G蛋白偶联受体激酶的新用途的制作方法

专利名称：G蛋白偶联受体激酶的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域。具体地说，本发明涉及G蛋白偶联受体激酶的新用途。
背景技术：
G蛋白偶联受体激酶(G protein-coupled receptor kinases，GRKs)是一类丝/苏氨酸蛋白激酶家族，该家族的一个基本功能特征就是它专一地磷酸化活化(结合了信号分子)的G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors，GPCRs)。被GRKs磷酸化的G蛋白偶联受体对β-滞留蛋白具有靶向性，β-滞留蛋白与磷酸化受体的结合阻止了受体再次偶联G蛋白并介导了受体进一步的内吞作用，从而有效地降低了细胞膜上功能受体的水平，实现了信号减敏。
G蛋白偶联受体中肾上腺素能受体和毒蝇碱性胆碱能受体在维持血液循环系统稳定平衡过程中具有重要的作用，对心脏的功能具有特别重要的作用。其中肾上腺素能受体已经研究比较透彻，而且已经被作为药物作用的靶点开发了很多药物，其中α-和β-阻断剂已经被广泛应用于高血压和心肌类疾病的治疗。目前已经克隆得到的肾上腺素能受体(βAR)至少有九种，包括三种α1型，三种α2型和三种β型受体。在心脏中表达最多的是β1型受体，它占了β型受体的75～80％，而β型受体的表达量大约是所有α型受体的十倍。心脏中的βAR可以通过接受儿茶酚胺类神经递质、去甲肾上腺素和肾上腺素信号，控制心率、心肌收缩力量(Rockman HA，Koch WJ，Lefkowitz RJ.2002.Seven-transmembrane-spanning receptors and heart function.Nature 415(6868)206-12)。
GRK2是GRK家族各亚型在心脏中表达最多的一种。研究发现在很多种心血管系统紊乱的情况下都伴随着βAR介导的信号转导显著的削弱和GRK2表达量及活力的提高。在心肌肥大，局部贫血和心力衰竭等心血管疾病的动物模型中都观察到了GRK2表达量增加。心力衰竭晚期患者心脏中βAR的mRNA、蛋白表达量和活力都提高到了健康心脏的三倍，而这一现象显然和衰竭的心脏中βAR信号通路的机能障碍及心肌收缩力减弱有关。GRK2在多种不同病理条件导致的心力衰竭中都存在活力和表达量的增加的现象。通过采用一种心脏组织特异性的基因启动子——大鼠的αMHC启动子，可以使各种GRK在转基因动物的心肌中特异性表达，从而研究它们在心力衰竭中的作用。研究发现过量表达GRK2的转基因老鼠的心室由βAR刺激产生的收缩力大大降低；而过量表达GRK2的C末端194个氨基酸肽段(认为可以竞争结合G蛋白βγ亚基的GRK2的一段抑制肽)的老鼠则相反的表现为收缩力增强。不同亚型的GRK在心脏中具有不同的受体底物选择性。已经发现GRK2对βAR和血管紧张素II具有脱敏作用，GRK5可以对βAR脱敏而对血管紧张素II没有作用，与GRK2同源性最高的GRK3则只发现对α-1BAR起作用。对以上三种GRK进行基因敲除也得到了迥然不同的结果。完全敲除GRK2导致老鼠在胚胎阶段死亡；GRK2基因敲除的杂合老鼠，也就是GRK2表达量为正常量50％的老鼠表现出类似转基因GRK2C末端194个氨基酸残基的老鼠的表型——βAR信号通路的增强和心脏收缩力增加。相反GRK3和GRK5基因敲除的老鼠在心脏机能上没有明显的影响。这与上文提到的βAR是心脏中最主要的受体，它介导的信号调节了心脏的主要功能是一致的。
