用于治疗疾病的新细菌的制作方法

专利名称：用于治疗疾病的新细菌的制作方法
技术领域：
该本发明涉及一种新的细菌和该新细菌及其属的其它成员、其活性部分和/或来自其的蛋白质用于治疗多种疾病的用途。更具体地说，本发明涉及迪茨氏菌属(Dietzia)(包括迪茨氏菌种C79793-74)，以及通过分离迪茨氏菌所使用的体外抑制方法分离的其它细菌、来自其的部分和/或蛋白质用于治疗反刍类动物的副结核和由分枝杆菌导致人类疾病，例如局限性回肠炎、麻风、结节病和结核病(TB)的用途。
背景技术：
反刍动物中的副结核(或副结核病)是胃肠道的慢性感染。副结核分枝杆菌(Mycobacterium paratuberculosis)(MpT)已知是副结核病的病原体。接触副结核病的大多数动物在出生后不久即被感染，在成年之前并不表现临床症状。感染是永久性的，目前无有效的治疗方法，若不被屠宰，大多数临床患病的动物最终将消耗而死。
目前的估计显示出在美国21.6％的牧群中3.4％的乳牛的和7.9％的牧群中0.9％的肉牛被MpT感染。基本上所有其它国家都报道了类似的数据。这些结果证明副结核病是一个非常严重的全世界性问题。确实，据估计，由于乳品收入的损失，屠宰增加、屠宰动物体重低、产犊间隔延长以及育种家畜无法售出而给美国带来的经济影响为2-15亿美元。同样，养羊业也遭受到由副结核病带来的巨大经济损失。
普遍认为，对于副结核临床表现的出现来说，年幼时必须发生MpT的感染。迄今为止，尚未报道对感染动物的有效治疗。而且，尚未报道防止感染的预防方法。生物安全性及其它管理实践方法已被建议用作控制副结核病传播的方法。人们认为MpT的传播可通过如下方式得以减小a)对细节的持久关注；b)避免接触感染动物的排泄物；和c)屠宰所有感染牛和感染牛产下的所有子代。然而，从实际的前景来看，单独的管理措施可能无法控制传染。因此，需要预防和控制副结核的可行方法。
分枝杆菌是人类，以及动物的主要病原体。在世界范围内大约有一千万肺结核病例，年死亡率为三百万。麻风(由麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)导致)折磨着一千万人，其主要发生于发展中国家。结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和鸟胞内分枝杆菌(Mycobacterium avium-intracellulare)型的分枝杆菌是免疫受损性患者例如爱滋病患者的主要机会病原体。局限性回肠炎和结节病被假定是被MpT感染的结果。治疗这些疾病的大多数方法需要强烈且冗长的联合药物疗法。所述治疗不但会产生抗性菌株，而且对局限性回肠炎患者来说尚未建立疾病的持久分辨率。因此，需要对人类的分枝杆菌所引发的疾病的更有效的治疗方法。
局限性回肠炎一种慢性、消耗性和可能致死的疾病，其具有与副结核病广泛的临床、病理和全身的相似性。在美国，每年新诊断的局限性回肠炎患者的数量估计为20,000。局限性回肠炎为病因不明的不形成粒细胞性回肠结肠炎。对局限性回肠炎免疫发病机理的假说是该疾病起因于对内脏相关淋巴组织(GALT)的抗原性攻击。一经触发，释放的细胞因子及其它炎症介质将导致慢性和持续性炎症。该炎性反应被假定是GALT对肠细胞内呈递的抗原的高应答性的结果。该高反应性可以是免疫调节缺陷的结果或来自于持续的刺激，例如MpT抗原。确定遗传倾向性的最近的证据与该理论一致。因此，尤其需要对靶向MpT的局限性回肠炎的治疗方法。
