专利名称：来源于干旱压力耐受性茶树的基因和引入水分压力耐受性的方法
技术领域：
本发明涉及对生物系统的水分压力耐受性有用的三个新基因SEQ ID No.1-3，所述基因在干旱条件下，在茶树中差异性表达；以及引入所述基因到生物系统中帮助形成水分压力耐受性的方法。
背景技术：
农作物表型对于很多生物和非生物因素敏感，例如，干旱压力是限制产量的重要决定因素。本发明中干旱压力是指植物中的水分含量不足以满足植物蒸腾作用的需求，从而导致表观症状发生改变，例如树叶卷曲。干旱可以通过一种重要的生理学参数——树叶水势(树叶组织中水分状态的测量)来量化。植物对水分缺乏的反应依赖于水分损失的量、损失的比例、干旱压力持续的时间、考虑的植物种类/物种、植物的发育阶段和其他环境变量，例如温度，相对湿度等等。
压力影响许多代谢途径和结构，这可能是某些基因上调或下调的结果。很多水分缺乏能诱导基因编码基因产品以预先保护细胞功能。经常能注意到的植物反应是大量积累代谢相容物，例如脯氨酸、甘氨酸三甲内盐、松醇、肉碱、甘露醇、山梨醇、多羟基化合物、海藻糖、蔗糖、寡多糖、果聚糖。这些物质是不同的化学物质，且不位于蛋白表面，因而这些蛋白优先水合。这些化合物的积累导致水势下降，以利水分移到细胞中，保持组织膨压(一种防御水分不足的机制)。
这些化合物能够稳定膜和其他大分子例如核酸和蛋白，能作为自由基的清道夫。事实上，发现过量表达负责这些化合物合成的基因的转基因植物比野生型植物在水分缺乏条件下的更具耐受性。典型的研究包括(a)过量表达枯草杆菌(枯草杆菌)SacB基因(编码果聚糖-蔗糖酶)的转基因烟草积累了几倍的果聚糖，显示在干旱压力下显著性的高生长和干重积累((Pilon-Smits，E.A.H.，Ebskamp，M.J..M.，Paul，M.J.，Jeuken，M.J.W.，Weisbeek，P.J.和Smeekens，S.C.M.(1995)Improved performance of transgenic fructan-accumulating tobacco underdrought stress.Plant Physiol.107125-130)；(b)过量表达豇豆(Vignaaconitifolia)P5CS(D-吡咯啉-5-碳酸盐合成酶，该酶参与从L-谷氨酸盐通过D-脯氨酸-5-碳酸盐生物合成脯氨酸)的转基因烟草导致脯氨酸含量增加10-18倍，显示比野生型在水分压力条件下更好的生长(Kavi，K.P.B.，Hong，Z.，Miao，G-H.，Hu C.A.A.和Verma，D.P.S.(1995)Plant Physiol.1081387-1394)；(c)表达酵母TPS1基因(合成海藻糖-6-磷酸盐合成酶)的转基因烟草积累海藻糖，并显示比野生型有更好的干旱耐受性(Holmstorm，K.O.，Mantyla，E.，Mandal，W.A.，Palva，E.T.，Tunnela，O.E.and Londesborough J.(1996)Droughttolerence in tobacco.Nature.379683-684)；(d)过量表达大肠杆菌(E.coli)betB基因(合成三甲铵乙内酯乙醛脱氢酶)的转基因烟草显示在渗透压下有更好的性状(Holmstrom，K.O.，Welin，B.and Mandal，A.(1994)Production of the Escherichia coli betaine-aldehyde dehydrogenasean enzyme required for the synthesis of the osmoprotectant glycine betaine，in transgenic plants.Plant J.6749-758)；(e)表达冰叶午时花(Mesembryanthemum crystalminum)imt1基因(合成肌醇甲基转移酶，参与D-芒丙醇生物合成)的转基因烟草显示更适于水分压力(Sheveleva，E.，Chmara，W.，Bohnert，H.J.和Jensen，R.G.(1997)Increased salt and drought tolerance by D-Ononitol production intransgenic Nicotiana tabacum.Plant Physiol.51211-1219)；(f)通过植物激素脱落酸(abscisic acid，ABA)介导，在干旱压力下产生这些渗透-保护剂。
最近发现，在8天龄的豇豆植物中，参与ABA合成的9-顺-环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase gene，NCED)在水分缺乏条件下被强烈诱导(luchi，S.，Kobayashi.，Yamaguchi-Shinozaki，K和Shinozaki，K.(2000)A stress-inducible genefor 9-cis-epoxycarotenoid dioygenase involved in abscisic acidbiosynthesis under water stress in drought-tolerant cowpea.Plant physiol.123553-562)。发现在水分压力下，马铃薯的叶和根中的NCEB mRNA都增高(Thompson，A.J.，Jackson，A.C.，Parker，R.A.，Morpeth，D.R.，Burbidge，A.and Taylor，I.B.(2000)Abscisic acid biosynthesis in tomatoregulation of dioxygenase mRNA by light/dark cycles，water stress andabscisic acid.Plant.Mol.Biol.42833-845)。
除了帮助保持水合状态的渗压剂外，干旱或渗透压力的植物会合成一些基因，该基因产生水通道蛋白和水转运蛋白，例如aquaporins家族的膜蛋白，该蛋白能够改变细胞的水势，因此防止水分缺乏(Chrispeels，M.J.和Agre，P.(1994)Water channel proteins of plants andanimal cells.Trends in Biochem Sci.19421-425；Bohnert H，J.and Jensen，R.G.(1996))。
用于在植物中产生水分压力耐受性的方法，参见TIBTECH.1489-97；Johansson，I.，Larsson，C.，Ek B.和Kjellbom，P.(1996)Themajor integral proteins of spinach leaf plasma membranes are putativeaquaporins and are phosphorylated in response to Ca and apoplastic waterpotential.The Plant Cell.81181-1191。LEA积累到高浓度也获得干燥耐受性。LEA蛋白组-3中的一种预计在细胞脱水期间螯合浓缩的离子中扮演着重要的角色。LEA蛋白组-5中的另一种预计在细胞失水期间螯合离子。水分缺乏期间，通过调节渗透压可以维持总水势。研究认为，两种蛋白——渗透蛋白和非特异性脂肪转移蛋白是由压力诱导的，在控制病原体中发生作用。非特异性脂肪转移酶下干旱条件下能被诱导(Plant A.L.，Cohen，A.，Moses，M.S和Bray，E.A.(1991)Nucleotide sequence and spatial expression pattern of a drought abscisicacid induced gene in tomato.Plant Physiol.97900-906；Toress-Schumann，S.，Godoy，J.A.and Pintor-Toro，J.A.(1992)A probable lipid transferprotein is induced by NaCl in stems of tomato plants.Plant Mol.Biol.18749-757)。
热休克蛋白也可由水分缺乏诱导(Borkird，C.，Simoens，C.，Villarroel，R.和VanMontagu M.(1991)Gene associated with water-stressadaptation of rice cells and identification of two genes as hsp 70 andubiquitin.Physiol.Plant.82449-457；Almoguera，C.和Jordano，J.(1992)Developmental and environmental concurrent expression in sunflower dry-seed-stored low-molecular-weight heat shock protein and Lea mRNAs.Plant Mol.Biol.19781-792)，其干旱期间参与蛋白的再折叠，以恢复其功能或防止蛋白聚集(Vierling E.(1991)the roles of heat shockproteins in plants.Annual review of Plant Physiol.and Plant Mol.Biol.42579-620)。