在心力衰竭产生过程中GRK2水平的提高是一个早期发生的过程，对于这一过程发生的原因现在认为是和交感神经系统的激活有关。交感神经激活释放了大量的βAR激动剂，使βAR长时间过度活化，从而使心脏提高GRK2水平以减弱βAR作用而做出的一种适应性反应。然而对于后来的心力衰竭的产生，GRK2的提高显然产生的是一种负面作用。对这种现象的一种解释是细胞在提高GRK2水平减弱βAR作用后缺少一种机制来把GRK2降低到原来的水平。目前已有的对心力衰竭有治疗效果的经典药物例如βAR阻断剂和血管紧张素转换酶的抑制剂都能够降低GRK2的表达量。前文已经提到GRK2的C末端转基因老鼠可以抑制原有的GRK2活力并增强心脏的βAR信号和心肌的收缩力。进一步的实验证明在肌浆内质网钙结合蛋白过量表达等几种导致心力衰竭的老鼠病理模型中通过转基因技术导入GRK2的C末端都有非常明显的治愈效果。而转基因技术和βAR阻断剂同时使用效果更佳。但是通过转基因使βAR过量表达来实现βAR信号的增强却没有明显的治疗效果，这说明GRK2不仅仅是通过抑制βAR信号来导致心力衰竭，而可能还有其它G蛋白偶联受体介导的信号可能也参与了心力衰竭的产生。所以GRK2可能是比βAR更好的药物作用靶点，降低GRK2的表达量或者是抑制其活力是一种具有非常好前景的治疗方案。筛选GRKs尤其是GRK2的小分子抑制剂将是开发新型的心血管药物的重要方向(Iaccarino G，Koch WJ.2003.Transgenic mice targeting the heart unveil G protein-coupled receptor kinases astherapeutic targets.Assay.Drug Dev.Technol.1(2)347-55)。
Iaccarino等的工作充分证明了GRK2可以作为心力衰竭等心肌类疾病的药物作用靶标蛋白质，抑制GRKs活性或者降低GRKs(尤其是GRK2)的表达水平已经证明可能是一种新的具有良好前景的治疗方案。在Gan XQ等2000.J.Biol.Chem.275(12)8469-74中，已经证明了GRK2的C端结构域，或者更具体地说是其中的保守区域，在激酶与受体的相互作用中起着重要的作用。然而，仍然需要对该区域进行进一步的分析以便寻找到可用于药物筛选的靶位点。

发明内容
本发明者在以前的工作基础上作了进一步的深入研究，结果发现GRKs家族C端结构域的保守区域内存在一个保守的脯氨酸丰富的结构花色(motif)是GRKs磷酸化受体所需的关键位点，从而为筛选GRK的抑制剂提供了很好的筛选模型和为设计分子药物提供了作用的靶位点。
为实现上述目的，本发明一方面提供了一种筛选G蛋白偶联受体激酶抑制剂的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤a)提供G蛋白偶联受体激酶突变体，所述突变体在多脯氨酸结构花色中有突变；b)使所述G蛋白偶联受体激酶突变体以及野生型G蛋白偶联受体激酶分别与候选物混合；c)测定所述突变体以及野生型G蛋白偶联受体激酶与候选物结合的能力并进行比较；d)选出化合物作为G蛋白偶联受体激酶抑制剂，所述化合物与突变体不结合但与野生型G蛋白偶联受体激酶结合。
在本发明中，所述“多脯氨酸结构花色(motif)”在G蛋白偶联受体激酶C端保守区域中存在的富含脯氨酸的序列内(具体是GRK2的466-479位氨基酸或其它GRK亚型中的与之对应的部分(如GRK1的465-478位，GRK5的471-483位)内)，该多脯氨酸结构花色的形式为“PP**P”，即连续两个脯氨酸，两个任意氨基酸，再接一个脯氨酸。所述突变宜在GRK2的468、469、472位或其它GRK亚型的对应位置上。更佳的是，所述突变在GRK2的467、468、469、472位。在一个较佳的实施方案中，所述突变是将脯氨酸突变成丙氨酸。然而，本领域技术人员也能够理解，将所述氨基酸突变成其它氨基酸也是可行的。另外，对目标氨基酸序列进行定点突变的手段也是本领域技术人员所熟知的。
