专利名称：5'－核苷酸酶活性测定方法及5'－核苷酸酶诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种测定5′-核苷酸酶活性的方法，同时本发明还涉及用于实现该方法的5′-核苷酸酶诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。
背景技术：
医学研究表明，5′-核苷酸酶(5NT)增高主要见于阻塞性黄胆，也可见于肝癌和肝炎。在胆汁淤积并发胆管炎、原发性和继发性胆汁性肝硬化和慢性肝炎时，5NT升高率高于碱性磷酸酶；肝肿瘤和肝肉芽肿时5NT升高的敏感性高于碱性磷酸酶。因为5′-核苷酸酶活性无生理性升高，对于诊断婴幼儿肝病和妊娠性肝功胆汁淤积较碱性磷酸酶不但敏感，而且有特异性。因此测定5′-核苷酸酶的活性对于疾病的诊断具有重要意义。
5′-核苷酸酶的活性测定方法很多，主要有同位素底物法、化学强酸测磷法(1925年)。据申请人了解，目前国际上普遍采用同位素底物测试法，方法为5′-核苷酸酶作用于H3-dUMP，终止反应后，通过离子交换层析柱分析结果，求得5′-核苷酸酶活性。或者利用5′-核苷酸酶作用于单磷酸腺苷后产生无机磷，再用化学强酸法分析无机磷含量得以计算出5′-核苷酸酶的活性。
同位素底物法方法复杂还有同位素污染，而且需要同位素测定仪，因此难以切实推广应用。无机磷测定法是1925年发明的方法，准确度不好，强酸污染环境等等，也不适合推广应用。
发明内容
提出一种可以克服以上现有技术缺点的5′-核苷酸酶活性的测定方法，同时给出用以实现该方法的5′-核苷酸酶诊断试剂盒。采用该试剂盒中的试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪上进行5′-核苷酸酶活性测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明测定5′-核苷酸酶活性的步骤如下1)、将样品与主要由尿苷单磷酸、还原型辅酶、尿苷核苷酶、二氢胸腺嘧啶脱氢酶组成的试剂混合，使之发生如下原理的反应尿苷单磷酸+水5核苷酸酶尿苷+磷酸根尿苷+水尿苷核苷酶核糖+尿嘧啶尿嘧啶+还原型辅酶二氢胸腺嘧啶脱氢酶二氢尿嘧啶+氧化型辅酶2)、检测最终反应物在主波长340nm吸光度下降的速度，测算出5′-核苷酸酶的活性大小。
通常步骤2)将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出5′-核苷酸酶的活性大小。
以上样品与试剂的混合比例按体积为1/10到1/250，以上过程的测定温度控制在常规的20℃到50℃范围，反应时间控制在常规的2-30分钟。
本发明应用5′-核苷酸酶偶联尿苷核苷酶(EC 3.2.2.3)、二氢胸腺嘧啶脱氢酶(EC 1.3.1.2)反应连续监测法。5′-核苷酸酶水解尿苷单磷酸产生尿苷，然后尿苷核苷酶催化尿苷产生尿嘧啶，尿嘧啶再通过偶联二氢胸腺嘧啶脱氢酶的作用，将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为氧化型辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算5′-核苷酸酶的活性大小。
实现本发明方法的5′-核苷酸酶诊断试剂盒可以是单剂，包括缓冲液 40——200mmol/l尿苷单磷酸 0.5——50mmol/l还原型辅酶 0.15——0.3mmo/l尿苷核苷酶 500——50000U/l二氢胸腺嘧啶脱氢酶 500——50000U/l稳定剂 10——80％(总体积)也可以将以上单剂配成如下双剂，更有利于消除内、外源尿苷、尿嘧啶污染试剂I缓冲液 40——200mmol/l还原型辅酶 0.15——0.3mmo/l尿苷核苷酶 500——50000U/l二氢胸腺嘧啶脱氢酶 500——50000U/l稳定剂 10——80％(总体积)试剂II缓冲液 40——200mmol/l尿苷单磷酸 0.5——50mmol/l稳定剂 10——50mmol/l双剂的配方不仅限于上述配方，其中的试剂I的成分，还原型辅酶、尿苷核苷酶、二氢胸腺嘧啶脱氢酶等可以放在试剂II，试剂II其中的成分，尿苷单磷酸也可以放在试剂I，如此可以形成多种配方，不在此一一详述。
还可以将试剂配成如下三试剂，不但更有利于消除内、外源尿苷、尿嘧啶污染，还更有利于试剂的稳定试剂I缓冲液40——200mmol/l还原型辅酶0.15——0.3mmo/l稳定剂10——50mmol/l试剂II缓冲液40——200mmol/l尿苷核苷酶500——50000U/l二氢胸腺嘧啶脱氢酶500——50000U/l稳定剂10——80％(总体积)试剂III缓冲液40——200mmol/l尿苷单磷酸0.5——50mmol/l稳定剂10——50mmol/l三剂的配方不仅限于上述配方，其中的试剂I的成分，还原型辅酶可以放在试剂II或试剂III中。试剂II其中的成分，尿苷核苷酶、二氢胸腺嘧啶脱氢酶等也可以放在试剂I或试剂III中。试剂III其中的成分，尿苷单磷酸也可以放在试剂I或试剂II中，如此可以形成多种配方，不一一详述。
