专利名称：真菌菌株和从该真菌菌株中获得甘露醇的方法
技术领域：
本发明涉及一种与植物红树伴生的(mangrove-associated)国际保藏编号为MTCC5109的真菌新月弯孢菌Culvularia lunata和一种从与植物红树伴生的真菌Culvularia lunata中获得高产量纯甘露醇的简便并且有效的方法，所述的方法包括的步骤是将所述植物树叶切成小碎片并将其置于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养皿上培养48小时，培养基的温度保持在26-47℃的范围之间并且盐度保持在4-32ppt的范围内并在间歇刺激条件下培养约17-19天以获得菌丝体膜(mat)，将该菌丝体膜超声使细胞裂解，反复使用甲醇从被超声的菌膜中抽提粗提物，浓缩所得的粗抽提物，用极性升高的溶剂处理所得到的已经浓缩了的粗抽提物，在处理后获得含有粗甘露醇的白色粉状残留物的水溶液组分，通过色谱层析提纯所得到的粗甘露醇以获得约占总粗提取物75％的纯甘露醇。
背景技术：
D-甘露醇是六-碳糖醇或多元醇，其甜度约为蔗糖的一半，广泛存在于自然界的各种有机体中包括植物，藻类，真菌，和一些细菌中。自然界中不存在L-甘露醇。
在多种水果和蔬菜中发现了低含量的甘露醇。目前，甘露醇的工业生产是通过催化氢化果糖/葡萄糖(1∶1)的混合物如转化糖获得的。在高温高压下使用阮尼镍作催化剂并且使用氢气(Makkee et al.，1985)。该方法的缺点是被氢化的混合物的组分包括仅约25％的甘露醇并且剩余的75％是山梨醇。该生产工艺使甘露醇的生产成本相对高。
众所周知甘露醇在植物和人类中均具有多种应用。Jennings(1984)指出多元醇包括甘露醇在真菌体内具有多种功能作为碳氢化合物的储备库，作为转运(translocatory)化合物，作为渗透调节化合物，如在辅酶调节，储存或还原力(reducing power)方面，并且也已经证实多元醇能够抑制活性氧(ROS)。活性氧是单分子并直接参与植物防御体系以抵抗病原体。越来越多的证据表明至少一些植物致病真菌应用甘露醇抑制ROS介导的植物防御体系(Jennings et al 1998)。
甘露醇是有价值的营养甜味剂因为它无毒，在处于晶体状态时不吸水并且对牙齿没有腐蚀作用(Debord et al 1987；Dwivedi 1987)。甘露醇不能诱发高血糖症，这使得糖尿病人能够使用它(Griffin and Lynch，1972)。它被用作无糖型口香糖和药物制剂中的甜味剂(sweet builder)(Soetaert，1991)。
甘露醇的其它用途是在澳大利亚将它用于治疗雪卡毒素(ciguatra)中毒(Lewis，1992)。在紧急情况下，甘露醇用于治疗头部创伤以降低脑水肿和颅内压。在尿少或在食物中毒强迫排尿的情况下人类食用甘露醇可诱导排尿(促进尿排泄)。高剂量的甘露醇可以起到使人放松的作用。
已经知道有些微生物可产生甘露醇。在细菌中，异质发酵的菌属属于明串珠菌菌属(Leuconostoc)，乳球菌菌属(Oenococcus)，和乳杆菌菌属(Lactobacillus)似乎在生产甘露醇方面都是最有效的(Niklas et al 2002)。一些丝状菌(霉)也产生甘露醇式的葡萄糖。较早期报道的甘露醇来自于真菌菌株如黑曲霉(Aspergillus niger)(Muraleedharan，1988)，与棉尘伴生的真菌黑霉(viz.Altemaria altemate)，多主枝孢霉(Cladosporium herbarum)，紫附球菌(Epicoccum purpurascens)和Fusariumpallidoroseum(Domelsmith et al 1998)，木兰假丝酵母(Candida magnoliae)(Songet al 2002)和头孢霉属(Cephalosporium sp.)(Bi et al 2001)。