在本发明的方法中，候选物可以是多肽，也可以是小分子化合物。在候选物是多肽的情况下，可采用例如噬菌体展示技术对噬菌体展示随机多肽库进行筛选。测定候选物与突变型或野生型G蛋白偶联受体激酶结合的试验包括各种常规技术，其可根据具体需要由本领域技术人员来确定。由于突变型与野生型的区别存在于多脯氨酸结构花色中，所以，根据候选物与突变型或野生型的结合差异可以确定该候选物与多脯氨酸结构花色发生结合，从而筛选出能抑制G蛋白偶联受体与G蛋白偶联受体激酶结合的物质。
在另一较佳的实施方案，还可对筛选出的物质进行进一步的确认，例如，测定其对G蛋白偶联受体激酶介导的视紫红质磷酸化是否有抑制作用以及对小肽底物的磷酸化是否有影响，选出对GRK2介导的视紫红质磷酸化有抑制作用，而对其磷酸化小肽底物没有影响的化合物或多肽作为有效的抑制剂。
在另一较佳的实施方案中，所述G蛋白偶联受体激酶宜为GRK2，所述G蛋白偶联受体激酶突变体宜具有467、468、469、472位突变(如突变成丙氨酸)。
因此，本发明另一方面还提供了一种分离的G蛋白偶联受体激酶突变体，所述突变体为多脯氨酸结构花色中有突变的G蛋白偶联受体激酶。较佳的是，该突变体在对应于GRK-2中468、469和472位的氨基酸位置上有突变。更佳的是，该突变体为467、468、469、472位突变成丙氨酸的GRK2。
本发明另一方面还涉及一种改变G蛋白偶联受体激酶对受体磷酸化作用的方法，该方法包括对所述G蛋白偶联受体激酶的对应于GRK2中468、469和472位的氨基酸进行突变。
本发明另一方面还涉及上述G蛋白偶联受体激酶突变体在筛选G蛋白偶联受体激酶抑制剂的方法中用作参照的用途。
本发明另一方面还涉及一种计算机辅助设计G蛋白偶联受体激酶抑制剂的方法，该方法是以G蛋白偶联受体激酶的多脯氨酸结构花色为目标进行筛选。
由于GRK2的晶体结构在2003年已经被解析出来，所以在本发明发现了C端保守区中多脯氨酸结构花色起重要作用后，可以以GRK2的三维晶体结构为基础，对含有大量化合物结构的数据库进行模拟筛选，寻找可以和多脯氨酸结构花色结合的小分子化合物。这样的化合物由于结合了该位点而可能干扰GRK2和受体的相互作用，可能成为GRK2的高效抑制剂。在所述筛选方法，常用的筛选用的常用软件有DOCK，版本有4.02和5.0，前者可并行计算。在模拟筛选中，可根据活性中心的空间结构和化学性质确定筛选参数，先放宽参数进行粗筛，然后再用严格的参数细筛。适用于所述方法的常用相关数据库例如有ACD-SC或现有化学品目录三维结构(ACD-3D)数据库。前者是MDL公司专门为高通量筛选而开发的数据库。该数据库提供了化学品供应商所能够提供的近200万个化合物的相关信息，其中180多万的化合物有三维结构。后者是将化学品的三维结构模型加入现有化学品目录(ACD)的标准数据库中。它是着手建立组合库的合适数据源，使用三维结构查寻搜索数据库，相关的分子三维框架结构和构建单元都能被快速地识别出来，是一种寻找可供筛选的、具有潜在药物活性的候选物的有效方法，30万候选物可以随时购买，无需合成，极大地缩短了漫长的化合物合成过程，不仅节约时间，而且降低合成费用。
附图简述

图1显示了GRK家族各成员的C端保守区与视紫红质的相互作用。其中图A为GRK家族的三个代表成员GRK1、GRK2和GRK5的C端保守区对GRK2介导的视紫红质磷酸化的影响。图B显示了GRK1-CC，GRK2-CC，GRK5-CC与视紫红质的直接相互作用(上图)和三种GST融合蛋白的SDS蛋白电泳胶考马斯亮蓝染色结果(下图)。
图2显示对参与GRK2-CC与视紫红质相互作用的位点进行突变分析。其中图A为GRK2-CC的缺失突变示意图。图B为上述突变体的GST融合蛋白的免疫印迹检测分析结果和SDS蛋白电泳胶考马斯亮蓝染色结果。图C中总结了GRK2-CC各种点突变与活化的视紫红质的相互作用。图D为多脯氨酸区的突变对GRK2-CC与视紫红质相互作用的影响。