罹患副结核病的动物可以是导致人类局限性回肠炎的MpT的来源。例如，MpT可经污染的肉和/或巴氏灭菌牛奶而被传播至人类。MpT是在移居至血液和其它组织中存在的吞噬细胞中并在其中繁殖的细胞内病原体。因为吞噬细胞是乳的天然组分，故在感染母牛的乳中发现MpT是不令人惊奇的。而且，MpT对目前商业上使用的巴氏灭菌法具有部分抗性。此外，严重感染MpT的动物通常被屠宰而可能用于制备牛肉粉。不充分的烹调会再次导致食物中出现存活的MpT。因此，副结核的任何有效治疗均可能降低MpT到人的传播，随后其可导致局限性回肠炎发生率较低。
发明概述本发明涉及迪茨氏菌属细菌用于治疗多种疾病的用途。本发明包括鉴定为迪茨氏菌菌种C79793-74的并保藏于美国典型培养物中心(American Type Culture Collection)(ATCC)，保藏号为PTA-4125的分离的细菌用于治疗多种疾病的用途。
在一个实施方案中，本发明包括一种适于施用于动物的组合物，其包括载体和一种或多种细菌，即选自迪茨氏菌属(包括ATCC保藏号PTA-4125)的细菌种类，其在本文中统称为“细菌”。
本发明还包括适于施用于动物的组合物，其包括载体和药理学上有效(或重组DNA来源的)剂量的细菌、细菌的活性片段，包括由细菌或含有细菌来源的DNA的生物体所分泌的酶、活性分子的活性片段，以及上述的组合。活性分子包括蛋白质、DNA分子、RNA分子、糖类和细胞膜组分，例如脂多糖。
在另一个实施方案中，本发明包括适于将细菌施用于罹患副结核病的动物的组合物。例如，本发明包含其中含有细菌组分的饲料组合物和饲料添加剂。
而在另一个实施方案中，本发明包括一种适于施用于人的组合物，其包括载体和细菌。
本发明还包括适于施用于人的组合物，其包括载体和药理学上有效(或重组DNA来源的)剂量的细菌、细菌的活性片段，包括由细菌或含有细菌来源的DNA的生物体所分泌的酶、活性分子的活性片段，以及上述的组合。通过重组技术制备细菌的方法是本领域众所周知的。
此外，本发明涉及通过施用包含细菌的组合物来治疗副结核病、局限性回肠炎和其它分枝杆菌所导致的疾病的方法。在一个实施方案中，本发明包括治疗副结核病的方法，该方法包括对感染MpT的任何哺乳动物经口施用包含细菌的组合物。
用于本发明的细菌是从动物样品中分离的，所述动物样品可以是牛的排泄物，将细菌与MpT共培养，然后选择抑制MpT生长的细菌。在其它实施方案中，细菌是从土壤、海水或甚至昆虫中分离的。
该方法还涉及在含有胰蛋白 大豆培养液的培养基中培养迪茨氏菌属细菌的方法。
发明详述本文所述的所有范围包括全部组合和包含于该范围中的次级组合；因此，范围“约15～约60”将包括约15～约45，约30～约47等等的范围。范围“最高达85”将包括最高达80、最高达50、最高达24等等的范围。
本发明涉及新的细菌例如迪茨氏菌属中的那些种类(″该细菌″)，其(当与病原分枝杆菌共培养时)能抑制共培养的分枝杆菌的生长，由此证明可用于控制所述分枝杆菌的生长。
所述细菌还令人惊讶地且出乎意料地被证明能有效治疗被MpT感染的具有和不具有临床疾病的牛。
具体来说，对反刍动物施用细菌解决了一个长期存在的问题，因为其被证明能有效治疗被MpT感染的反刍动物。已经令人惊讶地且出乎意料地发现将药理学上有效剂量的细菌经口施用于牛能够治疗副结核病的症状并导致对该给药反刍动物有益的长期健康。
所述细菌能有效治疗任何反刍动物(包括但不限于，牛、绵羊、山羊和鹿)中的副结核病。将所述细菌施用于临床上无症状的被MpT感染的反刍动物也能用于防止副结核病临床症状的发作。在一个实施方案中，反刍动物包括牛，例如乳犊牛和成年泌乳及无泌乳母牛。在另一实施方案中，反刍动物包括山羊或绵羊。
