专利名称：辣椒细菌性斑点病菌检测用引物及探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物检测技术，具体地说涉及辣椒细菌性斑点病菌检测用引物及探 针。
背景技术：
辣椒细菌性斑点病(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)是世界性番爺及 辣椒病害，是重要进境植物检疫性有害生物，主要侵染番茄及辣椒等多种番茄属及辣椒属 植物，染病植株严重时可导致死亡及绝产。该病可通过植株及种子进行远距离传播。该病 目前在欧洲、亚洲、非洲、美洲及大洋洲等国家和地区均有发生。近年来我国辣椒产业发展 很快，辣椒远距离运输的频率及数量也大幅度增加，因此该病传播及扩散的风险日益增大。本研究选择辣椒细菌性斑点病Rhs基因序列设计一条荧光标记探针和一对引物， 建立了辣椒斑点病菌的荧光PCR检测方法，反应结束即可根据扩增曲线判定是否有辣椒斑 点病菌。
发明内容
本发明目的在于提供用于辣椒细菌性斑点病菌实时荧光PCR检测的引物及探针 序列。本发明通过分析已报道辣椒细菌性斑点病菌Rhs基因序列的基础上，分别设计引 物和荧光探针。所述的引物对由正向和反向引物组成，其核苷酸序列如序列表XCV-F好 XCV-R所示；所述探针核苷酸序列如序列表XCV-P所示，该探针在5 ‘端标记有FAM荧光染 料，在3'端采用了 BHQ淬灭基团。TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增有关。即将报告荧 光染料标记在探针的5'端，而3'端标记了淬灭基团，两者构成能量转移结构，即报告荧 光染料所发射的荧光可被淬灭基团吸收，当二者距离变远时，抑制作用减弱，报告荧光染料 信号增强。当探针完整的情况下，报告基团发射的荧光信号被荧光淬灭基团淬灭。在进行 退火的过程中，探针及引物先与目标基因结合，当引物延伸至荧光标记探针的结合位点时， TaqDNA聚合酶发挥其5'外切酶活性将探针切断，使报告基团与淬灭基团分离，产生荧光 信号。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累，即荧光分子的数目与PCR扩 增产物呈1 1的关系，从而实现对辣椒细菌性斑点病菌的检测。本发明还进一步给出了应用上述引物和探针的荧光PCR检测方法，其以样品菌液 为模板，进行实时荧光PCR扩增，每个循环结束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结^ ο具体地说本发明以样品菌液为模板，进行实时荧光PCR反应，即在20 μ L反应体系 中力口入 8 μ L 超纯水，10 μ L2 XPremix Ex Taq , 0· 5 μ L 引物 XCV-F (20 μ mol/L)，0· 5 μ L 弓| ^ XCV-R(20 μ mol/L) ,0. 5 μ L TaciMan 探针 XCV-P (20 μ mol/L)，0. 5 μ L 菌液。Premix Ex Taq 购自Takara公司。
其中，上述反应条件可以是第一个循环为95°C 3min ；随后40个循环，92°C 5s, 60°C 30s。当然，可以根据本发明给出的引物对或者其扩增产物序列设计其他类型的探针， 以适用不同方法的荧光PCR检测。进一步，还可以将本发明引物、探针以及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。本发明根据辣椒细菌性斑点病菌Rhs基因序列设计引物及探针，该探针特异性 好，用于荧光PCR检测灵敏性高。本发明检测方法准确性高、灵敏度高，其能够快速简单地 判断样品是否有辣椒细菌性斑点病菌，为进出口安全提供了保证。
图1是实时荧光PCR技术检测辣椒细菌性斑点病菌的结果；图2是本发明检测方法的灵敏度实验。
具体实施例方式下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。实施例1引物及探针的设计和合成根据辣椒细菌性斑点病菌Rhs基因序列，采用探针设计软件Express 2. 0设计引 物及探针，引物序列为XCV-F (正向)5 ‘ -GGATGGGCAGCGTATCTTTC-3 ‘XCV-R (反向)5 ‘ -CAAACAGCATTTCCACCTTGAA-3 ‘所述探针的序列为XCV-P 5' -CCTGAAGCGAAGCTCTGCCAAGTCG-3‘，该探针的5'端用报告荧光染料标记，3'端标记有荧光淬灭基团。实施例2总DNA的提取1)采集适量幼嫩叶片，用液氮研成粉末，0.4g装入1.5ml离心管中(_20°C预冷)2)预热1. 