事实证明将糖转化成甘露醇的现有技术的生物技术方法没有达到完全的满意，因为它们不能提供足够的转化产量，因此工业生产方法仍然基于氢化反应。因此，需要改进将果糖和其他的底物生物转化为甘露醇以提供工业上节约的和可接受的工艺。
我们开发的真菌菌种，NIO-FM1E#001显示了相当好的产量(约占总粗提物的70％)并且是生产甘露醇的一种相对简便和节约的工艺。由于已有报道甘露醇在应答环境刺激下可以积累(Kets et al 1996；Stoop and Pharr，1994)，在热和盐刺激条件下培养该真菌，NIO-FM1E#001可获得最大产量的多元醇(polyol)。
因此，本专利描述了制备甘露醇的节约的工艺和生产甘露醇的新型的真菌源(NIO-FM1E#001)。
发明目的本发明的主要目的是分离一种国际保藏编号MTCC5109的与植物红树伴生的真菌新月弯孢菌(Culvularia lunata)。
本发明的另一个主要目的是分离一种快速生长的真菌。
本发明的仍然的另一个主要目的是开发了一种从与植物红树伴生的真菌新月弯孢菌(Culvularia lunata)中获得高产量的纯甘露醇的简便和有效的方法。
本发明的仍然的另一个主要目的是通过色谱层析分离一种纯化的粗甘露醇以获得约占总的粗抽提物的75％的纯甘露醇。
本发明的仍然的另一个目的是使用刺激条件分离高百分率产量的甘露醇。
本发明的仍然的另一个目的是确定甘露醇的新来源。
本发明的仍然的另一个目的是确定一种易分离和培养的新的真菌菌株。
本发明的仍然的另一个目的是所使用的发酵基质能得到最大产量并且其成本低。
本发明的仍然的另一个目的是开发了一种分离甘露醇的方法，其中二级代谢产物易于从主化合物中分离出来。
本发明的仍然的另一个目的是开发了一种使用常温和常压并且在甘露醇的生产中不使用催化剂从真菌中分离纯甘露醇的方法。
发明概述本发明涉及一种与植物红树伴生的国际保藏编号为MTCC5109的真菌新月弯孢菌(Culvularia lunata)和从与植物红树伴生的真菌(Culvularia lunata)中获得高产量的纯甘露醇的简便并且有效的方法，所述的方法包括的步骤是将植物树叶切成小碎片并将其置于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养皿上培养48小时，培养基的温度保持在26-47℃之间的范围内并且盐度保持在4-32ppt之间的范围内并间歇刺激约17-19天以获得菌丝体膜，将该菌丝体膜超声使细胞裂解，反复使用甲醇从被超声的菌膜中抽提粗提取物，浓缩所得的粗抽提物，用极性升高的溶剂处理所得到的已经浓缩了的粗抽提物，在处理后得到含有粗甘露醇的白色粉末残留物的水溶液组分，通过色谱层析提纯所得到的粗甘露醇以获得占总粗提取物约75％的纯甘露醇。
发明的详细描述本发明涉及一种与植物红树伴生的国际保藏编号为MTCC5109的真菌新月弯孢菌(Culvularia lunata)和从与植物红树伴生的真菌Culvularia lunata中获得高产量纯甘露醇的简便并且有效的方法，所述的方法包括的步骤是将植物树叶切成小碎片并将其置于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养皿上培养48小时，培养基的温度保持在26-47℃之间的范围内并且盐度保持在4-32ppt之间的范围内并间歇刺激约17-19天以获得菌丝体膜，将该菌丝体膜超声使细胞裂解，反复使用甲醇从被超声的菌膜中抽提粗提物，浓缩所得的粗抽提物，用极性升高的溶剂处理所得到的已经浓缩了的粗抽提物，在处理后获得含有粗甘露醇白色粉状的残留物的水溶液组分，通过色谱层析提纯所得到的粗甘露醇以获得占总粗提取物约75％的纯甘露醇。