在一个实施方案中将所述细菌经口施用于反刍动物。所述细菌可以在与饲料混合的和/或与饲料添加剂混合的溶液中进行施用。所述口服施用可以用一系列每日施用的剂量实施至少3个月的一段时期。当反刍动物是牛时，治疗可以至少1011cfu的剂量施用至少6个月。这包括将所述细菌以至少1012cfu的剂量进行施用的治疗方法并进一步包括将所述细菌以至少1013cfu的剂量进行施用的治疗方法。在一个实施方案中，将所述细菌经口以每日为基础施用于成年临床患病的或无症状的乳牛大约3～10月。但是，只要能够施用药理学上的有效剂量从而有效防止和/或治愈副结核，可是采用任何可接受的周期。例如，如果将所述细菌与饲料和/或饲料添加剂混合，可对反刍动物饲喂将包含药理学上有效剂量的所述细菌的饲料的日常饮食直至总剂量导致治愈和/或防止疾病。
在一个实施方案中，以单剂量经口施用2×1011cfu的所述细菌。如果将所述细菌掺入饲料中，饲料中所述细菌的浓度范围应适于实施本发明的方法，在一个实施方案中约为1011～1013cfu/日。在一个实施方案中，将所述细菌以某种浓度掺入饲料中，以便在每日消耗的一定量饲料中能够施用2×1011cfu的所述细菌。任何适宜量的所述细菌，或其活性部分和蛋白质的均可以掺入饲料中，只要能在每日饲料中将药理学上有效量的物质饲喂给动物即可。如果将所述细菌掺入饲料添加剂中，饲料添加剂中所述细菌的浓度范围应适于实施本发明的方法，在一个实施方案中约为1011cfu/日。在一个实施方案中，将所述细菌以某种浓度掺入饲料添加剂中，以便在每日消耗的一定量饲料中能够施用2×1011cfu的所述细菌。
本发明并非有意受到治疗性制剂的特性的限制。所述细菌可在任何类型的用于施用的适宜介质中制备。例如，所述细菌可与生理上容许的液体(例如盐水)、凝胶或固体载体、稀释剂、佐剂、赋形剂一起被提供并作为瘤胃保护(rumen-protected)胶囊的成分。适宜的稀释剂和赋形剂包括药物级生理盐水、葡萄糖、甘油、甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等及其组合。此外，如有需要，组合物可包括少量的辅助物质例如湿润剂或乳化剂、稳定剂或pH值缓冲剂。这些组合物典型地包括1％～95％的活性成分，优选2％～70％。所述细菌可被掺入片剂、大丸剂或胶囊中而给予患者。所述细菌还可被掺入盐块等中。所述细菌可以冷干粉或作为装入胶囊的细菌(给保护其不在瘤胃中降解)而被加至饲料中。在一个实施方案中，所述细菌在生理磷酸盐缓冲盐水(PBS)或在培养基，胰蛋白 大豆液体培养基(TSB)中准备而用于经口施用于反刍动物。
该细菌可被掺入片剂、兽用顿服料、大丸剂、胶囊或预混合料中。可以通过药物制剂领域众所周知的方法将这些活性成分配制为所述剂型。参见，例如美国专利号4,394,377。(该专利，及本文所引用的其它参考文献由此引入作为参考。)实心胶囊和任意期望形式的该活性成分可很容易地生产胶囊。如有需要，这些材料可用惰性粉状稀释剂，例如糖、淀粉、乳粉、纯化结晶纤维素等进行稀释以增加体积以便填充胶囊。
可采用常规的制剂方法来制备包含所述细菌的片剂。除活性成分外，片剂可包含基质、崩解剂、吸收剂、粘合剂和润滑剂。典型的基质包括乳糖、蔗糖、氯化钠、淀粉和甘露糖醇。与藻酸一样，淀粉也是一种良好的崩解剂。某些时候还会使用表面活性剂例如十二烷基硫酸钠和二辛基磺基琥珀酸钠。通常使用的吸收剂包括淀粉和乳糖。碳酸镁也可用于含油物质。可以使用，例如明胶、树胶、淀粉、糊精、聚乙烯吡咯烷酮和多种纤维素衍生物作为粘合剂。通常使用的润滑剂包括硬脂酸镁、滑石、固体石蜡、多种金属皂和聚乙二醇。