小HSP是另一种与植物干燥耐受性相关的蛋白。在种子脱水期间和再水化的前几天小HSP可能作为一种分子伴侣(Hoekstra，F，A.，Golovina，E，A.和Buitink，J.(2001)Mechanisms of plant desiccationtolerance.Trends in Plant Science.6(9)43-439)。除了热休克蛋白外，在水稻秧苗的芽中，针对盐、干旱和低温也出现了OsHSP110聚集。研究显示，两种hsp，玉蜀黍中的hsp70和大豆中的hsp27都可以被水分压力诱导(Sachs，M.M.和David Ho，T.H.(1986).Alterations ofgene expression during environmental stress in plants.Ann.Rev.PlantPhysiol.37363-376)。大部分基因表达分变化都发生在脱水期间，因此已经分离出了许多脱水特异性基因产物，但是对再水化特异性基因产物知道甚少(Bemacchia，G.，Schwall，G.，Lottspeich，F.，Salamini，F.，和Bartels，D.(1995)Molecular Characterization of the Rehydration processin the Resurrection Plant Craterostigma Plantagineum.EMBO J 14610-618)。
大部分还未知的复杂调节和信号过程控制着水分缺乏期间的基因表达。与两类蛋白，即蛋白酶和泛素降解机制有关的基因被水分不足诱导，该基因产物可能参与细胞水分损失过程中变性的蛋白的降解。同时，硫醇蛋白酶(一种参与在压力下变性蛋白降解的酶)也被水分缺乏诱导(Guerrero，F.D.，Jones，J.T和Mullet，J.E.(1990)Turgor-responsive gene transcription and RNA levels increases rapidlywhen pea shoots are wiltedsequence and expression of three induciblegenes.Plant Mol.Biol.1511-26)。
Neale，A.D.，Blomstedt，C.K.，Bronson，P.，Le，T.-N.，Guthridge，K.，Evans，J.，Gaff，D.F.和Hamill，J.D.从复苏的Sporobolus stapfianus中分离出干旱压力诱导型基因(2000.The isolation of genes from theresurrection grass Sporobulus stapfianus which are induced during severedrought stress.Plant，Cell and Environment.23265-277)。探测到基因编码一个eIF1翻译起始因子，两个干旱压力诱导型富含甘氨酸的蛋白质，一个液泡膜嵌入蛋白(tonoplast-intrinsic protein，TIP)和一个早期光诱导蛋白(early light-inducible protein，ELIP)。以前，没有发现这些基因产物和干旱压力有关。这是第一次报道提示，编码eIF1翻译起始因子的基因可能在植物干旱压力反应中起作用。
几种不同的压力可以启动相同或类似的信号转导途径。不同压力引起的水分损失自然现象可以也导致植物激素ABA聚集，已知内源性ABA含量增加能诱导某些水分缺乏诱导基因。因而ABA聚集是水分缺乏期间诱导基因的信号转导途径的步骤之一。已有报道植物中的几个蛋白激酶在各种信号转导途径的磷酸化过程(包括水分压力和ABA反应)中发生作用。
已经分离出了ABA诱导的蛋白激酶的cDNA，即pKABA1(Anderberg，R.J.和Walker-Simmons，M.K.(1992)Isolation of wheatcDNA clone for an abscisic acid-inducible transcript with homology toprotein kinases.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910183-10187)。一种新的激素盒包含基因Athb-12和Athb-7由水分缺乏和外源性ABA处理诱导，但是时程试验显示，上述两个基因由不同的方式调节(Lee，Y.H.和Chun.J.Y.(1998)A new homeodomain-leucine zipper gene fromArabidopsis thaliana induced by water stress and abscisic acid treatment.Plant Mol.Biol.37377-384)。
已有证据表面，压力诱导反应可能是由ABA介导也可能不依赖ABA(Shinozaki，K.和Yamaguchi-Shinozaki，K.(1997)Gene expressionand signal transduction in water-stress response.Plant Physiol.115327-334)。ABA介导基因反应可能要求，也可能不要求发生蛋白合成。ABA诱导rd22(与Vicia faba的一种未知种子蛋白同源的蛋白)基因的mRNA需要发生蛋白合成，因为放线酮抑制基因诱导(Yamaguchi-Shinozaki K.和Shinozaki，K.(1993)The plant hormone abscisic acidmediates the drought-induced expression but not the seed-specificexpression of rd22，a gene responsive to dehydration stress in Arabidopsisthaliana.Mol.Gen.Genet.23817-25)。
基因结构分析揭示，调节序列(顺式作用基元)asl(TGACG)和spl(GGGCGG)分别位于-463和-443位(Briggs，M.R.，Kadonaga，J.T.，Bell，S.P.和Tijan，R.(1986).Pu rification and Biochemicalcharacterization of the promoter-specific transcription factor，Sp1.Science23447-52；Lam，E.，Benfey，P.M.，Fang，R.X.和Chua N-H.(1989).Sitespecific mutations alter in vitro factor binding and change promoterexpression pattern in transgenic plants.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.877891-7894)。同时显示，这些序列分别和myb(含有Trp群基元的转录因子家族)识别元件TGGTTAG的-144和-666位点和2bHLH(基本螺旋-环-螺旋，basic helix-loop-helix，MYC)识别基元(CACATG)的-200和-191位点相似。已分离出编码MYC相关DNA结合蛋白的cDNA(rd22BP1)，其编码一68kD的蛋白，该蛋白是MYC相关转录因子的基本区域螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链基元的典型DNA结合区域。
该蛋白确实与MYC识别位点结合(Abe，H.，Yamaguchi-Shinozaki，K.，Urao，T.，Iwasaki，T.，Hosokawa，D.和Shinozaki，K.(1997)Role ofArabidopsis MYC and MYB Homologs in Drought-and AbscisicAcid-Regulated Gene Expression.The Plant Cell.91859-1868)。已经克隆了干旱和ABA诱导型基因，该基因编码MYB相关蛋白ATMYB2。rd22BP1(MYC)和ATMYB2(MYB)蛋白是rd22基因脱水和ABA诱导表达的转录活化剂(Abe，H.，Yamaguchi-Shinozaki，K.，Urao，T.，Iwasaki，T.，Hosokawa，D和Shinozaki，K.(1997).Role of Arabidopsis MYC andMYB Homologs in Drought-and Abscisic Acid-Regulated GeneExpression.The Plant Cell.91859-1868)。
与拟南芥(Arabidopsis)中的rd22相反，HVA22很少被干旱和ABA诱导，但可被放线酮诱导。HVA22的启动子区包含ABA反应复合体ABRE3，CE1和另一种ABA反应复合体，后一种复合体依赖于G盒与另一种未知偶联元件的相互作用(Shen，Q.和Ho，T-H D.(1995)Functional Dissection of an Abscisic Acid(ABA)-Inducible gene RevealsTwo Independent ABA-Responsive Complexes Each Containing a G-Boxand a novel cis-Acting Element.The Plant Cell.7295-307)。
Yamaguchi-Shinozaki K和Shinozaki，K.克隆了一个脱水反应基因rd29A，该基因不依赖于ABA反应途径(1993.Characterization of theexpression of dessication-responsive rd29 gene of Arabidopsis thaliana andanalysis of its promoter in transgenic plants.Mol.Gen.Genet.236331-340)。发现TACCGACAT序列调节干旱诱导型基因，位于其他脱水诱导型基因的启动子区。
一旦A.Thaliana中rd29a启动子控制的DREBLA(脱水反应元件结合蛋白)过量表达，那么很多压力耐受型基因就都得到表达，从而提高干旱和其他几种压力的耐受型(Kasuga，M.，Liu，Q.，Miura，S.，Yamaguchi-Shinozaki，K.和Shinozaki，K.(1999)Improving plantdrought，salt，and freezing tolerance by gene transfer of a singlestress-inducible transcription factor.Nature Biotechnology.17287-291)。