缓冲剂的pH范围可以是6.0～11.0。缓冲剂可以是三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸(Tris-HCl)缓冲液、磷酸盐(Phosphate)缓冲液、三乙醇胺(Triethanolamine)缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-l-propanol)缓冲液、咪唑(Imidazole)缓冲液或双甘氨肽(Glycylglycine)缓冲液等，但不仅限于这些缓冲液(例如还可以是咪唑/盐酸缓冲液6.2-7.8；磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液5.0-8.0；柠檬酸柠檬酸钠缓冲液5.0-6.6；磷酸盐缓冲液6.0-8.0；磷酸氢二钠—磷酸二氢钾缓冲液6.0-8.0；磷酸二氢钾氢氧化钠缓冲液6.0-8.0；巴比妥钠-盐酸缓冲液6.8-9.6；Tris盐酸缓冲液7.0-9.0；硼酸硼砂缓冲液7.4-9.0；甘氨酸-氢氧化钠缓冲液8.6-10.6；砂-氢氧化钠缓冲液9.2-10.0；碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液8.8-10.6(Ca2+、Mg2+存在时不得使用)；PBS缓冲液7.0-7.6等)。
以上还原型辅酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH等还原型烟酰胺辅酶或其衍生物。
此外，为了减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I、试剂II或三剂的试剂I、试剂II、试剂III中通常加入稳定剂10～80％或者10～50mmol/l，稳定剂可以是乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸胺或盐等中的一种或一种以上，还可以在硫基乙醇、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸盐、胆酸盐、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸、葡萄糖、谷氨酸盐、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、丁二酸盐等中选择。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下配方成分关系的本发明5′-核苷酸酶诊断试剂盒较为理想缓冲液80——120mmol/l尿苷单磷酸2——10mmol/l还原型辅酶0.2——0.3mmo/l尿苷核苷酶5000——10000U/l
二氢胸腺嘧啶脱氢酶5000——10000U/l稳定剂20——50％(总体积)由于本发明是完全利用酶学方法，酶解反应具有特异性高的特点，不易受到内、外源其他物质的干扰。酶法方法简便、易于操作。酶解反应的特异性促使测试结果精确。酶解反应都是在缓冲液条件下进行，没有污染环境问题。酶法方法不需要特殊、额外的仪器，测试成本低廉。因此可以保证具有较高的测试准确性，更便于推广应用。
此外，本发明的显著特色之一是可以消除内、外源尿苷、尿嘧啶的污染，消除内、外源尿苷、尿嘧啶的作用发生在整个反应时间段的前半部分，在后半段时间受污染的内、外源尿苷、尿嘧啶已经被消耗殆尽，而在后半段时间测试5′-核苷酸酶活性所需要的尿苷、尿嘧啶都是产生于5′-核苷酸酶的活性。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一(单剂)本实施例的5′-核苷酸酶诊断试剂盒包括缓冲液 80mmol/l尿苷单磷酸 2mmol/l还原型辅酶 0.2mmo/l尿苷核苷酶 5000U/l二氢胸腺嘧啶脱氢酶 5000U/l稳定剂 50％(总体积)在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm以上，被测5′-核苷酸酶样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应，延迟时间1分钟，检测时间2分钟，理论K值-4180。
加入样品和试剂后，使之混合，发生以下反应尿苷单磷酸+水5核苷酸酶尿苷+磷酸根尿苷+水尿苷核苷酶核糖+尿嘧啶尿嘧啶+还原型辅酶二氢胸腺嘧啶脱氢酶二氢尿嘧啶+氧化型辅酶将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出5′-核苷酸酶的活性大小。
本实施例应用5′-核苷酸酶偶联尿苷核苷酶(EC 3.2.2.3)、二氢胸腺嘧啶脱氢酶(EC 1.3.1.2)反应连续监测法。5′-核苷酸酶水解尿苷单磷酸产生尿苷，然后尿苷核苷酶催化尿苷产生尿嘧啶，尿嘧啶再通过偶联二氢胸腺嘧啶脱氢酶的作用，将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为氧化型辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算5′-核苷酸酶的活性大小。
实施例二(双剂)本实施例的5′-核苷酸酶诊断试剂有试剂I缓冲液100mmol/l还原型辅酶0.25mmo/l尿苷核苷酶8000U/l二氢胸腺嘧啶脱氢酶8000U/l稳定剂50％(总体积)试剂II缓冲液100mmol/l
尿苷单磷酸6mmol/l稳定剂20mmol/l测定5′-核苷酸酶活性时，温度控制在30℃，反应时间15分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm以上，被测5′-核苷酸酶样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应，延迟时间1分钟，检测时间2分钟，理论K值-4180。
具体测定步骤为尿苷单磷酸+水5核苷酸酶尿苷+磷酸根尿苷+水尿苷核苷酶核糖+尿嘧啶尿嘧啶+还原型辅酶二氢胸腺嘧啶脱氢酶二氢尿嘧啶+氧化型辅酶将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出5′-核苷酸酶的活性大小。
各反应步骤的反应时间控制在15分钟。
