专利名称：血氨含量测定方法及血氨诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种测定血氨含量的方法，同时本发明还涉及血氨诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。
背景技术：
氨测定方法有微量扩散法、离子交换法、酶法和氨电极法等。目前应用最多的方法是酶法和基于离子选择电极的血氨测定仪分析法。
扩散法是标本碱化后，释放出NH3，用酸滴定释放出的氨，或用Nessler反应形成棕黄色碘化双汞胺进行比色。这些方法需要碱化，内源性的氨形成造成影响，使其准确性和精密度受到影响，目前已很少应用；离子交换法比扩散法更准确，CV为8％--13％；离子选择电极法是利用NH3扩散到电极表面，引起电极的PH发生变化进行测定，该方法的CV为3.5％--4.8％，回收率高，但均需专门的仪器，不适合我国的具体实际。
检索中国专利，仅查出87105593.7号专利申请公开了一种血氨测定速冻杯，却未发现比较理想的血氨测定方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种可以克服以上现有技术缺点的血氨含量的测定方法，同时给出用以实现本发明方法的血氨诊断试剂盒。采用该试剂盒中的试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪上进行血氨含量测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明测定血氨含量的方法步骤如下1)、将样品与主要由2-酮戊二酸酯、还原型辅酶、腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸激酶、丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶组成的试剂混合，使之发生如下原理的反应氨离子+2-酮戊二酸酯+还原型辅酶谷氨酸脱氢酶谷氨酸+辅酶+水腺苷三磷酸+谷氨酸谷氨酸激酶腺苷二磷酸+谷氨酸5-磷酸腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸激酶腺苷三磷酸+丙酮酸丙酮酸+还原型辅酶乳酸脱氢酶乳酸+辅酶2)、检测最终反应物在主波长340nm吸光度下降的幅度，测算出血氨的含量。
通常步骤2)将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的程度，测算出血氨的含量。
以上样品与试剂的混合比例为按体积1/10到1/250，以上过程的测定温度控制在常规的20℃到50℃范围，反应时间控制在常规的2-30分钟。
这种方法应用谷氨酸脱氢酶偶联谷氨酸激酶、丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶反应连续监测法。氨、2-酮戊二酸酯与还原型辅酶通过谷氨酸脱氢酶的作用，产生谷氨酸，谷氨酸通过谷氨酸激酶催化和ATP生成ADP，ADP再和磷酸烯醇式丙酮酸在丙酮酸激酶的作用下最后产生丙酮酸，再通过偶联乳酸脱氢酶的作用，将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算腺苷脱氨酶的活性大小。本发明的优点是反应利用了二个分子的还原型辅酶，也产生了二个分子的氧化型辅酶，因此吸光度有二倍的变化速度，灵敏度也就提高了二倍。
用于实现本发明方法的血氨诊断试剂盒可以是单剂，包括缓冲液40--200mmol/l2-酮戊二酸酯 1--50mmol/l还原型辅酶0.15--0.3mmo/l腺苷三磷酸1--10mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 1--10mmol/l谷氨酸脱氢酶 1000--50000U/l谷氨酸激酶1000--50000U/l丙酮酸激酶500--20000U/l乳酸脱氢酶1000--50000U/l稳定剂10--80％(总体积)也可以将以上单剂配成如下双剂，更有利于消除内、外源谷氨酸、腺苷二磷酸、丙酮酸污染试剂I缓冲液40--200mmol/l2-酮戊二酸酯 1--50mmol/l还原型辅酶0.15--0.3mmo/l腺苷三磷酸1--10mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 1--10mmol/l谷氨酸激酶1000--50000U/l丙酮酸激酶500--20000U/l乳酸脱氢酶1000--50000U/l稳定剂10--80％(总体积)
试剂II缓冲液40--200mmol/l谷氨酸脱氢酶 1000--50000U/l稳定剂10--80％(总体积)双剂的配方不仅限于上述配方，其中的试剂I的成分，2-酮戊二酸酯、还原型辅酶、腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、谷氨酸激酶、丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶等可以放在试剂II，试剂II其中的成分，谷氨酸脱氢酶也可以放在试剂I，如此可以形成多种配方，不在此一一详述。