对DRE结合蛋白DREB2的另一基因的分析显示，在转基因拟南芥中其启动子在水分压力下可被诱导(Nakasiniha，K.，Shinwari，Z.K.，Sakuma，Y.，Seki，M.，Miura，S.，Shinozaki，K.和Yamaguchi-Shinozaki，K.(2000)Organization and expression of two Arabidopsis DREB2 genesencoding DRE-binding proteins involved in dehydration and high salinityresponsive gene expression.Plant.Mol.Biol.42657-665)。这些基因的表达不需要ABA，但对外源性ABA有反应。
也有对ABA处理没有反应的干旱诱导型基因，如rd21，erd1和rd19，他们分别编码硫醇蛋白酶，CIp蛋白酶和硫醇蛋白酶(Shinozaki，K.和Yamaguchi-Shinozaki，K.(1997)Gene expression and signaltransduction in water-stress response.Plant Physiol.115327-334)。事实上，有关这些基因的资料非常少。
一直需要寻找新的干旱相关基因，因此需要研究更好的改进，除了表1列出的基因和基因序列外，新的基因序列罗列如下ABRE.，ABA-反应元件(PyACGTGGC)(Shen Q和Ho.(1995)Functional Dissection of an Abscisic Acid(ABA)-Inducible gene RevealsTwo Independent ABA-Responsive Complexes Each Containing a G-Boxand a novel cis-Acting Element.The Plant Cell.7295-307)。
G-盒，普遍存在的调节元件(CACGTG).(Menkens，A.E.，Schindler，U.和Cashmore A.R.(1995)The G-boxubiquitous regulatoryDNA element in plants bound by GBF family of bZIP proteins.Trends inBiochem Sci.20506-510)。
DRE，脱水反应元件(TACCGACAT)(Shinozaki，K.和Yamaguchi-Shinozaki，K.(1996)Molecular responses to drought and coldstress.Current opinion in biotechnology.7161-167)。
MYBRS，MYB识别序列(PyAACPyPu)(Urao T，Yamaguchi-Shinozaki K，Urao S，Shinozaki K(1993)An Arabidopsis mybhomolog is induced by dehydration stress and its gene product binds to theconserved MYB recognition sequence.The Plant Cell51529-1539)。
MYCRS，MYC识别序列(CANNTG)(Abe，H.，Yamaguchi-Shinozaki，K.，Urao，T.，Iwasaki，T.，Hosokawa，D and Shinozaki，K.(1997)Role of Arabidopsis MYC and MYB Homologs in Drought-and AbscisicAcid-Regulated Gene Expression.The Plant Cell.91859-1868)。
当使用与干旱或其他压力有关的基因和基因片段(本发明上下文中的基因片段是指完整基因的部分核酸序列)时，有下列可能(a)通过表1所述的几条路线克隆基因。
表1
<p>表1-12
Holmstrom，K.O.，Welin，B.和Mandal，A.将埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)(微生物)的三甲基甘氨醛脱氢酶转移到烟草(高等植物)中，该烟草就具有干旱耐受力(1994，Production of theEscherichia coli betaine-aidehyde sakydrogonase an enzyme required forthe synthesis of the osmoprotectant glycine betaine，in transgenic plants.Plant J.6749-758)。
(c)还可以通过其他环境变化来表达干旱压力表达基因Iuchi，S.，Kobayashi，Yamaguchi-Shimuzaki，K和Shinozaki，Kazuo报道，在水分和盐压力反应下VcNCED1基因表达(2000 Astress-inducible gene for 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase involved inabscisic acid biosynthesis under water stress in drought tolerant compound.Plantphysical 123553-662)。
Pelloux J.，Jolivet，Y.，Hontaine，V.，Banvoy，J.，和Dizengromel，P.(2001 Changen in Rubieco and Rubisco activase gene expression andpolypeptide expression.)以及Richard.S.Mordancy.M.Drevet.C.Jouanin，L.和Seguin，S.(2000.Isolation and characterization of adehydrin gene from white spruce induced upon wounding，drought andcold stress.Plant Mol.Biol.43-1-10)报道，PgDhnl基因被干旱、寒冷压力和受伤诱导。
Nakashima.K.Shinwari，Z.K..Sakuma，Y..Seki.M..Miura，S，Shinozaki.K.和Yamaguchi-bninozaki.K报道，在脱水和高盐压力下有干旱反应元件DREB2基因表达(2000.Organization and expression oftwo Arabidopsis DREB2 genes encoding DRE-binding proteins involvedin dehydration and high salinity responsive gene expression.Plant.Mol，Biol 42；657-665)。
Hirayama.T..Ohto.C.Mizoguchi.T.和Shinozaki，K报道在干旱、盐和低温压力下有磷酸肌醇特异性磷脂酶C表达(1995.A geneencoding a phosphoinositol-specific phospholipase C in induced bydehydration and salt stress in Arabidopsis thaliano，Proc.Natl.Acad.Sci 923903-3907)。
Weretilnyk.E.A，.和Hanson.A.D.报道，干旱和盐压力下，有三甲基甘氨醛脱氢酶基因表达(1990.Molecular cloning of a plantbetaine-aldehyde dehydrogenase，an enzyme implicated in adaptation tosalinity and drought.Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，872745-2749)。
(d)可以用经鉴定的基因来研究调节元件。在本发明中，调节元件是指诸如启动子、转录因子和其他控制基因表达序列的区域。
Straub，P.P..Shen Q.和Ho，Tuan-hua.D使用压力调节基因HVA1分析基因启动子(1994.Structure and promoter analysis of an ABA-andstress-regulated barley gene，HVA1.Plant.Mol.Biol.26617-630)。Michel，D.，Salamini F.，Bartels，D.Dale，P.，Baga，M..和szalay，A选择干旱反应基因CdeT27-46分析其启动子区域(1993.Analysis of adesiccation and ABA-responsive promoter Isolated from the resurrectionplant Craterostigma plantagineum.Plant Journal 429-40)。
Urao T.Yamaguchi-Shinozaki K.Urao S.Shinozaki K确定了编码脱水反应基因Atmyb2的转录因子的序列(1993.An Arabidopsis mybhomolog is induced by dehydration stress and its gene product binds to theconserved MYB recognition sequence.Plant Cell 51529-1539)。同时Yamaguchi-Shinozaki.K和Shinozaki，K.分析了干旱诱导基因rc的启动子区域(1997，Characterization of the expression of adesiccation-responsive rd29 gene of arabidopsis thaliana and analysis of itspromoter in transgenic plants.Mol Gen Genet 236331-340)。