在本发明的一个实施方案中，其中与红树伴生的真菌是国际保藏编号为MTCC5109的新月弯孢菌(Culvularia lunata)。
在本发明的另一个实施方案中，其中在权利要求1中所述的是真菌，其中红树植物是Acanthus illicifolius。
在本发明的仍然的另一个实施方案中，其中真菌是快速生长的真菌。
在本发明的仍然的另一个实施方案中，其中在权利要求1中所述的真菌，其中的真菌的颜色是褐色至黑褐色，背面是黑色的。
在本发明的仍然的另一个实施方案中，其中在权利要求1中所述的真菌，其中的真菌具有带有三个或多个横隔膜的淡褐色的孢子并在合轴延伸的弯曲状的分生孢子柄内通过孔(孢子孔)在顶端形成。
在本发明的仍然的另一个实施方案中，其中在权利要求1中所述的真菌，其中的真菌显示圆柱或略微弯曲形状的孢子，其中一个中心细胞是较大和较深色的。
在本发明的仍然的另一个实施方案中，其中从与植物红树伴生的国际保藏编号为MTCC5109的真菌Culvularia lunata中获得高产量的纯甘露醇的简便并且有效的方法，所述的方法包括的步骤有·采集植物红树的树叶，·在无菌的海水中将树叶漂洗干净并将它们保存在无菌的潮湿的培养室中约两个星期，·将树叶切成小碎片并将其置于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养皿上培养48小时，·在无菌的条件下将单独的菌落转移到无菌的新的PDA培养皿内以获得纯菌种，·将被分离的真菌菌种在PDA斜面上培养约7天以获得菌丝体，·将菌丝体转移到具有海水和蒸馏水的新鲜的PDB内，并用淀粉和糖作为碳源，·在26-32℃之间的温度范围内将菌种培养约3-6天以获得接种体，·将具有接种体并含有海水和蒸馏水的PDB进行培养，·将培养物温度保持在26-47℃之间并且盐度保持在4-32ppt之间并间歇给予刺激条件培养约17-19天以获得菌丝体薄膜，·将菌丝体薄膜超声使细胞裂解，·反复使用甲醇从被超声的菌丝体膜中抽提粗提取物，·浓缩所得到的粗抽提物，·用极性升高的溶剂处理所得到的已浓缩过的粗抽提物，·处理后得到含有粗甘露醇的白色粉末残留物的水溶液组分，·通过色谱层析纯化所得到的粗甘露醇以获得纯甘露醇，含量约为总的粗抽提物的75％。
在本发明的仍然的另一个实施方案中，其中在权利要求7中所述的方法，其中的植物是Acanthus illicifolius。
在本发明的仍然的另一个实施方案中，其中的淀粉的浓度范围是3-5g/l之间。
在本发明的仍然的另一个实施方案中，其中的葡萄糖的浓度范围是18-22g/l之间。
在本发明的仍然的另一个实施方案中，其中海水和蒸馏水的比例范围是1∶5至5∶1之间，优选1∶1。
在本发明的仍然的另一个实施方案中，其中的刺激条件是温度范围为40-45℃之间。
在本发明的仍然的另一个实施方案中，其中的刺激条件是盐度范围在15-17ppt之间。
在本发明的仍然的另一个实施方案中，其中的刺激条件导致产生高百分比产量的甘露醇。
在本发明的仍然的另一个实施方案中，其中树叶是活的幼叶。
在本发明的仍然的另一个实施方案中，其中使用真空蒸发器在28-32℃之间的温度范围内浓缩粗提取物。
在本发明的仍然的另一个实施方案中，其中极性升高的溶剂是石油醚，氯仿，和乙酸乙酯。
在本发明的仍然的另一个实施方案中，其中的色谱层析是在G-10载体上进行。