通过选择所述细菌、其片段或其分泌的活性分子在大多数情况下易于制备兽用顿服药。通过制备一种组分与另一种组分的水溶液的悬液可以将水溶性形式的组分与不溶于水形式的其它组分联合使用。不溶于水形式的活性成分可通过悬浮液或在生理上可接受的溶剂比如聚乙二醇中制备。不溶于水形式的各活性成分的悬浮液可在油例如花生油、玉米油、芝麻油等；二醇例如丙二醇或聚乙二醇；或者水中(取决于特定活性成分的溶解度)中制备。可能需要适宜的生理上可接受的佐剂以便使活性成分保持悬浮。佐剂可选自增稠剂，例如羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和藻酸盐。表面活性剂通常用来悬浮活性成分，特别是脂溶性丙酸盐-增强化合物。最适于在液态非溶剂中制备悬浮液的是烷基酚聚环氧乙烷加合物、苯磺酸盐、烷基苯磺酸盐和聚氧化乙烯山梨聚糖酯。此外许多物质(受亲水性、密度和液体的表面张力的影响)可辅助制备各实施方案中的悬浮液。例如，适用的悬浮剂可以是硅酮消泡剂、二醇、山梨糖醇和蔗糖。
此外，本发明的主题组合物可被单独施用(例如通过将其直接加入饲料中)和作为大丸剂、兽用顿服药或胶囊而与第二物质共同施用。或者可单独制备各组合物并将其以适宜量并在适宜的时间单独加至饲料中。例如，如硬脂酸胆碱、脂肪酸复合体的物质可以用于实施本发明，由于其物理性质而不适于掺入饲料预混料。在此情况下，硬脂酸胆碱组合物可在适宜的稀释液中单独地提供，所述稀释液例如是，玉米粉、玉米芯粉、玉米粥、玉米蛋白粉、小麦粉、豆粕、大豆磨料、米粉副产品等，及其混合物。美国专利号4,394,377中描述了所述适宜的稀释剂。
所述细菌可在组合物、预混料(其随后混合至动物饲料供应中)中被施用于动物。所述组合物可包括单独的所述细菌或可与载体和/或其它药物、维生素、矿物质、蛋白质浓缩物和类似的饲料添加剂混合的所述细菌。
这些组合物可被制为干粒粉末形式(如团粒)、膏状形式(包封以便提供瘤胃保护)、或可制为液态饲料添加剂等。任何类型的饲料均可加入所述组合物，包括通常的干燥饲料、液态饲料和颗粒饲料。将补充材料配制于动物饲料中的方法是众所周知的。有必要仅计算各化合物(需要施用于各动物的)的量，考虑动物每日进食饲料的量，然后混入适宜量的所述细菌。参见美国专利号4,394,377。
本发明的组合物可用作饲料添加剂预混料、饲料添加剂浓缩物或饲料添加剂补充物，其中活性成分均匀地分布于整个浓缩形式的标准有机的或无机的动物饲料载体，其便于包装和送至饲料拌和机。然后用培养器或饲料混合机均匀混合该预混料，浓缩物或补充物，按需为动物提供正常的饮食。用于预混料组合物的载体的实例是豆粕、玉米油、玉米粉、大麦、小麦、包含例如蛭石或硅藻土的矿物混合物，玉米谷蛋白粉、豆粉或其它价格低廉的可食用组分。
所述细菌还可与适宜的载体例如可食用的饲料或饲料添加剂补充物形式的饲料组分混合。所述可食用的饲料组分的实例是美国专利号6,156,333中所公开的任何类型的用于反刍前阶段的牛犊的饲料强化剂和增强剂。如果被单独选择或作为补充物用于饲喂，根据补充物的预计每日消耗量提供所述细菌以便在一个特定范围内提供这些组分的各个每日剂量。