还可以将试剂配成如下三试剂，不但更有利于消除内、外源谷氨酸、腺苷二磷酸、丙酮酸污染，还更有利于试剂的稳定试剂I缓冲液40--200mmol/l2-酮戊二酸酯 1--50mmol/l还原型辅酶0.15--0.3mmo/l腺苷三磷酸1--10mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 1--10mmol/l稳定剂10--50mmol/l试剂II缓冲液40--200mmol/l谷氨酸激酶1000--50000U/l丙酮酸激酶500--20000U/l乳酸脱氢酶1000--50000U/l稳定剂10--80％(总体积)试剂III
缓冲液40--200mmol/l谷氨酸脱氢酶 1000--50000U/l稳定剂10--80％(总体积)三剂的配方不仅限于上述配方，其中的试剂I的成分，2-酮戊二酸酯、还原型辅酶、腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸等可以放在试剂II或试剂III中。试剂II其中的成分，谷氨酸激酶、丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶等也可以放在试剂I或试剂III中。试剂III其中的成分，谷氨酸脱氢酶也可以放在试剂I或试剂II中，如此可以形成多种配方，不在此详述。
缓冲剂的pH范围可以是6.0～11.0。缓冲剂可以是三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液、磷酸盐(Phosphate)缓冲液、三乙醇胺(Triethanolamine)缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)缓冲液、咪唑(Imidazole)缓冲液或双甘氨肽(Glycylglyc ine)缓冲液等，但不仅限于这些缓冲液，(例如还可以是咪唑/盐酸缓冲液6.2-7.8；磷酸氢二钠 柠檬酸缓冲液5.0-8.0；柠檬酸 柠檬酸钠缓冲液5.0-6.6；磷酸盐缓冲液6.0-8.0；磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液6.0-8.0；磷酸二氢钾 氢氧化钠缓冲液6.0-8.0；巴比妥钠-盐酸缓冲液6.8-9.6；Tris盐酸缓冲液7.0-9.0；硼酸 硼砂缓冲液7.4-9.0；甘氨酸-氢氧化钠缓冲液8.6-10.6；砂-氢氧化钠缓冲液9.2-100；碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液8.8-10.6(Ca2+、Mg2+存在时不得使用)；PBS缓冲液7.0-7.6等)。
以上还原型辅酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH等还原型烟酰胺辅酶或其衍生物。
此外，为了减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I、试剂II或三剂的试剂I、试剂II、试剂III中通常加入稳定剂10～80％或者10～50mmol/l，稳定剂可以是乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸胺或盐等中的一种或一种以上，还可以在硫基乙醇、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸盐、胆酸盐、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸、葡萄糖、谷氨酸盐、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、丁二酸盐等中选择。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下配方成分关系的本发明血氨诊断试剂盒较为理想缓冲液80--120mmol/l2-酮戊二酸酯 5--20mmol/l还原型辅酶0.2--0.3mmo/l腺苷三磷酸2--8mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 2--8mmol/l谷氨酸脱氢酶 5000--20000U/l谷氨酸激酶5000--20000U/l丙酮酸激酶1000--10000U/l乳酸脱氢酶5000--20000U/l稳定剂20--50％(总体积)由于本发明是完全利用酶学方法，酶解反应具有特异性高的特点，不易受到内、外源其他物质的干扰。酶法方法简便、易于操作。酶解反应的特异性促使测试结果精确。酶解反应都是在缓冲液条件下进行，没有污染环境问题。酶法方法不需要特殊、额外的仪器，测试成本低廉。因此可以保证具有较高的测试准确性，更便于推广应用。