Abe.H.，Yamaguchi-Shinozaki.K..Urao，T..Iwasaki，T..Hosokawa.D和Shinozaki.K.分析了干旱诱导基因rd22的调节因子(1997.Role ofArabidopsis MYC and MYB Homologs in Drought-and AbscisicAcid-Regulated Gene Expression.The Plant Cell.91859-1868)。
Shen Q和Ho T.D分析了HVA22基因的调节元件，并且报道了新的偶联元件(1995.Functional Dissection of an Abscisic Acid(ABA)-Inducible gene Reveals Two Independent ABA-ResponsiveComplexes Each Containing a G-Box and a novel c/s-Acting Element.ThePlant Cell.7295-307)。
(e)将从一系统中分离的基因或基因片段作为研究其他植物系统中相似基因的探针Roberts，J K和Key.J.L使用从果蝇(Drosophila)中克隆的hsp70基因来克隆大豆的相似基因(1991.Isolation and characterization of asoybean hsp70 gene.Plant molecular biology，16671-683)。
Singia.S.L..Pareek A和Grover的研究显示，酵母hsp KM和大米hsp 110非常相似(1997 Yeast HSP104 homologue rice HSP 110 isdevelopmental-and stress regulated.Plant science，125211-219)。这些基因在干燥、盐、低温和高温下表达。
Shen，Q.Chen，C.N.Brands，A..Pan.S.M.和Ho，T.D报道干旱诱导基因HVA22在几种有机体种存在，如谷类，拟南芥，线虫(Caenorhabitis elegans)，人类，鼠类和酵母(2001 The stress-andabscisic acid-induced barley gene HVA 22developmental regulation andhomologues in diverse organisms.Plant Molecular Biology.45327-340)。
(f)可以将在一个组织中表达的基因在另一组织中表达，如表2所示表2
(g)使用标准方案来克隆全长cDNAs或基因组DNA是可能的，技术详述参见Ausubel.F.M.Brend R..Kingston.R.E.，Moore.D.D..Seidman.J.G..Smith，J.A.，Struhl.K于1987编的Current protocols inmolecular biology以及纽约的出版商John Wiley和Sons及Sambrook.J.Fritsch，E.F和Maniatis.T于1989年出版的Molecular cloning；alaboratory manual，Second edition.Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，N.Y.。
各种干旱基因相关基因的简要说明见表3表3各种干旱相关基因、其来源和预期功能
<p>表1实施例11a产物的X-射线粉末衍射图样如下，以d间距表示。
实施例11b2-(R)-(4-氟-2-甲基-苯基)-4-(S)-((8aS)-6-氧代-六氢-吡咯并[1，2-a]-吡嗪-2-基)-哌啶-1-羧酸[1-(R)-(3，5-双-三氟甲基-苯基)-乙基]-甲基酰胺盐酸盐为二水合物结晶形式向265mg实施例11a加入3ml水。将悬液在25℃下搅拌过夜，然后在10000rpm下离心5分钟。利用离心过滤装置(Millipore Ultrafree-MC 0.45μm)过滤固体，得到标题化合物(250mg)。
X-射线粉末衍射数据报告在表2中。
参考文献见(1)Yamaguchi-Shinozaki，K.和Shinozaki，K.(1994)The PlantCell.6251-264；该文献描述了拟南芥模式植物中参与干旱、低温和高盐反应的新顺式作用元件的鉴别。
(2)Li，L.g.，Li，S.f.，Tao，Y.，和Kitagawa，Y.(2000)PlantScience 15443-51，该文献从大米中克隆了新的水通道蛋白，该蛋白显示其与爪蟾卵母细胞的寒冷耐受性有关。
(3)Tabaeizadeh、Zohrer、Yu、Long-Xi、Chen、Ri-Dong于1997年8月12日提交的美国专利No.5,656,474，该文献从干旱压力Lycopersicon chilense植物的树叶中分离和鉴别了两个内切几丁质酶基因家族的渗透压力和ABA反应成员。
(4)Kim、Soo Young于2001年6月21日提交的美国专利No.6,245,905，该文献从从植物中分离了编码脱落酸反应元件结合因子2(ABF2)的核酸分子。
(5)Kim、Soo Young于2001年4月17日提交的美国专利No.6,218,527，该文献从植物中分离了编码脱落酸反应元件结合因子3(ABF3)的核酸分子。
(6)Thomshow、Michael F.、Stockinger、Eric，J.于1999年4月6日提交的美国专利No.5,892,009，该文献克隆了CBF1基因，该基因编码CBF1蛋白，与调节植物中低温和脱水耐受性促进基因表达的区域连接。
(7)Chun、Jong-Yoon、Lee、Yong-Hun于1999年11月9日提交的美国专利No.5,981,729，该文献克隆了水分缺乏和脱落酸诱导型的新基因。
现有技术的缺点在于a.早期克隆干旱压力基因的工作集中于植物系统模型，大部分是一年生植物。终年常绿的植物，如茶，在生命周期中可以经历几个循环的干旱压力。因此，该植物预期存在新的参与植物干旱耐受的基因。
b.坚持不懈地寻找新基因，并利用其来生产更多的干旱耐受植物。植物模型，例如阿拉伯芥和其他表1所述家养植物已被用来克隆干旱相关基因。期望从其他至今未研究的植物中产生新的基因。
c.已报道的克隆干旱相关基因的方法依赖于cDNA文库差异性筛选方法，差异性cDNA文库分析和扣除杂交(参见表1、2和3)。这些方法在同一时间分析两个样本有其固有的局限性。因此，在鉴别和克隆差异性表达基因后，通常通过该基因在恢复期或在对其他变化，例如盐压力/ABA处理的反应过程中来检测其表达。因此，需要应用合适的方法在一开始就关注该期望基因。
上述缺陷可以首次以本发明所述的一种简单和可靠的方式而克服，该方法对于本领域技术人员是非显而易见的。
本发明的发明目的本发明的主要目的是克隆经历干旱压力后在茶树叶中表达的新基因。
本发明的另一个目的是克隆经历干旱压力但仍存在于整个植物的在茶树叶中表达的新基因。
本发明的另一个目的是鉴别经历干旱压力后在茶树叶中表达的新基因。
本发明的另一个目的是克隆经历干旱压力后在茶树叶中被抑制的新基因。
本发明的另一个目的是产生经历干旱压力后(相对于灌溉好)在茶树叶中表达和抑制的基因谱，以鉴别差异性表达基因，并克隆该基因。
本发明的另一个目的是生产经历干旱压力和ABA处理后在恢复和良好灌溉条件下(良好灌溉条件是指应用大量的水分让植物维持其水势)茶树第4叶表达和抑制的基因谱，以鉴别差异性表达基因，并克隆该基因。
本发明的进一步发明目的是以水势量化压力。
本发明的另一个目的是研究干旱压力下生理学活性的改变。
本发明的另一个目的是确定干旱耐受性茶树的基因组可变区的位置。
本发明的另一个目的是确认差异性表达基因的经鉴定的3’端以证实经历干旱压力的茶树叶相对于良好灌溉的茶树发生差异性表达。
本发明的另一个目的是在脱落酸条件下和恢复期间对经鉴定基因进行表达研究。本发明中恢复是指当干旱压力植物被灌溉，其水势等于良好灌溉对照植物的水势。
本发明的另一个目的是克隆差异性表达基因的经鉴定的3’端。
本发明的另一个目的是对克隆基因的经鉴定的3’端进行测序。
本发明的另一个目的是在资料库中比较克隆基因的序列。
本发明的另一个目的是提供一种通过所述新基因向生物系统中引入水分压力耐受性的方法。
本发明的另一个目的是提供一种通过所述新基因向茶树中引入水分压力耐受性的方法。
发明概述本发明涉及三个新基因，SEQ ID No 1-3，其有利于生物系统的水分压力耐受性，所述基因在干旱条件下在茶树中差异性表达，及其引入所述基因到生物系统中帮助其形成水分压力耐受性的方法。
发明详述本发明涉及三个新基因，SEQ ID No 1-3，其有利于生物系统的水分压力耐受性，所述基因在干旱条件下在茶树中差异性表达，及其引入所述基因到生物系统中帮助其形成水分压力耐受性的方法。
本发明的一个具体实施方案中，显示差异性表达的三个新基因如下DS31(T11G，AP65)——SEQ ID NO.1DS61(T11A，AP1)——SEQ ID NO.2DS103(T11A，AP65)——SEQ ID NO.3括号中的是用于克隆基因的各种引物组合物。这些引物的详细说明在实施例4中作详细说明。
DS31(T11G，AP65)基本上是基因3`端的区域，northern印迹中能和1.5kb大小的转录物杂交，如附图7所示。
DS61(T11A，AP1)基本上是基因3`端的区域，northern印迹中能和750bp大小的转录物杂交，如附图7所示。
DS103(T11A，AP65)基本上是基因3`端的区域，northern印迹中能和1.9kb大小的转录物杂交，如附图7所示。
每个克隆都用M/s的T7测序版本2测序试剂盒手工测序，使用Amersham Pharmacia Biotech，USA的测序引物[Lgh(5′-CGACAACACCGATAATC-3′)或Rgh(5′-GACGCGAACGAAGCAAC-3′)]。
本发明另一个具体实施方案中，所述基因的序列为SEQ ID NO1资料(i)序列特征