此外，所述细菌可通过研磨机或其它饲料供应器而被直接掺入饲料中以便为培育者提供最终的饲料产品。最终饲料产品可以由任意下述物质制成多种谷物、苜蓿、草、矿物质、维生素、蛋白质补充物等，其形成营养上完整的反刍动物饲料。所述细菌可直接与家畜饲料混合，所述家畜饲料由多种组分例如干草、稻草、青贮饲料、玉米杆、棉籽壳、谷物、燕麦、大麦和谷糠(尤其用于反刍动物的)；抗氧化剂、矿物质、维生素、驱虫剂和其他适宜的药物。参见美国专利号4,394,377。可选地，所述细菌可被掺入美国专利号6,156,333中所公开的任何类型的用于反刍前阶段的牛犊的液体饲料。
可通过任何适于将细菌混合至动物饲料的方法将所述细菌混合至适宜的动物饲料中。所述方法的实例包括但不限于下述将所述细菌喷雾于干燥饲料上然后机械式送料和用机械将所述细菌混合至干燥或液态饲料中；上铺谷物或浓缩混和。
本发明的细菌还可用于治疗由多种分枝杆菌感染导致的人类的医学病症。这些医学病症包括局限性回肠炎、麻风、结核病、结节病和免疫受损(AIDS)患者中的腹泻。通过本领域已知的方法将所述细菌或其活性片段、蛋白质、分泌物等施用于人类患者可显示出减轻了由分枝杆菌导致的疾病或综合症的症状。
迪茨氏菌种79793-74，ATCC保藏号PTA-4125在培养来自MpT血清阳性和阴性的牛的排泄物期间被鉴定为独特的细菌污染物。随后将该细菌污染物分离、培养并鉴定为于迪茨氏菌属。在其它试验中发现迪茨氏菌种79793-74当与MpT共培养时能完全抑制MpT的生长。使用从适宜的动物宿主中分离样品的该方法可用于分离抑制MpT生长并因此可用于治疗MpT导致的疾病的其它细菌(除迪茨氏菌属以外的)。
通过相似方法可以分离抑制多种分枝杆菌生长的其它微生物。其它可被抑制的分枝杆菌包括结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、鸟胞内分枝杆菌、牛分枝杆菌(M.bovis)、龟分枝杆菌(M.chelonei)(也称为borstelense分枝杆菌和脓肿分枝杆菌)、非洲分枝杆菌(M.africanum)、海分枝杆菌(M.marinium)(也称为巴氏分枝杆菌和热带扁平鱼分枝杆菌，其是“游泳池肉芽肿”的致病因子)，溃疡分枝杆菌(M.buruli)(也称为溃疡分枝杆菌)、偶发分枝杆菌(M.fortuitum)(也称为盖氏、minetti和蛙分枝杆菌)、嗜血分枝杆菌(M.haemophilum)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)(也称为luciflavum分枝杆菌)、蟾分枝杆菌(M.littorale)(也称为蟾蜍分枝杆菌)、玛尔摩分枝杆菌(M.malmoense)、瘰疠分枝杆菌(M.marianum)(也称为scrofulaceum分枝杆菌和paraffinicum分枝杆菌)、猿分枝杆菌(M.simiae)，斯塞格分枝杆菌(M.szulgai)和溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)(导致Buruli溃疡的因素)、鸟分枝杆菌(M.avium)(也称为深褐色分枝杆菌)、微黄分枝杆菌(M.flavascens)、鼠麻风分枝杆菌(M.lepraemurium)和田鼠分枝杆菌(M.microci)。
可通过在胰蛋白 大豆液体培养基中琼脂斜面上于35℃生长细菌来培养迪茨氏菌属细菌。迪茨氏菌属细菌的大规模生产可通过在大型生物发酵罐中的悬浮液中生长而得以实现。通过保存于-20℃，所述细菌的存活力不会改变。此外，迪茨氏菌属细菌可以冻干物质于室温下保存。可使用本领域已知的保持细菌存活力的其它保存方法。