5 X CTAB到95°C，加Iml到装有叶片粉末的离心管中，混勻(防止冻融)。3)立即置于65°C水浴30min，每5min，上下颠倒1次，12000g离心5min。4)吸取上清液约600 μ 1，加入等体积(600 μ 1)氯仿/异戊醇(24 1)，上下颠倒 数次，至下层液相呈深绿色为止，12000g离心5分钟。5)取450 μ 1上清液于一新1. 5ml离心管，加入Iml 95%乙醇和45 μ 1 IOM NH4AC, 混勻，室温放置IOmin。6) 12000g离心lOmin，去上清液，用75%乙醇浸洗沉淀，自然干燥约30min。7)加入50μ1 1/10ΤΕ或无菌水(含20μ g RNase)，置于4°C过夜，待DNA溶解后，检测DNA浓度及质量。实施例3Real_time PCR扩增方法的建立1、实时荧光PCR反应体系以菌液为模板，进行实时荧光PCR反应，即在20 μ L反应体系中加入8 μ L超纯水， 10 μ L 2 X PremixEx Taq , 0· 5 μ L 引物 XCV-F (20 μ mol/L)，0· 5 μ L 引物 XCV-R (20 μ mol/ L)，0. 5 μ L TaqMan 探针 XCV-P (20 μ mol/L)，0. 5 μ L 菌液。
2、实时荧光PCR反应条件将样品管放入Roche公司的LightCycler1. 0荧光PCR仪后，设置如下条件进行反应第一个循环为95°C 3min ；随后40个循环，92°C 5s,60°C 30s。每个循环结束后采集数 据。反应结束后根据扩增曲线判定结果。实施例4辣椒细菌性斑点病菌Real-time PCR方法的特异性确定以发病后显症及未显症的辣椒叶片总DNA为模板，以健康辣椒为对照，通过实时 荧光PCR检测荧光强度变化。试验结果以发病后显症及未显症的辣椒叶片的总DNA为模板，通过实时荧光PCR检测可观 察到明显的荧光强度变化，而健康对照的荧光强度没有变化，结果见图1。实施例5灵敏度实验用超纯水分别稀释细菌菌液，进行相对灵敏度检测，在20 μ L反应体系中，分别 加入 0. 5 μ L 如下浓度的稀释菌液1. 8 X 109cfu/mL, 1. 8 X 108cfu/mL, 1· 8 X 107cfu/mL, 1. 8X 106cfu/mL, 1. 8X 105cfu/mL, 1. 8X 104cfu/mL, 1. 8X 103cfu/mL, 1. 8X 102cfu/mL, 1. 8 X IO1CfuAiL, 1. 8X 10°cfu/mL。检测结果如图2所示，最低检测限是9个细菌。
权利要求
1.一种辣椒细菌性斑点病菌检测用引物，其核苷酸序列为 XCV-F 5 ‘ -GGATGGGCAGCGTATCTTTC-3‘XCV-R 5' -CAAACAGCATTTCCACCTTGAA-3‘。
2.一种与权利要求1所述引物配合使用的探针，其核苷酸序列为XCV-P: 5 ‘ -CCTGAAGCGAAGCTCTGCCAAGTCG-3 ‘，该探针一端标记有荧光染料，另一端标记有荧光淬灭基团。
3.如权利要求2所述的探针，其特征在于，该探针5’端标记有FAM荧光染料，3’采用 了 BHQ淬灭基团。
4.一种检测辣椒细菌性斑点病菌的方法，该方法以样品菌液为模板，利用权利要求1 所述的引物以及权利要求2或3所述的探针进行实时荧光PCR扩增，每个循环结束采集数 据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，实时荧光PCR的反应过程中的退火温度为 60 "C。
6.含有权利要求1所述引物的试剂盒。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其还包括权利要求2或3所述的探针。
全文摘要
本发明提供了一种辣椒细菌性斑点病菌检测用引物及探针，所述引物的核苷酸序列如序列表XCV-F&XCV-R所示，所述探针的核苷酸序列如序列表XCV-P所示。本发明还进一步提供了检测辣椒细菌性斑点病菌的方法，该方法以样品菌液为模板，利用上述引物和探针进行实时荧光PCR扩增，每个循环结束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。本发明探针特异性好，检测方法快速简单，准确性高，灵敏度高，为进出口安全提供了保证。
文档编号C12Q1/04GK102140499SQ201010528778
公开日2011年8月3日 申请日期2010年11月2日 优先权日2010年11月2日
发明者朱水芳, 董明明, 赵文军, 陈岩, 陈洪俊 申请人:中国检验检疫科学研究院