(A)长度318bp(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑环形(ii)分子类型cDNA(iii)序列描述SEQ ID NO1基因数和详细资料DS31(T11G，AP65)，括号中的术语是引物组合物，引物组合物的详细说明见实施例4。
下划线所示为引物aagc ttcaagaccaatcaatatt gttgcactca tgggcctggg atcatgtggg cctggatcat gtgggcctacacctttgtcc aagttcttca aggataggtg cccagatgct tatagctatc ctcaggatga tccaaccagt ttgttcacttgtcctcctgc tggtaccaat tattgcctat accttctgcc cttgaggcct ctttttcact cccttccctc tctttataattataggacag tgttatagta caataagacc tcactagttt caatatttgt gagattcaga cactgtgttt aattaaatttgtgacattta gtgttgtccaaaaaaaaaaa gcttSEQ ID NO2资料(i)序列特征(A)长度251bp(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑环形(ii)分子类型cDNA(iii)序列描述SEQ ID NO2
基因数和详细资料DS61(T11A，AP1)，括号中的术语是引物组合物，引物组合物的详细说明见实施例4。
下划线所示为引物aagc ttgattgccaataagaagg ggtcttgact agcccctgtt atatgagacg tgaggagcga tggcgatgacgatgatgacg atgatgatgt tggtgtggca gccagccgca taactttttt cagttttgat tgtctaaggt tttgatatgttaatggtcag ctaagcaaat acatgagctc atatatteag tacttggcat ataaataacc tgtcttgcta ttcatattaatgttctagat atgataatca ccttctctctctaaaaaaaa aaagcttSEQ ID NO3资料(i)序列特征(A)长度361bp(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑环形(ii)分子类型cDNA(iii)序列描述SEQ ID NO3基因数和详细资料DS103(T11A，AP65)，括号中的术语是引物组合物，引物组合物的详细说明见实施例4。
下划线所示为引物aagc ttcaagaccatcggcaaca gatgttgaaa ctcaccttac actaatgtgt ccagatcttc tcaacaggaattctagcaac cgaggacacc actatgatgt gtccagctct tctcaacagg aattgtagca atttagacaa ccgaggacaccactatacat acatacaagc atggttttaa ataaagcgtt cacatagctg atatcagata ctattgacgt gcagatattgttgaatatcg gtatcaatat tttaaaacca tgcatatgag agttcaacac aagttagaag ctctcttttg ttttcattttacaagtttgt gtaatttgat gtaagagcaa aagcttagta tatgtaatga gaattttgaactaaaaaaaa aaagctt
在本发明的一个具体实施方案中，所述基因为SEQ ID No.1-3。
在本发明的另一个具体实施方案中，所述SEQ ID No.1的基因的长度为318bp。
在本发明的另一个具体实施方案中，所述SEQ ID No.2的基因的长度为251bp。
在本发明的另一个具体实施方案中，所述SEQ ID No.3的基因的长度为361bp。
在本发明的另一个具体实施方案中，所述基因是环形的。
在本发明的另一个具体实施方案中，所述基因在水分缺乏压力下在茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)中差异性表达。
在本发明的另一个具体实施方案中，涉及鉴别水分缺乏压力下在茶树中差异性表达的基因SEQ ID No.1-3的方法。
在本发明的另一个具体实施方案中，涉及从在正常和干旱条件下生长的植物中分离总mRNA。
在本发明的另一个具体实施方案中，涉及逆转录所述mRNA获得相应的cDNA。
在本发明的另一个具体实施方案中，涉及对cDNA测序。
在本发明的另一个具体实施方案中，涉及用所述cDNA序列确定差异性表达基因。
在本发明的另一个具体实施方案中，涉及用双脱氧链终止法进行cDNA序列。
在本发明的另一个具体实施方案中，涉及使用逆转录酶将mRNA逆转录为cDNA。
在本发明的另一个具体实施方案中，涉及所述基因在茶树叶中差异性表达。
在本发明的另一个具体实施方案中，涉及显示植物mRNA链的3`端差异性表达的方法。
在本发明的另一个具体实施方案中，所述植物是茶树(Camelliasinensis(L.)O.Kuntze)。
在本发明的另一个具体实施方案中，所述差异性表达通过Northern印迹确定。
在本发明的另一个具体实施方案中，涉及通过基因SEQ ID No.1-3向植物系统中引入缺水压力耐受性的方法，该方法包括转移所述基因到所述系统中的步骤。
在本发明的另一个具体实施方案中，所述基因转化技术选自包括农杆菌属(Agrobacterium)和基因枪介导的转化技术。
在本发明的另一个具体实施方案中，用所述方法调整所述压力耐受性。
在本发明的另一个具体实施方案中，涉及用所述基因制备探针来鉴定对在水分缺乏压力下生长具有耐受性的植物系统。
在本发明的另一个具体实施方案中，其中所述基因用于在干旱条件下产生耐受性。
在本发明的另一个具体实施方案中，其中所述基因用于产生抗干旱耐受性。
在本发明的另一个具体实施方案中，所述的SEQ ID No.1-3负责植物中的水分压力耐受性。所述基因独立或联合向植物中引入干旱耐受性。所述基因从茶树叶中分离得到。
在本发明的另一个具体实施方案中，所述基因在植物中是稳定的。基因在启动子和调节元件的辅助下，能在所有植物系统中表达。该基因能给所有植物引入干旱耐受性，尤其是整合了该基因的茶树。
在本发明的另一个具体实施方案中，观察到所述基因在植物系统的2/3代中一致表达。所述基因表达在2/3后代中一致。
在本发明的另一个具体实施方案中，发现所述基因对于转化了该基因的植物的正常功能没有副作用。
在本发明的另一个具体实施方案中，克隆在经历干旱压力的Camellia sinensis(L.)O.Kuntze(下文称之为茶)叶中表达的新基因。具体地，本发明涉及比较水分压力下和良好灌溉的2年生茶树的第4叶的基因表达方式，以确认和克隆该差异性表达基因。具体地，本发明还涉及新的基因末端的3引物(此后称作3`)的确认、克隆和分析(本发明中基因是指脱氧核糖核酸(下文称作DNA)的部分，其能产生信使核糖核酸(下文称为mRNA))，该基因在经历干旱压力的茶树的第4叶中表达。3`端是指mRNA的聚-A尾巴非常靠近的一端。
在本发明的另一个具体实施方案中，本发明涉及在干旱压力调节下的茶树中的三个新基因的克隆，该克隆方法包括●在经历干旱压力的茶树的第4叶中表达的新的基因序列●在经历干旱压力的茶树的第4叶中被抑制的新的基因序列
●第4叶中表达或抑制的基因的3’端图谱，以鉴别差异性表达基因和克隆基因●确认差异性表达基因的经鉴定的3’端以证实茶植物中的差异性表达，和●克隆的差异性表达基因3’端的序列信息在本发明的另一个具体实施方案中，选择2年生茶树克隆TV78，其生长在Himalayan Bioresource Technology，Palampur研究所的试验农场中(32°06′32″N；76°33′43″E；高度1300m)。所有的植物都是从一个亲本无性繁殖而来，以确保所有研究植物的遗传同质性。因此，观察到的因为处理而发生改变的基因表达能反应处理的效果，而不是基因的异质性。植物在塑料罐中培养(14.5cm高×15cm顶直径×9cm低直径)。一个罐中只有一个植物。
在本发明的另一个具体实施方案中，所有植物都在温室中生长，以确保温度和湿度的相对一致性。所有试验均采用从顶部数第4节点的张开的叶子(平均长度9.5±0.19cm；平均宽度3.65±0.1cm)。在试验期间，第一、二和三叶子的叶面积发生改变，而使基因表达产生生长相关改变，但第四叶的面积却保持稳定，平均长度9.5±0.19cm；平均宽度3.65±0.1cm。因此本发明选择第四节点的叶子。第五节点的叶子相对于第四节点的要老一些。本发明的整个策略是选择一些节点的叶子，这些节点的叶子相对年轻，其生长变化可以忽略或最小。
在本发明的另一个具体实施方案中，对照植物正常地灌溉，而在处理点处抑制水分而产生干旱。每隔2天用棉签将ABA(5mM)施到植物的近轴和离轴面上，和用于ABA处理的植物的根部(2ml)。正常灌溉的植物作为对照。干旱14天后正常给水以用于恢复试验。
在本发明的另一个具体实施方案中，各种参数采集时间为处理后0、7、14和18天。用于差异显示和northern印迹的树叶样本在第14天(对照组、干旱和ABA处理)和18天(恢复试验)采集。树叶用焦炭酸二乙酯(以下称之为DEPC)处理液洗涤，[DEPC处理液的制备如下将DEPC加入到蒸馏水中，终浓度为0.1％，孵育，过夜，然后高压灭菌(即加热到121℃，压力1.1kg/cm2)]，收集，然后立即浸入液氮中，冻结细胞结构以终止细胞活性。
在本发明的另一个具体实施方案中，涉及经历干旱的茶树的第4叶中表达的基因的新3引物(以下称之为3’)端的鉴别、克隆和分析。
在本发明的另一个具体实施方案中，涉及经历干旱的茶树的第4叶中被抑制的基因的新3’端的鉴别、克隆和分析。