可通过用于制备/鉴定细菌活性片段和细菌分泌的蛋白质的方法制备来自迪茨氏菌属的细菌的活性片段和从所述细菌中分离的活性分子。所述方法包括但不限于声裂法、渗压震扰、洗涤剂裂解、高压、将脱氧核糖核酸转至其它生物体，例如然后要用作上述饲料添加剂的细菌、植物或动物。
发明的组合物和方法产生如下重要的有利点提供了副结核病的有效治疗方法，其将增加农民的收益；通过消除潜在的MpT污染使得产品例如乳和肉更安全；对于局限性回肠炎以及由分枝杆菌导致的其它疾病例如结核病和麻风的可能有效的非抗生素治疗方法。该方法还教导了一种鉴定抑制多种分枝杆菌的方法。
本领域技术人员仅通过常规试验即可认识到(或能够确定)本文所描述的具体实施方案的大量等效形式。所述等效形式包含在本发明的范围之内。
实施例本发明通过下述、非限制性的实施例进行进一步的说明。
实施例1.通过酶联免疫吸附测定(ELISA)确定来自迪茨氏菌属致敏的母牛的血清以及初乳/乳中的抗体与MpT发生交叉反应对经检测对MpT感染阴性的健康母牛注射需要剂量的迪茨氏菌属菌种C79793-74，其保藏号为PTA-4125。通过本领域技术人员认识或能够确定的标准ELISA测定法确定取自注射的母牛的乳和血清中与MpT交叉反应的抗体的滴度。
表1
图示-表示阴性；+表示阳性；ND表示未完成；IM表示经肌内途径表1中的结果表明用迪茨氏菌属细菌ATCC保藏号PTA-4125免疫的母牛能产生与MpT交叉反应的抗体。而且，在血清和乳中均发现了这些抗体。该结果是重要的，因为其为迪茨氏菌属细菌的作用机制提供了可能的解释感染了MpT的吞噬细胞可更易于摄取被覆了与MpT交叉反应的抗体的迪茨氏菌属细菌。因此，该交叉反应的抗体可用作将迪茨氏菌属细菌递送给被MpT感染的细胞。
实施例2.对副结核病血浆阳性的母牛的治疗根据本发明的方法通过施用迪茨氏菌属细菌ATCC保藏号PTA-4125治疗罹患副结核病的母牛。下面表2中显示了7头所述母牛的临床结果。
对各母牛施用口服单剂量2×1011cfu(以每日为基础，单剂量)的迪茨氏菌种C79793-74，ATCC保藏号PTA-4125。
表2
表2中的结果显示了用迪茨氏菌种C79793-74，ATCC保藏号PTA-4125对MpT血清阳性的动物的治疗是有效的(而对于H-83，是治愈性的)。例如，母牛H-83(用迪茨氏菌种C79793-74，ATCC保藏号PTA-4125治疗9个月)在治疗接受后38个月，于5/01/02仍存留于牧群中，其ELISA阴性，培养阴性且无临床症状。结果还显示出最好的试验对象是患有早期疾病的那些动物。任何结果(例如表2所示的那些结果，或根据要治疗的动物而与之相似的结果)均与本申请所述的定义“降低或防止疾病或综合症的症状”相适应。
概言之，实施如下临床研究，其中对表现出副结核病症状的成年奶牛施用迪茨氏菌种C79793-74，ATCC保藏号PTA-4125。在该研究中，每日给予所述细菌3～10个月。在治疗的7只临床患病的动物中，6只康复。而且，MpT血清阳性，但临床无症状的4只经治疗的动物再无疾病的发展。相反，未治疗的10只临床患病的动物死于明显的临床疾病。
实施例3.BC对牛犊和小鼠施用迪茨氏菌属细菌的安全性除施用了活的或死的迪茨氏菌种C79793-74，ATCC保藏号PTA-4125的母牛外，还对大量牛犊和小鼠施用了相同的活细菌。使用两类小鼠。对8只免疫学具有活性的，2～3个月龄的A/J雄性和8只雌性(每笼各两只)IP注射108cfu的活迪茨氏菌种C79793-74，ATCC保藏号PTA-4125。随后对其监测10个月，以检测任何疾病的症状(体重减轻、腹泻)和生殖问题。所有监测到的活动均与未治疗的(对照)动物无区别。此外，108cfu的迪茨氏菌种C79793-74，ATCC保藏号PTA-4125经腹膜内注射至(IP)小鼠CB.17，重度-联合-免疫缺陷小鼠(SCID)小鼠。正如采用常规小鼠所发现的，尽管这些小鼠(遗传上)不具有免疫能力(它们缺乏功能性T和B细胞)，注射的细菌未显示出明显的有害反应。