此外，本发明的显著特色之一是可以消除内、外源谷氨酸、腺苷二磷酸、丙酮酸的污染，消除内、外源谷氨酸、腺苷二磷酸、丙酮酸的作用发生在整个反应时间段的前半部分，在后半段时间受污染的内、外源谷氨酸、腺苷二磷酸、丙酮酸已经被消耗殆尽，而在后半段时间测试血氨含量所需要的谷氨酸、腺苷二磷酸、丙酮酸都是产生于血氨的含量。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一(单剂)本实施例的血氨诊断试剂盒包括缓冲液80mmol/l2-酮戊二酸酯 5mmol/l还原型辅酶0.2mmo/l腺苷三磷酸2mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 2mmol/l谷氨酸脱氢酶 5000U/l谷氨酸激酶5000U/l丙酮酸激酶1000U/l乳酸脱氢酶5000U/l稳定剂50％(总体积)在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm以上，被测血氨样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应。
加入样品和试剂后，使之混合，发生以下反应氨离子+2-酮戊二酸酯+还原型辅酶谷氨酸脱氢酶谷氨酸+辅酶+水腺苷三磷酸+谷氨酸谷氨酸激酶腺苷二磷酸+谷氨酸5-磷酸腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸激酶腺苷三磷酸+丙酮酸丙酮酸+还原型辅酶乳酸脱氢酶乳酸+辅酶将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的幅度，从而测算出血氨的含量。
本实施例应用谷氨酸脱氢酶偶联谷氨酸激酶、丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶反应连续监测法。氨、2-酮戊二酸酯与还原型辅酶通过谷氨酸脱氢酶的作用，产生谷氨酸，谷氨酸通过谷氨酸激酶催化和ATP生成ADP，ADP再和磷酸烯醇式丙酮酸在丙酮酸激酶的作用下最后产生丙酮酸，再通过偶联乳酸脱氢酶的作用，将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算腺苷脱氨酶的活性大小。
实施例二(双剂)本实施例的血氨诊断试剂有试剂I缓冲液100mmol/l2-酮戊二酸酯 12mmol/l还原型辅酶0.25mmo/l腺苷三磷酸5mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 5mmol/l谷氨酸激酶12000U/l
丙酮酸激酶6000U/l乳酸脱氢酶12000U/l稳定剂50％(总体积)试剂II缓冲液100mmol/l谷氨酸脱氢酶 12000U/l稳定剂50％(总体积)测定血氨含量时，温度控制在30℃，反应时间15分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm以上，被测血氨样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应。
具体测定步骤为氨离子+2-酮戊二酸酯+还原型辅酶谷氨酸脱氢酶谷氨酸+辅酶+水腺苷三磷酸+谷氨酸谷氨酸激酶腺苷二磷酸+谷氨酸5-磷酸腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸激酶腺苷三磷酸+丙酮酸丙酮酸+还原型辅酶乳酸脱氢酶乳酸+辅酶将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的幅度，从而测算出血氨的含量。
各反应步骤的反应时间控制在15分钟。
实施例三(三剂)本实施例的血氨诊断试剂为三剂，有试剂I缓冲液120mmol/l
2-酮戊二酸酯20mmol/l还原型辅酶 0.3mmo/l腺苷三磷酸 8mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸8mmol/l稳定剂 20mmol/l试剂II缓冲液 120mmol/l谷氨酸激酶 20000U/l丙酮酸激酶 10000U/l乳酸脱氢酶 20000U/l稳定剂 50％(总体积)试剂III缓冲液 120mmol/l谷氨酸脱氢酶20000U/l稳定剂 50％(总体积)在全自动生化分析仪上设定温度25℃，反应时间20分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm以上，被测血氨样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应。
具体测定步骤为氨离子+2-酮戊二酸酯+还原型辅酶谷氨酸脱氢酶谷氨酸+辅酶+水腺苷三磷酸+谷氨酸谷氨酸激酶腺苷二磷酸+谷氨酸5-磷酸腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸激酶腺苷三磷酸+丙酮酸丙酮酸+还原型辅酶乳酸脱氢酶乳酸+辅酶将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的幅度，从而测算出血氨的含量。