图3显示了多脯氨酸区的突变对GRK家族C端保守区与视紫红质相互作用的影响。图A为GRK1-CC，GRK2-CC，GRK5-CC中的保守脯氨酸位点的序列比较。图B为牛GRK1-CC-3PA(467，468，471位脯氨酸同时突变为丙氨酸)和人源GRK5-CC-3PA(463，464，467位脯氨酸同时突变为丙氨酸)这两种突变与活化的视紫红质相互作用的结果。
图4显示了GRK2及其突变体的分析结果。图A为野生型和4PA突变型GRK2对视紫红质的磷酸化结果。图B为野生型和4PA突变型GRK2对小肽底物的磷酸化。图C为野生型GRK和4PA型突变酶被缺失磷酸化位点的视紫红质329G-Rho活化能力。
图5显示了GRK家族的三个代表成员C端保守区与非活化或光活化的视紫红质相互作用。
具体实施方案下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件(如Sambrook等，分子克隆实验室手册，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，1989中所述条件)实施，或按照制造厂商所建议的条件。另外，Gan XQ等2000.J.Biol.Chem.275(12)8469-74中的全部内容，包括野生型GRK2的表达和纯化、测活、视紫红质的制备、GRK2及其突变体对视紫红质的磷酸化试验、对合成的小肽(RRREEEEESAAA)的磷酸化反应试验等内容均纳入本文作为参考。
实施例1GRK2的C端结构域和C端保守区域与视紫红质的相互作用在GRKs家族中的保守性在Gan XQ等2000.J.Biol.Chem.275(12)8469-74中，已经证明了GRK2的CC区域(C端保守区域)能够与视紫红质相互作用。由于这段区域在GRKs家族中具有较高的保守性，为了研究这一相互作用是否在GRKs家族中也是保守的，选择GRKs家族另外两个亚家族的代表GRK1和GRK5来检测它们的C端保守区与视紫红质的相互作用。首先，检测这两个肽段对GRK2磷酸化视紫红质活性的影响。以GST融合的形式在大肠杆菌中表达这两个肽段，并利用GSH-Sepharose亲和柱分离纯化得到融合蛋白。三种蛋白分别各以2μM和6μM的浓度与3μM的视紫红质在20μL反应体系(20mM Tris-HCl，pH 7.5，0.1mM[γ-32P]ATP(～0.5cpm/fmol)，7.5mM MgCl2和2mMEDTA)中混合，在加入100ng纯化的GRK2后开始反应，30℃反应5分钟后终止。结果以GST作为对照通过放射自显影分析定量，所示结果为两次实验的平均值±偏差。结果如图1A所示，这两个肽段都能够同GRK2-CC一样有效地抑制GRK2的活性。
同样，进一步通过将这三种GST融合蛋白及对照GST结合在GSH亲和树脂上，与视紫红质进行体外结合实验。将1μg活化的视紫红质分别与已预先结合GST融合蛋白(GRK1-CC，GRK2-CC，GRK5-CC大约各1-2μg)的GSH-Sepharose树脂4℃光照条件下混合1小时，经过结合、洗涤后，加入SDS电泳样品缓冲液洗脱，电泳后通过视紫红质特异性抗体用免疫印记检测分析结合在上的视紫红质。结果如图1b所示，三种GRK的CC的确都能够特异性的结合视紫红质。
实施例2GRKs的保守区参与和受体相互作用的关键位点研究在确定了GRK家族的C末端保守区和受体相互作用的功能后，发明人进一步尝试寻找CC区域上与视紫红质的具体结合位点。首先，选择GRK2的CC区域做了如图2A的几个缺失突变体的GST融合蛋白，并且也以GST融合蛋白形式在大肠杆菌中表达并体外纯化。用上文所述方法做这几个缺失突变与视紫红质的体外结合实验。具体是，将上述突变体以GST融合蛋白形式通过GSH树脂纯化，将1μg活化的视紫红质分别与已预先结合1-2μg各种突变体的GST融合蛋白的谷胱甘肽树脂20μL在4℃光照条件下混合1小时，经过结合、洗涤后，加入SDS电泳样品缓冲液洗脱，电泳后通过视紫红质特异性抗体用免疫印记检测分析结合在上的视紫红质。蛋白质免疫印迹检测结果如图2B所示。结果表明，GRK2-CC的N端缺失466～479位氨基酸以及C端缺失516～531位氨基酸的两个突变都丧失结合视紫红质的能力。因此，推测负责结合视紫红质的位点就包含在这两段序列之中。