将7头肯定将用作阉牛的雄性牛犊用于确定经口给予的，以单剂量的，以每日为基础的，自出生至15日的109cfu的迪茨氏菌种C79793-74，ATCC保藏号PTA-4125的安全性。将2头雄性牛犊作为对照，不接受任何细菌。将所有动物阉割，饲养而用于屠宰。在其存活的15-18个月期间，未出现明显的疾病或病症的症状。屠宰时，它们的体重相似。大约4月龄时，从全部9头牛犊中取血样，从其中制备血清，将该血清用于ELISA测定以检测针对MpT的抗体。除了1头牛犊出现阳性的ELISA结果外，所有动物均为阴性。这是预计到的，因为该牛犊接受的初乳来自迪茨氏菌种C79793-74高度免疫的母牛(表1中的H-51)，该母牛的乳中存在抗体。
上述结果显示出活迪茨氏菌种C79793-74在经口或经注射施用时不具有病原性。
实施例4.临床患病的和/或无症状的母牛的治疗已经开始了一个大样本研究，其中将液体或冻干的迪茨氏菌种C79793-74的液体给予临床患病的和/或无症状的母牛，所述母牛是如下一种a)血清-ELISIA阳性，血清-AGID阴性，排泄物阴性b)血清-ELISIA阳性，血清-AGID阳性，排泄物阴性c)血清-ELISIA阳性，血清-AGID阴性，排泄物阳性d)血清-ELISIA阳性，血清-AGID阳性，排泄物阳性e)血清-ELISIA阴性，血清-AGID阴性，排泄物阳性。
7个月后，初步结果显示出防止副结核病阳性的母牛死亡的细菌剂量取决于治疗动物的体重。例如体重超过泽西种乳牛(Jerseys)高达两倍的好斯坦种乳牛(Holsteins)需要至少两倍高的细菌剂量。
ELISA阳性和琼脂凝胶免疫扩散(AGID)阳性的动物比仅ELISA阳性的那些动物更难于保持存活。存活并未显示出需要依赖动物是否排泄出或不排泄出MpT。
已经发现在排泄物中排泄出MpT的19只动物(36只动物中的)在治疗6周后，仅发现1只仍排泄出MpT。在治疗中产下牛犊的8只动物中，在其初乳中无一发现MpT。这与已经发表的相反。这些结果显示出防止在初乳中传播的治疗是可能的。
在治疗期间大量动物死亡(12只)，大多数是由于并发症例如皱胃移位。只有4只死于副结核病且其在治疗开始时均为AGID阳性。
在无痛处死并进行尸检的2只动物的组织中，未发现迪茨氏菌属细菌。
下面表3中显示了处于或变得临床严重患病的2只动物的治疗后的体重改变。
表3
治疗前称重，*产牛犊治疗显示出能同时减少MpT在排泄物和乳中的散布。严重患病的动物体重增加。在尸检的母牛中未全身发现没有迪茨氏菌属细菌。
实施例5.抗体阳性的母牛的长期治疗根据本发明的方法通过施用迪茨氏菌属细菌ATCC保藏号PTA-4125治疗检测为副结核病血清阳性的母牛。对各母牛施用口服单剂量1012cfu(以每日为基础，单剂量)的迪茨氏菌种C79793-74，ATCC保藏号PTA-4125。在治疗期间定期地检测对3头母牛的ELISA测定中确定的特异性针对MpT的血清抗体滴度。下面表4显示了这些检测的结果。零值表示检测血清没有针对MpT的抗体，而大于1的值表示血清来自感染/已经感染MpT的动物。
表4
13头母牛死于分娩并发症，对其进行了尸检。尸检显示没有副结核病的征象且没有来自母牛组织的MpT的生长。治疗后，母牛的免疫系统健康，因此，母牛血清中抗体的消失提示MpT不再存在于该动物中。
