉mo I /L，将混合 后的菌液喷雾接种大豆植株(感病品种(缓农14)，六周龄）；其他条件不变；
[0053] CK8:在步骤(3)得到的菌液直接喷雾接种大豆植株(感病品种(缓农14)，六周龄）， 其他条件不变。
[0055]表2中的数据表明：本发明的抑制剂组合物能够显著地抑制下香假单胞菌大豆致 病变种(Pseudomonas syringae pv.glycinea)的毒性，且抑制效果大于单剂的抑制效果， 本发明的抑制剂组合物具有协同增效作用。
[0化6]比较试验C
[0化7] 1、虹P基因表达检测（Realtime PCR)
[005引 （1)挑选下香假单胞菌大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.glycinea)菌落 接种于20ml邸液体培养基中，于28°C、200巧m摇床上振荡培养20h(OD60() - 1.0);
[0059] (2)用移液器吸取上述菌液200ul，重新接种于新鲜的KB液体培养基中，继续振荡 培养直到ODs日日达到约1.0为止；
[0060] (3)将步骤（2)中的菌液5000g离屯、3min收集菌体，然后用培养基A(含2%大豆汁 液、0.1 皿ol/L NiCl2、1.5皿ol/L KC1、0.祉mol/L CrCl3)重新悬浮菌体;然后，5000g离屯、 3min收集菌体，用培养基A再次重新悬浮菌体;然后接种于20ml培养基A中，200巧m、28°C摇 床上振荡培养；
[0061 ] (4)诱导培养2地后，5000g离屯、3min，收集菌体；
[006^ (5)用RNA提取试剂盒（TRA^lS'"'，￡^syA/reKRNAKit，CodeNo.ER101)提取总 RNA ；
[0063] (6) WRNA为模板，合成第一链cDM(TRANS?，EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix,Code No.AESll)；
[0064] (7) WcDNA为模板，义用real-time PCR(TaKaRa , SYBRK Premix Ex Taq?GC (Perfect Real Time) ,Code No.RR071A)技术检测高表达、代表性虹P基因化巧Z)及内参基 因（23S rRNA)的表达；
[0065] CK9 :将步骤（3)中的培养基A替换成培养基B (含2 %大豆汁液、0.1 ym01 /L的 NiCb),其他条件不变；
[0066] CKlO:将步骤(3)中的培养基A替换成培养基C(含2%大豆汁液、1.5皿ol/L的KCl)， 其他条件不变；
[0067] CK11:将步骤（3)中的培养基A替换成培养基D (含2 %大豆汁液、0 .如mo 1 /L的 化C13)，其他条件不变；
[006引 CK12:将步骤(3)中的培养基A替换成培养基E(2%大豆汁液），其他条件不变；
[0070]表3中的数据表明：本发明的抑制剂组合物能够显著地抑制hrpZ的表达，且抑制效 果大于单剂的抑制效果，本发明的抑制剂组合物具有协同增效作用。
【主权项】
1. 一种抑制大豆细菌性斑点病的方法，其特征在于:使大豆细菌性斑点病的病原菌接 触抑制剂组合物，所述的大豆细菌性斑点病的病原菌为丁香假单胞菌大豆致病变种 (Pseudomonas syringae pv. glycinea)，所述的抑制剂组合物由NiCl2，KCl，CrCl3组成。2. 根据权利要求1所述的一种抑制大豆细菌性斑点病的方法，其特征在于:所述的抑制 剂组合物由0.01 ymol/L-50 ymol/L的NiCl2,0.01 ymol/L-100 ymol/L的KC1，0.01 μπιο?/ L-60 ymol/L的CrCl3组成。3. 根据权利要求2所述的一种抑制大豆细菌性斑点病的方法，其特征在于:所述的抑制 剂组合物由0.05 ymol/L-50 ymol/L的NiCl2,0.1 ymol/L-50 ymol/L的KC1，0.01 ymol/L-30 ymol/L的CrCl3组成。4. 根据权利要求3所述的一种抑制大豆细菌性斑点病的方法，其特征在于:所述的抑制 剂组合物由0.1 ymol/L-10ymol/L的NiCl2,0.5 ymol/L-15ymol/L的KC1，0.01 ymol/L-10 μ mol/L 的 CrCl3 组成。5. -种抑制大豆细菌性斑点病的抑制剂组合物，其特征在于:抑制剂组合物由NiCl2， KCl，CrCl3组成，所述的大豆细菌性斑点病的病原菌为丁香假单胞菌大豆致病变种 (Pseudomonas syringae pv. glycinea)〇6. 根据权利要求5所述的一种抑制大豆细菌性斑点病的抑制剂组合物，其特征在于:所 述的抑制剂组合物由0.05 ymol/L-50 ymol/L的NiCl2,0.1 ymol/L-50 ymol/L的KC1，0.01 ymol/L_30 ymol/L的CrCh组成。7. 根据权利要求6所述的一种抑制大豆细菌性斑点病的抑制剂组合物，其特征在于:所 述的抑制剂组合物由0.1 ymol/L-10 ymol/L的NiCl2,0.5 ymol/L-15ymol/L的KC1，0.01 μ mol/L-10 ymol/L的CrCl3组成。8. 根据权利要求5-7任一项的抑制剂组合物用于抑制大豆细菌性斑点病的用途，所述 的大豆细菌性斑点病的病原菌为丁香假单胞菌大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv. glycinea)〇
【专利摘要】本发明公开了一种抑制大豆细菌性斑点病的方法，本发明的抑制剂组合物对大豆细菌性斑点病的病原菌—丁香假单胞菌大豆致病变种（<i>Pseudomonas？syringae？</i>pv.<i>？glycinea</i>）具有显著抑制效果，抑制剂组合物由特定浓度的NiCl2，KCl，CrCl3组成。
【IPC分类】A01N59/08, A01N59/16, A01P1/00
【公开号】CN105494433
【申请号】CN201610012843
【发明人】郭威, 刘建中, 高杰, 赵梅勤, 刘霞, 方媛
【申请人】浙江师范大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年1月8日