通过同源比较GRK1、GRK2、GRK5的氨基酸序列，找到了几个在GRK家族中保守的位点进行点突变，突变位点及结果列表如图2C所示。在GRK2 CC区域的466～479位氨基酸中，有个保守的多脯氨酸区，在将467/468/469/472位脯氨酸突变成丙氨酸后，该片段就丧失了和视紫红质结合的能力(结果如图2D所示)。
为了进一步确定这个多脯氨酸是否在GRKs家族与受体相互作用过程中起相同的作用，通过比较这段脯氨酸丰富区的同源性(如图3A)，找到了GRK1和GRK5的对应保守位点，又构建了GRK1-CC-3PA(P467A/P468A/P471A)和GRK5-CC-3PA(P463A/P464A/P467A)两种突变体的GST融合蛋白，并在体外表达纯化，在GSH树脂上和光激活的视紫红质体外结合。如图3B所示，GRK1和GRK5的CC脯氨酸突变型相比野生型也丧失了结合受体的能力。
为了进一步验证这个多脯氨酸结构花色的重要性，发明人又把这4个脯氨酸的突变引入到GRK2全酶中进行分析。在大肠杆菌中表达纯化GRK2野生型和GRK2-4PA(这四个脯氨酸突变为四个丙氨酸)突变型酶，分别用合成的小肽RRREEEEESAAA和视紫红质作为底物检测GRK2野生型和突变型的活力。通过小肽体外磷酸化和对小肽中掺入的同位素计数，随时间变化看小肽中掺入的同位素磷的量。如图4B所示，突变型的GRK2仍有野生型80％的活力，表明这四个脯氨酸突变并没有显著影响GRK2的催化结构域的活力以及整个酶分子的空间结构。然而，对比野生型GRK2，突变型完全丧失了磷酸化视紫红质的能力，见图4A。另外如图4C所示，4PA突变型的GRK2也能够被视紫红质缺失C末端磷酸化位点的视紫红质微弱地激活，以上性质都和Gan XQ等2000.J.Biol.Chem.275(12)8469-74中提到的ΔCC一致。以上结果有力地说明GRK家族C末端保守区对于GRKs家族与受体相互作用起了关键作用，其中的多脯氨酸位点是这一相互作用的关键位点，甚至可能是直接参与相互作用的关键残基。
由于GRKs的一个显著特性就是它们只特异性地识别并磷酸化活化形式的GPCR。因此发明人还进一步检测了GRKs的C末端保守区与受体的相互作用是否依赖于受体的活化。通过在微弱红光下置备得到非活化的视紫红质，在实验过程中通过光照与否决定其是活化或非活化状态来进行体外结合实验。如图5所示三种GRK的C端保守区都只特异性结合光活化的视紫红质，从而由有力地证明了该相互作用是负责酶与其活化受体底物之间的识别过程的。
实施例3筛选模型的建立用噬菌体展示技术对噬菌体展示随机多肽库进行筛选。具体是，采用GST融合表达的野生型GRK2 466～531AA最小功能肽段，将该野生型肽段通过GST结合在GSH亲和树脂上，然后加入随机肽噬菌体库充分结合，洗涤后，对洗脱的噬菌体进行扩增，再以同样方式进行第二轮筛选。同时，采用如上文实施例2中所述的GRK2467/468/469/472位脯氨酸突变为丙氨酸的突变型肽段作为对照。经过几轮筛选结合率上升达到平台后，用对照的突变型肽段充分结合，去除两者都能结合的噬菌体。最后得到的噬菌体挑单克隆扩增后再次检测和两种肽段结合的差异。如果确实存在差异，则表明筛选出的多肽可能含有结合在多脯氨酸位点的肽段，然后通过测序得到肽段的序列。
以上述类似方法筛选化合物库，找到结合差异的通过质谱鉴定为何种化合物，最后再用纯的该化合物进行验证。