权利要求
1.一种包含分离的细菌的组合物，所述细菌属于迪茨氏菌属并保藏于美国典型培养物中心，其保藏号为PTA-4125。
2.权利要求1的组合物，其还包含动物饲料。
3.权利要求2的组合物，其中所述动物饲料选自谷物、干草、稻草、青贮饲料、玉米杆、玉米、玉米粉、玉米谷蛋白粉、豆粕、豆粉、大豆磨料、棉籽壳、燕麦、大麦、玉米粥、谷糠、米粉副产品及其混合物。
4.权利要求1的组合物，其还包含饲料添加剂。
5.权利要求4的组合物，其中所述饲料添加剂选自维生素、矿物质、蛋白质补充物、药物及其混合物。
6.权利要求1的组合物，其中所述组合物掺入选自片剂、兽用顿服药、丸剂和胶囊的剂型中。
7.权利要求6的组合物，其中所述组合物被掺入片剂中且所述片剂中还包含基质、崩解剂、吸收剂、粘合剂和润滑剂。
8.一种治疗副结核病的方法，其包括对哺乳动物施用权利要求1的饲料组合物。
9.根据权利要求8的方法，其中哺乳动物是牛。
10.权利要求8的方法，其中所述方法包括经口施用所述饲料组合物。
11.一种组合物，其包含药理学上有效剂量的属于迪茨氏菌属并保藏于美国典型培养物中心，保藏号为PTA-4125的分离的细菌、其活性片段、其分泌的蛋白质，或其组合。
12.权利要求11的组合物，其中所述组合物掺入选自片剂、兽用顿服药、丸剂和胶囊的剂型中。
13.一种治疗副结核病的方法，其包括对哺乳动物施用权利要求11的饲料组合物。
14.权利要求13的方法，其中哺乳动物是牛。
15.权利要求13的方法，其中所述方法包括经口施用所述组合物。
16.一种饲料组合物，其包含迪茨氏菌属的细菌和动物饲料。
17.权利要求16的饲料组合物，其中所述动物饲料选自谷物、干草、稻草、青贮饲料、玉米杆、玉米、玉米粉、玉米谷蛋白粉、豆粕、豆粉、大豆磨料、棉籽壳、燕麦、大麦、玉米粥、谷糠、米粉副产品及其混合物。
18.一种治疗副结核病的方法，其包括对哺乳动物施用权利要求16的饲料组合物。
19.权利要求18的方法，其中哺乳动物是牛。
20.权利要求19的方法，其中所述方法包括经口施用所述组合物。
21.一种饲料添加剂，其包含迪茨氏茵属细菌和饲料添加剂。
22.权利要求21的饲料添加剂，其中所述饲料添加剂选自维生素、矿物质、蛋白质补充物、药物，及其混合物。
23.一种治疗副结核病的方法，其包括对哺乳动物施用权利要求21的饲料添加剂。
24.权利要求23的方法，其中哺乳动物是牛。
25.权利要求23的方法，其中所述方法包括经口施用所述组合物。
26.一种组合物，其包含药理学上有效剂量的迪茨氏菌属细菌、其活性片段、其分泌的蛋白质、或其组合，从而所述药理学上的有效剂量能够降低或预防病原体是分枝杆菌的疾病或综合征的症状。
27.通过对哺乳动物施用权利要求26的组合物来治疗病原体是分枝杆菌的疾病或综合征的方法。
28.权利要求27的方法，其中哺乳动物是牛。
29.权利要求27的方法，其中所述方法包括经口施用所述组合物。
30.一种培养属于迪茨氏菌属的细菌的方法，包括在含有胰蛋白 大豆培养液的培养基中培养所述细菌。
全文摘要
本发明涉及包含用于治疗反刍动物的副结核的迪茨氏菌属细菌的组合物以及培养所述细菌的方法。本发明还涉及通过对哺乳动物施用本发明的组合物来治疗副结核病的方法。
文档编号C12N1/20GK1674932SQ03818675
公开日2005年9月28日 申请日期2003年6月3日 优先权日2002年6月3日
发明者罗伯特·E·克利克 申请人:罗伯特·E·克利克