实施例三(三剂)本实施例的5′-核苷酸酶诊断试剂为三剂，有试剂I缓冲液120mmol/l还原型辅酶0.3mmo/l稳定剂20mmol/l试剂II缓冲液120mmol/l尿苷核苷酶10000U/l二氢胸腺嘧啶脱氢酶10000U/l稳定剂50％(总体积)
试剂III缓冲液120mmol/l尿苷单磷酸10mmol/l稳定剂20mmol/l在全自动生化分析仪上设定温度25℃，反应时间20分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm以上，被测5′-核苷酸酶样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应，延迟时间1分钟，检测时间2分钟，理论K值-4180。
具体测定步骤为尿苷单磷酸+水5核苷酸酶尿苷+磷酸根尿苷+水尿苷核苷酶核糖+尿嘧啶尿嘧啶+还原型辅酶二氢胸腺嘧啶脱氢酶二氢尿嘧啶+氧化型辅酶将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出5′-核苷酸酶的活性大小。
各反应步骤的反应时间控制在20分钟。
实施例四本实施例的5′-核苷酸酶诊断试剂有试剂I缓冲液100mmol/l还原型辅酶0.3mmo/l稳定剂20mmol/l试剂II缓冲液100mmol/l尿苷单磷酸3mmol/l
尿苷核苷酶6000U/l二氢胸腺嘧啶脱氢酶6000U/l稳定剂50％(总体积)在生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm以上，被测5′-核苷酸酶样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应，延迟时间1分钟，检测时间2分钟，理论K值-4180。
加入样品和试剂后，使之混合，发生以下反应尿苷单磷酸+水5核苷酸酶尿苷+磷酸根尿苷+水尿苷核苷酶核糖+尿嘧啶尿嘧啶+还原型辅酶二氢胸腺嘧啶脱氢酶二氢尿嘧啶+氧化型辅酶将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出5′-核苷酸酶的活性大小。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内、外源物质的污染。
权利要求
1.一种5′-核苷酸酶活性测定方法，步骤如下1)、将样品与主要由尿苷单磷酸、还原型辅酶、尿苷核苷酶、二氢胸腺嘧啶脱氢酶组成的试剂混合，使之发生如下原理的反应尿苷单磷酸+水5核苷酸酶尿苷+磷酸根尿苷+水尿苷核苷酶核糖+尿嘧啶尿嘧啶+还原型辅酶二氢胸腺嘧啶脱氢酶二氢尿嘧啶+氧化型辅酶2)、检测最终反应物在主波长340nm吸光度下降的速度，测算出5′-核苷酸酶的活性大小。
2.根据权利要求1所述5′-核苷酸酶活性测定方法，其特征在于所述步骤2)为，将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出5′-核苷酸酶的活性大小。
3.根据权利要求1或2所述测定5′-核苷酸酶活性的方法，其特征在于温度控制在20℃到50℃范围，反应时间控制在2-30分钟。
4.根据权利要求1或2所述测定5′-核苷酸酶活性的方法，其特征在于被测5′-核苷酸酶样品与试剂的比例控制在1/10到1/250。
5.一种5′-核苷酸酶诊断试剂盒，由以下成分组成缓冲液 40--200mmol/l尿苷单磷酸 0.5--50mmol/l还原型辅酶 0.15--0.3mmo/l尿苷核苷酶 500--50000U/l二氢胸腺嘧啶脱氢酶 500--50000U/l稳定剂 10--80％(总体积)
6.根据权利要求5所述5′-核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于所述试剂配成单剂、双剂或三剂。
7.根据权利要求5或6所述5′-核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于所述稳定剂为乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸铵或盐中的至少一种。
8.根据权利要求5或6所述5′-核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于所述缓冲剂的pH范围是6.0～11.0，所述缓冲剂是三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液、咪唑缓冲液或双甘氨肽缓冲液中的一种。
9.根据权利要求5或6所述5′-核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于所述还原型辅酶是NADPH、NADH或thio-NADH还原型烟酰胺辅酶或其衍生物中的一种。
全文摘要
本发明涉及一种测定5′－核苷酸酶活性的方法，同时本发明还涉及5′－核苷酸酶诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。该试剂盒包括缓冲液、尿苷单磷酸、还原型辅酶、尿苷核苷酶、二氢胸腺嘧啶脱氢酶、稳定剂，通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生酶偶联反应，再将最终反应物置于生化分析仪下，检测主波长吸光度变化的情况(速度)，从而测算出5′－核苷酸酶的活性大小。采用本发明完全可以通过生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内外源物质的污染，便于推广应用。
文档编号C12Q1/32GK1778950SQ20041006556
公开日2006年5月31日 申请日期2004年11月23日 优先权日2004年11月23日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司