在本发明的另一个具体实施方案中，涉及从CO、DS、RC和AB叶中分离总mRNA，采用“差异显示技术”来产生在CO、DS、RC和AB叶中表达和抑制的基因的3’端图谱[Liang，P.，Zhu，W.，Zhang，X.，Guo，Z.，O′Connell，R.，Averboukh，L.，Wang，F.and Pardee，A.B.(1994).Differential display using one-base anchored oligo-dT primers.NucleicAcids Res.22(25)5763-5764]。
在本发明的另一个具体实施方案中，涉及将DS茶树芽中表达的基因的3’端连接到载体中，以产生重组质粒，将该质粒转化到合适的大肠杆菌宿主中而产生克隆。本发明的载体是指能够接受外源DNA的DNA序列，呈现环形质粒DNA形式，对给定抗生素具有耐受性。
在本发明的一个有利的具体实施方案中涉及将DS茶树芽中被抑制的基因的3’端连接到载体中，以产生重组质粒，将该治质粒转化到合适的大肠杆菌宿主中而产生克隆。
在本发明的另一个具体实施方案中，检测CO、DS、RC和AB叶中表达或抑制的基因，以确定他们与干旱压力的相关性。
在本发明的另一个具体实施方案中，用双脱氧链终止方法对基因进行测序以计算基因的单值性(Sanger，F.S.，Nicklen，and A.R.，Coulson(1977)DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.Proc.Natl.Acad.Sci.USA745463-5467)。
在本发明的另一个具体实施方案中，所述的新的三个基因SEQ IDNo 1-3，该基因负责植物水分压力耐受性。所述的基因独立或联合地向植物引入干旱耐受性。所述基因是从茶树叶中分离的代。
在本发明的另一个具体实施方案中，所述基因在植物系统中是稳定的。发现在其启动子和调节元件的帮助下，该基因在所有植物中都能表达。该基因能给所有植物引入干旱耐受性，尤其是整合了该基因的茶树。
在本发明的另一个具体实施方案中，观察到所述基因在植物系统的2/3后代中一致表达。所述基因表达在2/3后代中是一致的。
在本发明的另一个具体实施方案中，发现向植物导入该基因后，对植物正常功能没有任何副作用。
附图的简要说明
图1显示了经过ABA(AB)处理、控制水分产生干旱压力(DS)和随后在第14天给水(RC)的2年龄的茶树第4叶的水势(A)，光合作用率(B)和Fv/Fm比率(C)。四个不同测试数据以均数±标准差表示。
图2显示了茶树第4叶中分离的总mRNA。附图的缩写分别表示CO，从良好灌溉的对照组中分离的RNA；DS，从干旱压力植物中分离的RNA；RC，从恢复植物中分离RNA；AB，ABA处理的植物中分离的RNA；M，代表RNA标记。
图3显示了CO、DS、RC和AB处理后在第4叶中表达和抑制的基因的3’端的图谱，使用的启动子组合如每条线底部所示，箭头表示差异性表达。
图4显示了CO、DS、RC和AB处理后在第4叶中表达和抑制的基因的3’端的图谱，使用的启动子组合如每条线底部所示，箭头表示差异性表达。
图5显示了从变性聚丙烯酰胺凝胶中洗脱的差异性表达的基因3’端的扩增，M代表DNA大小标记。
图6显示了如图5所示的洗脱的差异性表达的基因3’末端的克隆的扩增，M代表DNA大小标记。
图7显示了通过northren杂交克隆基因的3’端来确认差异性表达。
下述具体实施方案将更详细地描述本发明。但具体实施方案仅仅是为了说明，而不应该认为是对本发明的限制，本发明的范围以权利要求为准。
实施例实施例1经过ABA(AB)处理、控制水分产生的干旱压力(DS)以及随后在第14天再给水(RC)的2年龄的茶树第4叶的水势(A)，光合作用率(B)和Fv/Fm比率(C)。
水势(以下以ψ表示)用干湿计测量(露点微伏特计，模式HR33T，Wescor USA)。叶盘(直径0.5cm)用锋利的纸张打孔机打孔，随即放入样本室(C-52；Wescor，USA)中。平衡30min后，获得冷却系数值(单位微伏)。将该值除以0.75(正比常数，将获得的值转换为“巴(bar)”，ψ的单位)获得ψ值。干湿计的所有单位校准为25℃，非25℃温度下，以下公式进行校正新温度下的冷却系数＝0.7(新温度摄氏度值-25℃)+25℃下的冷却系数标准值(厂家提供)。
光合作用率用便携式光合作用系统(Li-6400，Li-COR，Lincoln，Nebr.，USA)测定。使用厂家提供的蓝-红LED装置维持光强度常数1000μEm-2s-1，并使用相同厂家提供的Peltier冷却和加热装置以维持室温度为25℃。
使用植物压力计(PSM Mark II，Biomonitor，Sweden)测量叶绿素荧光诱导动力学参数。在使用峰值为500nm光化性光激活叶绿素之前，使用黑暗适应夹使叶子适应黑暗。Fv/Fm率，表示光合系统II的光化学效率，按厂商说明记录。
CO和RC植物的树叶表型是扁平和张开的，而DS和AB植物的叶部分是卷曲的，这是植物的干旱反应特征。对照组的参数，如ψ、A和Fv/Fm在试验期间都保持不变(附图1)。而且，对照组的第4叶的叶面积在试验期间也保持不变。
在水控制点处，在7天里，ψ降低了23.4％，在14天里，该值降低了87.2％。A值分别降低了15.5％和62.9％；而Fv/Fm分别降低了0.56％和52.5％。在ABA处理的实施例中，ψ分别在7天里和14天里降低了16.5％和52.5％；A值分别降低了22.5％和57.7％；而Fv/Fm分别降低了1.8％和44.2％。上述降低值是相对于零值的那天而言(附图1)。
在恢复试验中，ψ、A和Fv/Fm的值和对照组非常相似。
因此，该试验显示，茶树有很大的能力恢复其ψ、A和Fv/Fm所示的正常功能，尽管其经历了严重的干旱，ψ只有零值那天的12.8％。而且，在特定的ψ处，该数据能量化基因表达模式。
实施例2RNA的分离，用DNase 1消化RNA，RNA的定量和凝胶电泳为确保CO、DS、RC和AB茶树叶的核糖核酸(以下称之为RNA)的高质量，使用RNeasy植物迷你试剂盒(购自M/s.Qiagen，Germany)。根据商家说明分离RNA。用260nm吸收率对RNA进行定性，测定260nm和280nm的吸收比率对其纯度进行监控。260nm/280nm的比值A＞1.8就达到本发明需要的目的。以下是计算RNA浓度和产出的公式RNA浓度(μg/ml)＝A260(260nm处的吸收率)×40×稀释因子总量(μg)＝浓度×原料RNA样本体积检查RNA的完整性将5-6μgRNA溶于4.5μlDEPC处理的高压灭菌水中，用15.5μl的M1溶液稀释(2μl的5×MOPS缓冲液，3.5μl甲醛，10μl甲酰胺[5×MOPS缓冲液300mM乙酸钠，10mM MOPS(3-{N-吗啉}丙磺酸)，0.5mM乙二胺四乙酸(EDTA)])，65℃，孵育15min。加入2μl甲醛凝胶上样缓冲液[50％甘油，1mM EDTA(pH，8.0)，0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯苯胺FF]，将RNA上样到1.5％的甲醛琼脂糖凝胶中进行电泳，电压72v，1×MOPS缓冲液(60mM乙酸钠，2mM MOPS，0.1mM EDTA)，操作如Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniatis，T.1989(Molecular CloningA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Plainview，N.Y.)所述。
微粒去除残留DNA，将RNA(10-15μg)用10单位的DNase I在1×反应缓冲液[10×反应缓冲液100mM Tris-Cl(pH，8.4)，500mMKCl，15mM MgCl2，0.01％凝胶]中消化，37℃孵育30min(MessageClean试剂盒，购自M/s.GenHunter Corporation，USA)。加入PCI(苯酚、氯仿和异戊醇比例为25∶24∶1)沉淀DNase I，在0.3M乙酸钠存在的情况下加入3倍体积的乙醇沉淀水相中的RNA。-70℃孵育3小时，将RNA沉淀用冷的70％乙醇清洗，最后溶解在10μl无RNA酶的水中。将获得的无DNA的RNA进行量化，如上方法测定其完整性，RNA性质如附图2所示。
需要大量的RNA时，我们使用改良的盐酸胍方法(Lal，L.，Sahoo，R.，Gupta，R.K.，Sharma，P.和Kumar，S.Plant Molecular BiologyReporter 19181a-181f)。
除了上述方法，也可以使用其他方法分离茶树第4叶的RNA。
实施例3逆转录(以下称之为RT)将mRNA转化为互补DNAs(以下称之为cDNAs)将来自CO、DS、RC和AB样本的无DNA的RNA 0.2μg使用公知的逆转录酶各自反应产生cDNAs。反应如下0.2μM T11M引物(T11M中的M可以是T11A，T11C或T11G)，20μM dNTPs，RNA和RT缓冲液[25mM Tris-Cl(pH，8.3)，37.6mM KCl，1.5mM MgCl2和5mMDTT]。在本发明中，dNTP是指脱氧三磷酸核苷，包括脱氧三磷酸腺苷(以下称之为dATP)、脱氧三磷酸鸟苷(以下称之为dGTP)、脱氧三磷酸胞苷(以下称之为dCTP)和脱氧三磷酸胸苷(以下称之为dTTP)。根据每个RNA样本的相应T11M设定三个RT反应。该反应在温度循环仪(型号480，购自M/s Perkin-Elmer，USA)中进行。逆转录的参数是65℃，5min，→37℃，60min，→75℃，5min，→4℃(直到去除样本)。37℃孵育10min后加入100单位逆转录酶，反应50min。4个不同的RNA样本和3个T11M产生12个反应体系，得到12个不同的cDNA组。根据锚定碱基的M的不同(A，C或G)将总的RNA分为三个亚组(逆转录系统是RNAimage试剂盒的一种成分，该试剂盒购自M/s.GenHunter Corporation，USA)。