本发明涉及一种与红树伴生的真菌NIO-FM1#001，它是生产甘露醇的一种新型来源并且本发明涉及生产甘露醇的一种简便和节约的提取和纯化方法。将真菌菌种从Acanthus illicifolius的活的幼叶中分离出来。被分离的菌种在海水蒸馏水(1∶1)中并在含有马铃薯淀粉和葡萄糖作为碳源的马铃薯葡萄糖肉汤中生长。为了得到最佳的生长，发酵介质经过热和盐应激条件的处理。通过最少的提取和纯化步骤从菌丝体薄膜中获得多元醇。将糖乙酰化并且其结构通过使用光谱技术，使用质谱，高磁场NMR光谱，DEPT和COSY试验得到确定。
与红树伴生的真菌，Culvularia lunata，NIO-FM1#001，作为生产甘露醇的一种新来源并且是提取和纯化甘露醇的一种简便的和节约的方法。
真菌，NIO-FM1#001与红树Acanthus illicifolius伴生，并使用下列的步骤分离。
a.将新鲜的幼叶收集在无菌的聚乙烯袋内。
b.在无菌的海水中将树叶漂洗干净并将其置于潮湿的无菌培养室中两个星期。
c.然后在无菌解剖刀的帮助下将树叶切碎并将碎片置于无菌的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养皿上。
d.在48小时之后在无菌的条件下将单独的菌落挑出并将其转移到无菌的PDA培养皿上以获得纯菌种。
真菌的接种体通过下述步骤制备。
a.将纯的已被分离出来的真菌菌种在PDA斜面上培养7天。
b.将支持菌丝生长的琼脂填充物(plug)无菌切割并将其转移到含有25ml马铃薯葡萄糖肉汤(PDB)的100ml厄伦美氏锥形瓶内(Erlenmeyer flasks)。
c.培养介质使用马铃薯淀粉(4g/l)和葡萄糖(20g/l)作为碳源。
d.发酵肉汤在海水∶蒸馏水(1∶1)中制备。
e.在旋转振荡器上在28-30℃之间将锥形瓶培养4至5天。
所用的接种液在发酵介质的生长包括下列步骤。
a.将接种液在无菌条件下倒入5升的厄伦美氏锥形瓶内，该锥形瓶内含有由1∶1海水∶蒸馏水制备的1升的PDB。
b.在接种期间发酵介质的温度是在28-45℃之间。
c.发酵介质的培养温度是在28-45℃之间。
d.发酵介质的盐度是在5-30ppt之间。
e.发酵介质在旋转振荡器上培养18天。
f.通过使发酵介质的接种温度保持在40-45℃之间给予温度刺激。
g.如权利要求1中所述的另一个优选的权利要求中，发酵介质的培养温度在28-30℃之间。
h.如权利要求1中所述的仍然的另一个优选的权利要求中，盐度刺激是通过使发酵介质的盐度保持在15-17ppt之间实现的。
如权利要求1中所述的方法，抽提包括如下的步骤。
·将干的菌丝体薄膜超声并反复使用甲醇抽提。
·在30℃的温度下通过旋转式真空蒸发器浓缩用有机溶液抽提出来的粗提取物。
·用石油醚，氯仿和乙酸乙酯处理所得到的粗抽提物以分离出石油醚组分，氯仿组分和乙酸乙酯组分。
·残留白色粉末的水溶液组分含有粗的多元醇(约占总的粗提取物的70％)。
粗的水溶液提取物的NMR光谱证实多元醇为甘露醇。甘露醇的乙酰化使多元醇为六乙酰化(hexacetate)的多元醇，它被进一步用于结构测定。
将粗甘露醇在G-10载体上进行色谱层析用于纯化。
如权利要求1中所述的一个优选的权利要求中，所用的溶液体系是甲醇∶水(95∶5)。
因此，本发明描述了一种与红树伴生的真菌Culvularia lunata，NIO-FM1#001，它是制备甘露醇的一种新来源并且本发明描述了提取和纯化甘露醇的一种简便和节约的工艺。
在本发明的一个实施方案中，用于制备甘露醇的真菌与红树，Acanthus illicifolius的幼叶伴生，并由下列步骤分离。
-将新鲜的幼叶收集在无菌的聚乙烯袋内。
-在无菌的海水中将树叶漂洗干净并将其置于潮湿的无菌培养室中两个星期。
-使用无菌解剖刀将树叶切碎并在无菌的条件下将碎叶置于PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)培养皿上(HiMedia Laboratories Ltd)。
