，增强白及种子的活力，从而提高白及种子的萌发率，且在超声振荡完成后通过拉开拉链 取出内袋，将白及种子和细砂分离，结构简单，方便实用。
[0034] 4、白及种子在热水浸泡过程中，种子内部进行一系列的修复活动，能够增强种皮 的透性，使得氧气可以顺利进入种子内，进而有利于呼吸作用的进行，同时还可以增加酶的 活性，然而单独的热水浸泡的热击处理需要一定的时间才能达到增加酶活性的效果，因此 本发明在热击处理后立即进行超声振荡，能够快速刺激代谢酶的合成和激活原有的酶，进 而提高酶的活性，节约时间，提高工作效率。
[0035] 5、聚乙烯醇能够提前启动或加强种子萌发的代谢过程和呼吸作用，提高储藏无水 解酶的活性，为种子的胚芽的迅速生长提供了大量的物质和能量，钙、镍和锌等微量元素能 够提高白及种子的活力，对白及种子后期的萌发有一定的促进作用，外袋经过了在含有聚 乙烯醇和微量元素的混合溶液中浸泡过，在超声振荡的过程中，外袋上残留的聚乙烯醇和 微量元素能够缓慢的浸入白及种子内部，进一步为白及种子提供更多的能量，使白及种子 的活力更高。
[0036] 本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本 发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
【具体实施方式】
[0037] 下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书 文字能够据以实施。
[0038]本发明筛选的白及菌根真菌为蜡壳菌目（Sebacinales sp.)菌根真菌菌株YY-51， 白及菌根真菌YY-51于2015年7月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为 GCMCC NO. 11104，白及菌根真菌YY-51的内转录间隔区核糖体DNA的多核苷酸序列为SEQ ID No. 3所示的多核苷酸序列。
[0039] YY-51的生物学特性：白及菌根真菌菌株YY-51在PDA培养基上，生长的菌落为奶油 色到淡黄色，边缘规则，呈蜡质，其菌丝匍匐在培养基表面，气生菌丝不发达，菌丝直径为 0 · 7um~1 · Ium，多个大小约为3 · Oum X 3 · 9um的球状或椭球状的念珠状细胞形成长链状的菌 丝分支。
[0040] 菌种的分子生物学鉴定:通过对菌株YY-51的ITS rDNA序列测定，将该菌ITS rDNA 片段与Genbank中序列进行比对从而确定该菌的种属，得到该菌株是一株錯壳菌目真菌。 [0041 ] 实施例1
[0042]菌株的鉴定 [0043] 一、真菌DNA的提取：
[0044]将用于分子鉴定的真菌接种到PDA培养基上，在暗室内25°C培养2周后，真菌菌落 的直径在3~5cm时，菌落表面的菌丝就可以提取DNA。
[0045] DNA提取参照真菌DNA提取试剂盒(E.Z.N.ATM Fungal DNA Kit，0mega Bio-Tek， Doraville，Georgia，USA)的使用指南进行，具体步骤如下：
[0046] 1 )、刮取50~IOOmg菌丝放入灭菌的研钵中，加入液氮冰冻，立即研磨成粉末，将研 磨好的菌丝刮到灭菌的1 ·5mL Eppendorf管中。
[0047] 2)、在Eppendorf管中加入Buffer FGl缓冲液800yL，涡旋混匀后，65°C下水浴 1 Omin，水浴过程中颠倒混匀2次。
[0048] 3)、然后加入140uL Buffer FG2,涡旋混匀后，在常温下以转速13300r/min离心 IOmin0
[0049] 4)、吸取600yL上清液到已灭菌的1.5mL离心管中。
[0050] 5)、在离心管中加入420yL的在-20°C下预冷过的异丙醇，涡旋沉淀DNA。
[0051 ] 6)、在常温下以转速10000r/min离心2min，弃去上清液。
[0052] 7)、将离心管中的沉淀DNA倒置于滤纸上，干燥DNA至没有异丙醇的味道。
[0053] 8)、干燥后的DNA中加入65°C预热的重蒸水300yL，涡旋溶解沉淀后，分别加入150μ L的Buffer FG3和300yL的无水乙醇，涡旋混匀。
[0054] 9)、用1000 yL的移液枪将液体转移到结合柱子中，以转速10000r/min离心lmin。
[0055] 10)、倒掉收集管中的液体，将结合柱换到新的收集管上，往柱子中加入700yL的 Washbuffer，洗涤DNA，以转速 10000r/min离心 Imin。
[0056] 11)、重复1次步骤10)，即倒掉收集管中的液体，往柱子中加入700yL的Wash buffer，洗涤DNA，以转速 10000r/min离心 Imin。