然后，将以上得到的多肽或化合物再加入到GRK2的测活体系中，按照上文所述方法测试所得化合物对GRK2介导的视紫红质磷酸化的抑制作用以及对其小肽底物磷酸化的作用，选出对GRK2介导的视紫红质磷酸化有抑制作用，而对其磷酸化小肽底物没有影响的化合物或多肽作为有效的抑制剂，用于进一步研究。
实施例4计算机模拟药物筛选和辅助设计根据C端保守区中的多脯氨酸结构花色所起的重要作用，以GRK2的三维晶体结构为基础，用DOCK 4.02版对含有大量化合物结构的数据库如ACD-SC、ACD-3D进行模拟筛选，以寻找出可以和多脯氨酸结构花色结合的小分子化合物。然后，将所得的化合物加入到GRK2的测活体系中，测定其抑制GRK2介导的视紫红质磷酸化的效果。这样的化合物由于结合了该位点而可能干扰GRK2和受体的相互作用，可能成为GRK2的高效抑制剂。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种筛选G蛋白偶联受体激酶抑制剂的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤a)提供G蛋白偶联受体激酶突变体，所述突变体在多脯氨酸结构花色中有突变；b)使所述G蛋白偶联受体激酶突变体以及野生型G蛋白偶联受体激酶分别与候选物混合；c)测定所述突变体以及野生型G蛋白偶联受体激酶与候选物结合的能力并进行比较；d)选出化合物作为G蛋白偶联受体激酶抑制剂，所述化合物与突变体不结合但与野生型G蛋白偶联受体激酶结合。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤e)测定步骤d)选出的化合物对G蛋白偶联受体激酶介导的视紫红质磷酸化的抑制作用和对小肽底物的磷酸化作用。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述G蛋白偶联受体激酶为GRK-2。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多脯氨酸结构花色中的突变是将GRK-2的467、468、469和472位、GRK-1的467、468、471位或GRK-5的463、464、467位脯氨酸突变成丙氨酸。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述候选物包括多肽和有机化合物。
6.一种分离的G蛋白偶联受体激酶突变体，其特征在于，所述突变体在多脯氨酸结构花色中有突变。
7.根据权利要求6所述的分离的G蛋白偶联受体激酶突变体，它在对应于GRK-2中467、468、469和472位的氨基酸位置上有突变。
8.权利要求6所述的G蛋白偶联受体激酶突变体在筛选G蛋白偶联受体激酶抑制剂的方法中用作参照的用途。
9.一种计算机辅助设计G蛋白偶联受体激酶抑制剂的方法，其特征在于，以G蛋白偶联受体激酶的多脯氨酸结构花色为目标进行筛选。
10.一种改变G蛋白偶联受体激酶对受体磷酸化作用的方法，其特征在于，对所述G蛋白偶联受体激酶的对应于GRK-2中468、469和472位的氨基酸进行突变。
全文摘要
本发明涉及一种筛选G蛋白偶联受体激酶抑制剂的方法，该方法包括以下步骤a)提供G蛋白偶联受体激酶突变体，所述突变体在多脯氨酸结构花色中有突变；b)使所述G蛋白偶联受体激酶突变体以及野生型G蛋白偶联受体激酶分别与候选物混合；c)测定所述突变体以及野生型G蛋白偶联受体激酶与候选物结合的能力并进行比较；d)选出化合物作为G蛋白偶联受体激酶抑制剂，所述化合物与突变体不结合但与野生型G蛋白偶联受体激酶结合。
文档编号C12N9/00GK1724657SQ20041005294
公开日2006年1月25日 申请日期2004年7月19日 优先权日2004年7月19日
发明者李林, 甘肖箐, 马志海, 邓宁, 王计勇 申请人:中国科学院上海生命科学研究院