-在48小时之后将菌落挑出并再将其置于PDA培养皿上直到获得菌种的纯分离物。
在本发明的另一个实施方案中，真菌菌种的接种体通过下述步骤制备。
-先将菌种在PDA斜面上培养7天。
-将支持菌丝生长的琼脂填充物无菌切割并将其转移到含有25ml PDB(马铃薯葡萄糖肉汤)的100ml厄伦美氏锥形瓶内。
-将培养介质在海水∶蒸馏水(1∶1)中制备。
-马铃薯淀粉(4g/l)和葡萄糖(20g/l)被用用作碳源。
-在旋转振荡器上在28-30℃之间将锥形瓶培养4至5天。
在本发明的仍然的另一个实施方案中，上述的接种体用于接种到5升的厄伦美氏锥形瓶内，该锥形瓶内含有由1∶1海水∶蒸馏水制备的1升的马铃薯葡萄糖肉汤。
-在接种期间发酵介质的温度是在28-45℃之间。
-接种之后，将发酵介质置于旋转振荡器上在28-45℃之间培养18天。
-所使用的介质的盐度是在5-30ppt之间。
在本发明的仍然的另一个优选的实施方案中，通过使接种期间发酵介质的温度保持在40-45℃之间给予温度刺激。
在本发明的仍然的另一个优选的实施方案中，发酵介质的培养温度保持在28-30℃之间。
在本发明的仍然的另一个优选的实施方案中，盐刺激是通过使发酵介质的盐度保持在15-17ppt之间提供给培养物。
在仍然的另一个实施方案中，通过过滤回收真菌菌丝体，在冷冻干燥机中干燥并且在超声使细胞裂解后用甲醇反复抽提。用有机溶剂抽提的粗提取物在30℃的温度下在旋转蒸发器上浓缩。用石油醚处理所得到的粗提取物以除去石油醚组分，用氯仿处理以除去氯仿组分并最后用乙酸乙酯处理以除去乙酸乙酯组分。最后留在锥形瓶内的水溶液组分中含有粗的白色粉末，它构成了大约70％的总的粗提取物。
在本发明的另一个实施方案中，所述白色粉末的NMR显示它含有多元醇，并且将其NMR光谱数据与标准物比较显示该多元醇是甘露醇。用嘧啶和乙酸酐使甘露醇乙酰化得到六乙酰化(hexacetate)甘露醇，其光谱值进一步确定了甘露醇的存在。
在本发明的仍然的另一个实施方案中，将粗甘露醇在G-10载体上进行色谱层析用于提纯。
在本发明的一个优选的实施方案中，所用的流动相包括甲醇∶水(95∶5)以得到纯甘露醇。
附图的简要描述
图1表示的是提取和纯化甘露醇的流程图。
借助下面实施例对本发明进一步详细描述并且不能解释为限制本发明的范围。
实施例1红树植物，Acanthus illicifolius的树叶来自于印度的果阿海岸的新瓜利母。该真菌菌种栖息在Acanthus illicifolius上，但对宿主不会造成明显的伤害。该真菌是从健康的幼叶中分离出来的，其中所述的健康的幼叶上看不出真菌感染的症状。
将Acanthus的新鲜的幼叶收集之后，将它们装入无菌聚乙烯塑料袋内转移到实验室。将树叶用无菌的经过滤的海水漂洗以去除所粘的杂质颗粒和沉砂物质。接着将树叶在无菌培养室中放置两个星期。两星期末，用无菌解剖刀将树叶切碎并将碎片置于PDA培养皿上。将单独的菌落在无菌条件下挑出并将其反复转移到PDA培养皿上以得到纯菌种。
实施例-2被分离的菌种被鉴定为Curvularia lunata，NIO-FM1E#001。NIO-FM1E#001菌落生长快，颜色为褐色到黑褐色，背面为黑色。孢子是淡褐色并具有三个或更多个的横隔膜并且在合轴延伸的弯曲的孢子内通过孔(孢子孔)在顶端形成。孢子是圆柱或略微弯曲的，其中一个中心细胞是较大和较深色的。