[0057] 12)、倒掉收集管中的液体，以转速13300r/min离心2min。
[0058] 13)、将柱子换到新的1.5mL离心管上，加入IOOyL的65°C预热的重蒸水，洗脱DNA。
[0059] 14)、盖好离心管的盖子，记号笔写上标签，保存于_20°C的冰箱中，备用。
[0060] 二、PCR 扩增
[0061] DNA提取后，通过设计的引物对特定区段进行PCR扩增，从而提高目的片段的浓度。 PCR扩增反应在EppendorfMastercycler梯度PCR仪上进行。
[0062] 本研究的引物是真菌通用引物ITS1/ITS4。ITSl的多核苷酸序列见SEQ ID No. 1， ITS4的多核苷酸序列见SEQ ID No.2,具体反应体系及反应条件如下：
[0063] 表1 50yL PCR扩增反应体系
[0065] PCR扩增反应条件：
[0066] 预变性：94°C，3min;
[0067] 变性：94°C，30s;
[0068] 退火：55°C，25s;
[0069] 延伸：72°C，30s;
[0070] 共35个循环后，72°C再延伸7min，暂时4°C保存；如保存时间在2天以上，-20°C保 存。
[0071] 三、电泳检测PCR产物
[0072] 1 )、电泳缓冲液的配制
[0073] IL母液5XTBE的配制：三异丙基乙磺酰(Tris)54g，硼酸27.5g，0.5mol/L，pH值为 8.0的乙二胺四乙酸(EDTA)20mL，ddH20定容至1L。
[0074] 0·5mol/L，pH值为8·0的乙二胺四乙酸（EDTA)的配制方法：称取186·lgNa2EDTA· 2H20，溶解于700mL的水中，调节pH值为8.0，水定容至1L。
[0075] 2)、0.8%琼脂糖凝胶
[0076]用量筒取IOOmLTBE，加入0.8g琼脂糖，微波炉完全溶解后，室温下冷却至45°C，再 加入2yL溴化乙锭(EB)，摇匀后，倒胶。
[0077] 3)、电泳条件
[0078] 每个胶孔，加入2yL的样品液，电压150V，电泳时间20~30min。
[0079] 四、测序
[0080] 电泳结束后，在紫外灯下观察，有条带的PCR产物送北京金唯智生物工程公司测 序。测序所用引物与扩增反应的相同。
[0081 ] 五、鉴定结果
[0082] 菌株YY-51代表了一个潜在的新的真菌菌种，其代表了蜡壳菌目（Sebacinales SP ·)的新种。
[0083] 实施例2
[0084] 本发明所述的快速生产白及种苗的方法，包括以下步骤：
[0085] 步骤一、菌液的制备：白及菌根真菌接种至TOA固体培养基中，控制培养温度为28 °C，暗培养10天，然后从形成的菌落边缘挑取小块，接种到共生液体培养基中进行摇床暗培 养5天，摇床转速为150r/min，培养温度为28°C，得到白及菌根真菌菌丝体的菌液；
[0086] 其中，所述共生液体培养基为燕麦培养基、麦麸培养基、土豆培养基、苹果培养基、 萝卜培养基、番薯培养基、或芋头培养基；
[0087]其中所述燕麦培养基的制作方法为:按20g/L的用量称取燕麦，加入500mL的水，煮 开后保持30min，4层纱布过滤后，定容至IL，调节pH值为5.3，即得燕麦培养基；
[0088]所述麦麸培养基的制作方法为:按20g/L的用量称取麦麸，加入500mL的水，煮开后 保持30min，4层纱布过滤后，定容至IL，调节pH值为5.3，即得麦麸培养基；
[0089] 所述土豆培养基、苹果培养基、萝卜培养基、番薯培养基或芋头培养基的制作方法 为:称取200g/L 土豆、苹果、萝卜、番薯或芋头，切成小块，开水煮30分钟，4层纱布过滤后，即 得相应的培养基，然后置于高压121°C高温条件下灭菌20min，冷却后备用。
[0090] 步骤二、共生混合体的制备：将经过预处理的白及种子接种至步骤一中得到的菌 液中，在摇床上进行共生培养，所述共生培养的条件为：摇床转速为200r/min，光照强度为 45001UX，温度为28°C，先光培养IOh，然后暗培养14h，光/暗交替培养，得到白及种子和白及 菌根真菌的共生混合体；
[0091] 其中，所述白及种子的预处理的具体操作步骤为：
[0092] 步骤a、取9~10月份的成熟的白及蒴果，用自来水洗净，然后依次用体积分数为 75 %的酒精溶液浸泡30s和质量分数为2.5 %氯酸钠溶液浸泡20min，取出白及蒴果用无菌 水冲洗3次，无菌滤纸吸干水分，切开白及蒴果，取出白及种子；
[0093] 步骤b、将所述步骤a中得到的白及种子置于1.0%体积分数的双氧水溶液中浸泡 30min，取出白及种子用无菌水冲洗3次，然后将白及种子按0.5g