实施例4通过mRNA差异显示产生差异性表达基因图谱以鉴别差异性表达基因将实施例2得到的CO、DS、RC和AB的RT产物的不同cDNA亚组进行聚合酶链反应(以下称之为PCR，该方法由Hofftnan-LaRoche Inc的专利揭露)扩增，以放射性标记dATP标记扩增产物。放射性PCR操作如下20μl反应混合物包括(1)反应缓冲液[10mMTris-Cl(pH，8.4)，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.001％凝胶]，(2)2μMdNTPs，(3)0.2μM T11M和(4)0.2μM随机引物(化合物1-4从M/s.GenHunter Corporation，Nashville，USA购得，作为RNAimage试剂盒的一部分)，0.2μlα[33P]dATP(～2000Ci/mmole，购自JONAKI Center，CCMB campus Hyderabad，India)，和1.0单位Thermus aqueticus(以下称之为Taq)DNA聚合酶(购自M/S.Qiagen，Germany)。30μl无菌矿物油覆盖在各反应顶部以防止蒸发而导致体积改变。每个反应的T11M引物与合成cDNA中所用的相同。参数选择如下40循环，94℃，30s，→40℃，2min，→72℃，30s；一个循环72℃，5min；最后4℃孵育。
将扩增产品加到6％变性聚丙烯酰胺凝胶中进行分级。为此，将3.5μl每种扩增产品与2μl上样染料[95％甲酰胺，10mM EDTA(pH，8.0)，0.09％二甲苯靛FF和0.09％溴酚蓝]混合，80℃孵育2min，上样到6％的变性聚丙烯酰胺凝胶[变性聚丙烯酰胺凝胶15ml丙稀酰胺(40％的丙稀酰胺和双丙稀酰胺原料比例20∶1)，10ml of 10×TBE，40ml蒸馏水和50g尿素]中电泳，1×TBE缓冲液[10×TBE108g Tris碱，55g硼酸和40ml 0.5M EDTA(pH，8.0)]作为跑胶缓冲液，60w，直到二甲苯靛(移动更慢的燃料)到达玻璃板的下端。测序胶的大板子的尺寸是13×16英尺。电泳后，去除一块玻璃板，将凝胶转移到3MM Whattman滤纸上，凝胶真空干燥，80℃过夜。用柯达X胶片曝光2-3天。曝光前，在干燥凝胶的四角用放射性墨水标记，以利进一步排列。图3-4显示CO、DS、RC和AB茶树第4叶的差异性表达基因图谱，显影后，将胶片用于分析CO、DS、RC和AB信号条带。
用于差异显示的引物序列如下(购自M/s.GenHunter Corporation，USA，作为RNAimage试剂盒的一部分)T11M(锚定)引物 引物序列T11A5′-AAGCTTTTTTTTTTTTTA-3′T11C5′-AAGCTTTTTTTTTTTTTC-3′T11G5′-AAGCTTTTTTTTTTTTTG-3′随机引物引物序列AP1 5′-AAGCTTGATTGCC-3′AP365′-AAGCTTCGACGCT-3′AP375′-AAGCTTGGGCCTA-3′AP655′-AAGCTTCAAGACC-3′
AP665′-AAGCTTGCCTTTA-3′AP675′-AAGCTTTATTTAT-3′AP685′-AAGCTTCTTTGGT-3′实施例5cDNA探针的再扩增同样，差异性表达带克隆需要从变性聚丙烯酰胺凝胶中洗脱并进一步扩增以产生大量的DNA用于克隆。放射自显影相片(曝光的X射线胶片)用干胶与放射性墨水定位。用无菌锋利剃刀切割确认的差异性表达条带(与凝胶和滤纸一起)。在离心管中，100μl无菌水孵育10min以洗涤凝胶和滤纸的DNA，随后煮沸10min。10,000rpm离心2min，使滤纸和凝胶碎片沉淀，把包含DNA的上清夜转移到一新管中。用10μl 3M乙酸钠，pH，5.5，，5pl肝糖原(原料浓度10mg/ml)和450μl乙醇沉淀DNA。-70℃孵育过夜，然后4℃离心，10,000rpm，10min，沉淀DNA以85％乙醇洗涤。DNA沉淀溶于10μl无菌蒸馏水。
洗脱的DNA用与实施例4相同的T11M和随机引物进行扩增。而且，除了dNTP的浓度以20μM代替2μM且不加入同位素外，其他PCR条件相同。反应上调到40μl，PCR完成后，30μl PCR样品在1.5％琼脂糖凝胶上在包括溴乙啶的TEA缓冲液中(TAE缓冲液0.04MTris-乙酸，0.002M EDTA，pH8.5)(终浓度0.5μg/ml)(参见附图5)跑胶。得到的扩增产品在-20℃保存，以便克隆。
实施例6再扩增PCR产品的克隆用200单位T4DNA-连接酶在1×连接缓冲液中(10×连接酶缓冲液500mM Tris-Cl，pH7.8，100mM MgCl2，100mM DTT，10mM ATP，500[mu]g/ml BSA)将实施例4获得的再扩增PCR产品连接到300ng称之为PCR-TRAP载体的插入预备载体中。载体和其他需要的化合物购自M/s.GenHunter Corporation，Nashville，USA，用于PCR-TRAP克隆系统。连接操作在16℃在热循环480(购自M/s.Perkin Elmer，USA)中进行16小时，PCR产物连接到载体，如上述载体中产生环化质粒。将外源DNA，例如本发明的PCR产物连接到合适的载体，例如PCR-TRAP载体的方法即为公知的克隆。可以使用其他商业上可得的适于PCR产物克隆的载体。如前所定义的那样，质粒是一封闭的环形DNA分子，该载体存在于合适的宿主中，例如大肠杆菌埃希氏大肠杆菌(以下称之为大肠杆菌)中的独立染色体DNA，并可以赋予宿主抗生素耐受性。PCR-TRAP载体生成的质粒赋予抗四环素耐受性。
连接的产品或质粒需要置于合适的大肠杆菌宿主中以便增殖和繁殖，通过转化方法。上述连接产品10μl用于转化100μl感受态大肠杆菌细胞(购自M/s.GenHunter Corporation USA，作为PCR-TRAP(R)克隆系统的一部分)。所谓感受态是指该大肠杆菌细胞能够接受质粒DNA。为此，将要连接的产品于感受态细胞混合，冰浴45min；剧烈加热2min；在0.4ml LB培养基中培养4小时(LB培养基1L蒸馏水/去离子水中含有10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠)。将200μl转化细胞涂布在LB-四环素(1L中含10g氯化钠和四环素，终浓度20μg/ml)平板上，37℃生长过夜。形成克隆，将单个分离克隆重划线到LB-四环素平板上培养以获得相同类型的克隆。显然，四环素耐受性转化到大肠杆菌细胞明显地表面PCR产物，即确认的基因被克隆。
在上述整个过程中，T11M引物的选择使mRNA的聚A尾巴区得到扩增。聚A尾巴总是附于基因的3`端，因此T11M引物和随机引物总是产生基因的3`区。
实施例7检测PCR产物大小一旦基因被克隆和大肠杆菌被转化，就必须检测质粒是否插入了正确大小的PCR产物。可以通过克隆PCR来完成，其中该克隆被裂解，然后将含有模板的裂解液用合适引物进行PCR。扩增产物在琼脂糖凝胶上进行分析。
从实施例6的再划线平板中挑选克隆，置于50μl克隆裂解缓冲液[克隆裂解缓冲液TE(Tris-Cl 10mM，1mM EDTA，pH8.0)和0.1％tween 20]，煮沸10min。沉淀细胞碎片，将上清液或含有模板DNA的克隆裂解产物用于PCR。PCR成分大部分和实施例4相同，除了用Lgh(5′-CGACAACACCGATAATC-3′)和Rgh(5′-GACGCGAACGAAGCAAC-3′)(特异性克隆位点侧翼载体序列)引物代替T11M和随机引物，2μl克隆裂解产物代替洗脱的DNA。而且反应体积减少到20μl。克隆PCR的条件是94℃，30s→52℃，40s→72℃，1min，30个循环，然后72℃，延伸5min，1个循环，最后保持在4℃。扩增产物和分子量标记在1.5％琼脂糖凝胶上跑胶冰分析插入基因的正确大小。由于使用Lgh和Rgh侧翼引物，克隆PCR产物的大小大于120bp，因为侧翼载体序列也被扩增了(参见附图6)。
实施例8用Northern印迹确认差异性表达上述克隆的PCR产物位于差异性表达基因的3`端。本发明的范围内，将这些克隆的DNA片段称为基因。由于差异性显示总是有假阳性，即显著差异性表达的基因(Wan，J.S.和Erlander，M.G.1997.Cloning differentially expressed genes by using differential display andsubtractive hybridization.In Methods in Molecular Biology.Vol.85Differential display methods and protocols.Eds.Liang，P.and Pardee，A.B.Humana press Inc.，Totowa，N.J.，pp.45-68)，Northern印迹能确认CO、DS、RC和AB茶树第4叶间的差异性表达。Northern印迹要求制备放射标记探针，随后将其和变性RNA杂交，印迹至膜上。
将实施例7的扩增产品作为Northern印迹探针。扩增产品在1.5％琼脂糖凝胶中显影后，从胶中切除，根据说明用QIAEX II凝胶抽提试剂盒(购自M/s.Qiagen，Germany)洗脱胶中的DNA。
根据说明，将纯化片段用HotPrime试剂盒(购自M/s.GenHunterCorporation，Nashville，USA)进行α[32P]dATP(4000Ci/mmole)标记。用Q1Aquick核苷除去试剂盒(QIAGEN，Germany)纯化放射标记探针以除去非插入放射核酸。
为了进行印迹，将20μgRNA在1.0％甲醛琼脂糖凝胶中跑胶，基本如实施例2所述。跑胶一旦完成，在振荡情况下将凝胶用DEPC高压灭菌水冲洗2次，每次20min。然后将凝胶在振荡情况下用10×SSPE(10×SSPE1.5M氯化钠，115mM NaH2PO4，10mM EDTA)冲洗2次，每次20min。同时，将尼龙膜(Boehringer mannheim cat.no.#1209272)用DEPC水湿化，然后浸入到10×SSPE，5min，轻微振荡。然后将凝胶中的RNA真空印迹(压力40mb)到尼龙膜上，使用DEPC处理的10×SSPE作为转化介质。转化进行4小时。压力在凝胶移出真空印迹器前提高到70mb，维持15min。转化后，移除凝胶，UV光源下在尼龙膜表面标记RNA标记。干燥尼龙膜，80℃烘烤45min。5×SSPE(20×SSPE3M氯化钠，230mM磷酸钠，20mM EDTA)简单冲洗后，将该膜浸入预杂交液(50％甲酰胺，0.75M NaCl，50mM磷酸钠，pH7.4，5mM EDTA，0.1％Ficoll-400，0.1％BSA，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，0.1％SDS溶液和150ug/ml新鲜煮沸鲑精DNA)中处理5小时。