被纯化的菌种在PDA斜面上生长7天。将支持菌丝体生长的琼脂填充物切割并将其在无菌的条件下转移到含有25ml马铃薯葡萄糖肉汤(HiMedia Laboratories Ltd)的100ml厄伦美氏锥形瓶内，其中马铃薯葡萄糖肉汤在海水∶蒸馏水(1∶1)中制备。肉汤中的碳源是马铃薯淀粉4g/l和葡萄糖20g/l。锥形瓶在上在振荡条件下在28-30℃之间培养4-5天。从上述锥形瓶中得到的次级培养物(subculture)在无菌条件下被转移到含有1升上述培养介质的5升培养瓶中。接种是在使发酵介质的温度保持在40-45℃之间进行的。接种之后，培养瓶在振荡条件下在28-30℃之间培养18天。
实施例3在培养结束时，通过过滤将菌丝体回收并在冷冻干燥器中进行干燥以确定生物量。用甲醇抽提干燥的菌膜(饼)几次并反复超声菌饼以使细胞裂解。在真空蒸发的条件下将所获得的滤液浓缩以使它于有机溶剂分离。这样就获得了样品的粗提取物。将得到的粗提取物连续的用极性升高的溶剂如石油醚，氯仿和乙酸乙酯处理以分别分离出石油醚组分，氯仿组分和乙酸乙酯组分。最后的水溶液组分含有白色粉末的糖醇，它构成了约70％总的粗提取物。
实施例4使用甲醇∶水(95∶5％)作为洗脱剂在G-10载体上对白色粗粉末进行色谱层析，使之与任何可能的盐杂质分离。通过将其NMR数据与在Aldrich Catalogue，Vol.1，289c报道的光谱的比较对得到的纯甘露醇进行鉴定。
实施例5将上述甘露醇的亚组分进行乙酰化得到多元醇的乙酰化衍生物并且通过各种光谱方法进一步鉴定其结构。
为了乙酰化，将甘露醇(30mg)溶解在嘧啶(2ml)中，向其中加入3ml乙酸乙酐的嘧啶溶液并过夜。将混合物置于氯仿中并用稀释的HCl洗涤以除去嘧啶。接着用蒸馏水洗涤。蒸发掉氯仿并且将残留物在硅胶上进行色谱层析得到35mg的六乙酰化甘露醇，其结构通过光谱方法以及与报道过的光谱数据(Fairbanks and Sinary，1995)的比较得到确定。
本发明的优点1.这是甘露醇的一种新来源。
2.它是一种常见的真菌(发现依附在Acanthus illicifolius的红树叶上，来自于果阿海岸)。
3.易于分离和培养。
4.为获得最大产量而使用的发酵介质的成本低廉。
5.发酵条件可行并在实验室中易于进行。
6.二级代谢产物易于从主化合物中分离出来。
7.使用标准的技术保存并在需要时活化。
8.与现有的甘露醇的商业制备比较本发明的从真菌菌膜中提取甘露醇和纯化甘露醇的工艺包括简便的技术。
9.我们使用常温和常压并且在制备甘露醇中不用催化剂。目前商业上，甘露醇仍然使用氢气在高温和高压以及阮尼镍做催化剂的条件下通过催化氢化50∶50的果糖∶葡萄糖混合物制备。
10.我们制备了高产量的甘露醇(约70％的粗提取物)且没有其他的多元醇杂质。目前商业上，果糖糖浆或转化糖的氢化得到另外一种糖醇，山梨醇的共产物，并且甘露醇的产量仅为25％。
11.在本发明中，使用G-10作为载体对粗甘露醇进行色谱层析，使用甲醇∶水(95∶5)作为洗脱剂用于最终的纯化。另一个方面，目前的甘露醇的商业制备中的纯化步骤是繁琐的。
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权利要求
1.一种与植物红树伴生的国际保藏编号为MTCC 5109的真菌新月弯孢菌(Culvularia lunata)。
2.如权利要求1中所述的真菌，其中所述的红树植物是Acanthus illicifolius。
3.如权利要求1中所述的真菌，其中所述的真菌是快速生长的真菌。
4.如权利要求1中所述的真菌，其中所述的真菌的颜色是褐色至黑褐色，背面为黑色。
5.如权利要求1中所述的真菌，其中所述的真菌具有带有三个或多个横隔膜的淡褐色的孢子并在合轴延伸的弯曲状的分生孢子柄内通过孔(孢子孔)在顶端形成。
6.如权利要求1中所述的真菌，其中所述的真菌显示圆柱或略微弯曲形状的孢子，其中一个中心细胞是较大和较深色的。