将已合成的放射标记探针煮沸10min使其变性，然后加入预杂交液浸湿印迹膜。杂交进行16小时。去除溶液，在室温下将用含有0.1％的SDS的1×SSC冲洗膜2次(20×SSC；3M氯化钠和0.3M枸橼酸钠二水合物，pH，7.0)，每次15min。最后，在50℃用预温的含有0.1％的SDS的0.25×SSC冲洗15min。移出膜，卷入到莎伦包装膜(saranwrap)中，根据信号强度将X-射线胶片曝光12-240小时。
当进行Northern杂交时，将来自CO、DS、RC和AB第4叶的RNA印迹到膜上，并进行测试来选择探针。附图7显示了3个这种探针的结果，确认了CO、DS、RC和AB第4叶之间的差异性表达，三个基因确认发生差异性表达，其设计为DS31(T11G，AP65)DS61(T11A，AP1)DS103(T11A，AP65)括号中是克隆基因所用的各种引物组合。引物的详细描述见实施例4。
DS31(T11G，AP65)，基本上是基因3`端的区域，northern印迹中能和1.5kb大小的转录物杂交，如附图7所示。
DS61(T11A，AP1)基本上是基因3`端的区域，northern印迹中能和750bp大小的转录物杂交，如附图7所示。
DS103(T11A，AP65)基本上是基因3`端的区域，northern印迹中能和1.9kb大小的转录物杂交，如附图7所示。
上述转录物的大小是在RNA标记的帮助下得到测量(Cat#R7020，购自M/S.Sigma chemical company，USA)。
实施例9使用BLAST(BLAST表示Basic Local Alignment Search Tool)在URLwww.ncbi.nlm.nih.gov的基因库中搜索所有序列来确定序列的唯一性。序列ID1的结果令人欣慰，318个碱基的最大比特值是107，最大同一性也是107碱基(33.6％)。与已知序列如此低的同一性赋予了该克隆基因新颖性。进一步分析揭示(附件1)，dr3l显示了与下列基因的3`端有非常显著的差异得分(8e-22到3e-9之间)，(1)葡萄(Vitis vinifera)，大豆和烟草(Nicotiana tabacum)的奇甜蛋白样蛋白(thaumatin like proteins，TLP)；(2)发病机理相关的(pathogenesis-related，PR)含有烟草红花烟种(N.tabacum)mRNA的蛋白R主要形式(E值，1e-17)；和(3)山毛榉(Fagus sylvatica)的渗透素样蛋白(osmotin-like protein，OLP)的部分olp2基因(E值，8e-19)。在BLAST程序中，E值或期待值表示在随机检索的数据库中，期望发生的得分等于和好于S的不同配对数目，E值越低，得分越显著。TLP，R主要形式PR蛋白以及OLP，这三个蛋白都属于PR蛋白的PR-5家族，已知其受真菌感染和渗透压压力期间的诱导(SinghN.K.，Bracker C.A.，Hasegawa P.M.，Handa A.K.，Buckel S.，HermodonM.A.，Pfankoch E.，Regnier F.E.，Bressan R.A.1987.Charaterization ofosmotin.A thaumatin-like protein associated with osmotic adaptation toplant cells.Plant Physiology 85，529-536；Yun D.J.，Bressan R.A.，Hasegawa P.M.1997.Plant antifungal proteins.Plant Breeding Reviews1439-88)。因此PR-5家族和其基因可能与防御真菌感染和干旱有关，所以，茶树防御干旱毒副作用的保护机制之一是通过过量产生RP-5样基因产品。
序列ID2的结果也令人欣慰，251个碱基，最大比特得分是52，最大同一性是26个碱基(10.4％)。和已知序列如此低的同一性赋予了该克隆基因新颖性。序列同源性检索显示，ID2与鸡的集钙蛋白(calsequestrin)mRNA 3`端的显著性得分是3e-4。集钙蛋白是钙结合蛋白，该蛋白在动物系统中有很少报导，存在于心脏和骨骼肌中(Cala，S E，Jones，L R.1983.Rapid purification of calsequestrin fromcardiac and skeletal muscle sacroplasmic reticulum vesicles byCa-dependent elution from phenyl-sepharose.Journal of BiologicalChemistry 258，11932-11936)。该蛋白除了作为钙离子的存储蛋白，还参与细胞内钙离子的内环境稳定。在红甜菜和黄瓜中免疫研究显示一55kDa多肽和兔骨骼肌的集钙蛋白的单克隆抗体发生交叉反应。
这些集钙蛋白样蛋白参与细胞Ca2+调节。
需要说明的是，干旱/渗透压力介导细胞内Ca2+的升高，已知其能启动干旱诱导基因产生离子保护性(Knight H，Brandt-S，Knight M R.1998.A history of stress alters drought calcium signaling pathways inArabidopsis.The Plant Journal 16，681-687；Knight H，Trewavas A J，Knight M R.1997.Calcium signaling in Arabidopsis thaliana respondingto drought and salinity.The Plant Journal 125，1067-1078)。抑制集钙蛋白将导致内Ca2+水平的升高，从而启动一系列干旱诱导的基因。因此，数据显示集钙蛋白可能参与茶树干旱条件下的信号转导途径。
序列ID3的结果也令人欣慰，361个碱基，最大比特得分是40，最大同一性是23(11.1％)。与已知序列如此低的同一性赋予了该克隆基因新颖性，然而E值得分更高(阳性)，因此，在对该完整基因进行克隆和测序前，很难断定该序列的任何功能。
本发明的基因认为具有新颖性，因为与2002年3月公开的资料库序列相比较，同源性＜35％。
本发明的优点在于●三个新基因，能促进植物中的水分压力耐受性。
●新基因能促进干旱耐受性，尤其是茶树中。
●克隆干旱压力相关新基因的方法。
●CO、DS、RC和AB茶树叶中表达和抑制基因的3`端图谱，用于鉴别出现的差异性表达基因。
●确认差异性表达基因的经鉴定的3`端以证明经历干旱压力的茶树叶中存在差异性表达。
●测序克隆的差异性表达基因的3`端显示还没有记载在数据库的新基因的唯一性●向植物系统中引入干旱耐受性的方法。
●向茶树中引入干旱耐受性的方法。
权利要求
1.SEQ ID No 1-3的基因。
2.如权利要求1所述的基因，其中SEQ ID No.1的基因的长度是318bp。
3.如权利要求1所述的基因，其中SEQ ID No.2的基因的长度是251bp。
4.如权利要求1所述的基因，其中SEQ ID No.3的基因的长度是361bp。
5.如权利要求1所述的基因，其中所述基因是环形的。
6.如权利要求1所述的基因，其中所述基因在缺水压力条件下，在茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)中差异性表达。
7.一种鉴定在缺水压力条件下，茶树中SEQ ID No 1-3的基因差异性表达的方法，所述方法包括以下步骤(i)分离正常条件和干旱条件下生长的所述植物的总mRNA；(ii)逆转录所述mRNA获得cDNA；(iii)测序所述cDNA；(iv)用所述cDNA鉴定差异性表达的基因。
8.如权利要求7所述的方法，其中通过双脱氧链终止法对所述cDNA进行测序。
9.如权利要求7所述的方法，其中用酶逆转录酶将所述mRNA逆转录成cDNA。
10.如权利要求7所述的方法，其中所述基因在茶树叶中差异性表达。
11.如权利要求7所述的方法，其中所述方法在所述植物mRNA链的3`端显示差异性表达。
12.如权利要求7所述的方法，其中的茶树是Camellia sinensis(L.)O.Kuntze。
13.如权利要求7所述的方法，其中所述的差异性表达通过Northern印迹来确认。
14.一种利用SEQ ID No 1-3的基因在植物系统中引入缺水压力耐受性的方法，所述方法包括转化所述基因到所述植物中的步骤。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述的方法用于利用SEQ IDNo 1-3的基因向茶树中引入缺水压力耐受性。
16.如权利要求14所述的方法，其中所述的基因用选自如下的技术转化农杆菌(Agrobacterium)介导的转化和基因枪介导转化。
17.如权利要求14所述的方法，其中所述方法用于调节所述压力的耐受性。
18.如权利要求14所述的方法，其中所述基因用于制备探针以鉴定对在所述缺水压力条件下生长具有耐受性的植物。
19.如权利要求14所述的方法，其中所述基因用于在干旱条件下形成耐受性。
20.权利要求14的方法，其中所述基因用于形成抗干旱的耐受性。
全文摘要
本发明涉及对生物系统的水分耐受性有用的三个新基因SEQ IDNo.1－3，所述基因在干旱条件下，在茶树中差异性表达；以及将所述基因引入到生物系统中以帮助形成缺水耐受性的方法。
文档编号C12N15/82GK1628127SQ02829011
公开日2005年6月15日 申请日期2002年3月28日 优先权日2002年3月27日
发明者普里特·夏尔马, 桑贾伊·库马尔, 帕拉姆维尔·辛格·阿胡贾 申请人:科学与工业研究委员会