7.一种从与植物红树伴生的国际保藏编号为MTCC5109的真菌Culvularia lunata中获得高产量的纯甘露醇的简便并且有效的方法，所述的方法包括的步骤有a.采集植物红树的树叶，b.在无菌的海水中将树叶漂洗并将它们保存在潮湿的无菌培养室中约两个星期，c.将树叶切成小碎片并将其置于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养皿上培养约48小时，d.在无菌条件下将单独的菌落转移到无菌的新的PDA培养皿内以获得纯菌种，e.将被分离的真菌菌种在PDA斜面上培养约7天以获得菌丝体，f.将菌丝体转移到具有海水和蒸馏水的新鲜的PDB内，并用淀粉和糖作为碳源，g.在26-32℃之间的温度范围内将菌种培养约3-6天以获得接种体，h.将具有接种体并含有海水和蒸馏水的PDB进行培养，i.将培养物保持温度在26-47℃范围之间并且盐度保持在4-32ppt范围之间并间歇给予刺激条件培养约17-19天以获得菌丝体薄膜，j.将所获得的菌丝体薄膜超声使细胞裂解，k.反复使用甲醇从被超声的菌丝体膜中抽提粗抽提物，l.浓缩所得到的粗抽提物，m.用极性升高的溶剂处理所得到的已浓缩过的粗抽提物，n.处理后得到含有粗甘露醇的白色粉末残留物的水溶液组分，o.通过色谱层析纯化所得到的粗甘露醇以获得纯甘露醇，含量约为总的粗抽提物的75％。
8.如权利要求7中所述的方法，其中所述的植物是Acanthus illicifolius。
9.如权利要求7中所述的方法，其中所述的淀粉的浓度范围是3-5g/l之间。
10.如权利要求7中所述的方法，其中所述的葡萄糖的浓度范围是18-22g/l之间。
11.如权利要求7中所述的方法，其中所述的海水和蒸馏水的比例范围是1∶5至5∶1之间，优选1∶1。
12.如权利要求7中所述的方法，其中所述的刺激条件是温度范围为40-45℃之间。
13.如权利要求7中所述的方法，其中所述的刺激条件是盐度范围在15-17ppt之间。
14.如权利要求7中所述的方法，其中所述的刺激条件导致产生高百分比产量的甘露醇。
15.如权利要求7中所述的方法，其中所述的树叶是活的幼叶。
16.如权利要求7中所述的方法，其中使用真空蒸发器在28-32℃之间的温度范围内浓缩粗提取物。
17.如权利要求7中所述的方法，其中所述的极性升高的溶剂是石油醚，氯仿，和乙酸乙酯。
18.如权利要求7中所述的方法，其中所述的色谱层析是在G-10载体上进行。
全文摘要
本发明涉及一种与植物红树伴生的国际保藏编号为MTCC5109的真菌新月弯孢菌(Culvularia lunata)，和一种从与植物红树伴生的真菌新月弯孢菌(Culvularia lunata)中获得高产量纯甘露醇的简便并且有效的方法，所述的方法包括的步骤是将所述植物树叶切成小碎片并将其置于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养皿上培养48小时，培养基的温度保持在26－47℃的范围之间并且盐度保持在4－32ppt的范围内并在间歇刺激条件下培养17－19天以获得菌丝体膜，将该菌丝体膜超声使细胞裂解，反复使用甲醇从被超声的菌膜中抽提粗抽提物，浓缩所得的粗抽提物，用极性升高的溶剂处理所得到的已经浓缩了的粗抽提物，在处理后获得含有粗甘露醇的白色粉状残留物的水溶液组分，通过色谱层析提纯所得到的粗甘露醇以获得约占总粗抽提物75％的纯甘露醇。
文档编号C12P7/18GK1788076SQ200380110351
公开日2006年6月14日 申请日期2003年11月4日 优先权日2003年6月19日
发明者普拉布哈·德维, 潺卓肯特·乔万德·奈克, 索里玛比·瓦希杜拉, 里塞特·德'苏扎, 伊利·罗德里格斯, 阿沙·派克蒂 申请人:科学与工业研究委员会