各反应步骤的反应时间控制在20分钟。
实施例四本实施例的血氨诊断试剂有试剂I缓冲液100mmol/l2-酮戊二酸酯 8mmol/l还原型辅酶0.3mmo/l腺苷三磷酸2mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 2mmol/l稳定剂20mmol/l试剂II缓冲液100mmol/l谷氨酸脱氢酶 10000U/l谷氨酸激酶10000U/l丙酮酸激酶6000U/l乳酸脱氢酶20000U/l稳定剂50％(总体积)在生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm以上，被测血氨样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应。
加入样品和试剂后，使之混合，发生以下反应氨离子+2-酮戊二酸酯+还原型辅酶谷氨酸脱氧酶谷氨酸+辅酶+水腺苷三磷酸+谷氨酸谷氨酸激酶腺苷二磷酸+谷氨酸5-磷酸腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸激酶腺苷三磷酸+丙酮酸丙酮酸+还原型辅酶乳酸脱氢酶乳酸+辅酶将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的幅度，从而测算出血氨的含量。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内、外源物质的污染。
权利要求
1.一种测定血氨含量的方法，步骤如下1)、将样品与主要由2-酮戊二酸酯、还原型辅酶、腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸激酶、丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶组成的试剂混合，使之发生如下原理的反应氨离子+2-酮戊二酸酯+还原型辅酶谷氨酸脱氢酶谷氨酸+辅酶+水腺苷三磷酸+谷氨酸谷氨酸激酶腺苷二磷酸+谷氨酸5-磷酸腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸激酶腺苷三磷酸+丙酮酸丙酮酸+还原型辅酶乳酸脱氢酶乳酸+辅酶2)、检测最终反应物在主波长340nm吸光度下降的幅度，测算出血氨的含量。
2.根据权利要求1所述测定血氨含量的方法，其特征在于所述步骤2)为将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度，测算出血氨的含量。
3.根据权利要求1或2所述测定血氨含量的方法，其特征在于温度控制在20℃到50℃范围，反应时间控制在2-30分钟。
4.根据权利要求1或2所述测定血氨含量的方法，其特征在于被测样品与试剂的比例控制在1/10到1/250。
5.一种血氨诊断试剂盒，由以下成分组成缓冲液40--200mmol/l2-酮戊二酸酯 1--50mmol/l还原型辅酶 0.15--0.3mmo/l腺苷三磷酸 1--10mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 1--10mmol/l谷氨酸脱氢酶 1000--50000U/l谷氨酸激酶 1000--50000U/l丙酮酸激酶 500--20000U/l乳酸脱氢酶 1000--50000U/l稳定剂 10--80％(总体积)
6.根据权利要求5所述血氨诊断试剂盒，其特征在于所述试剂配成单剂、双剂或三剂。
7.根据权利要求5或6所述血氨诊断试剂盒，其特征在于所述稳定剂为乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸铵或盐中的至少一种。
8.根据权利要求5或6所述血氨诊断试剂盒，其特征在于所述缓冲剂的pH范围是6.0～11.0，所述缓冲剂是三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、三乙醇胺缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液、咪唑缓冲液或双甘氨肽缓冲液中的一种。
9.根据权利要求5或6所述血氨诊断试剂盒，其特征在于所述还原型辅酶是NADPH、NADH或thio-NADH还原型烟酰胺辅酶或其衍生物中的一种。
全文摘要
本发明涉及一种测定血氨含量的方法，同时本发明还涉及血氨诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。该试剂盒包括缓冲液、2－酮戊二酸酯、还原型辅酶、腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸激酶、丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶、稳定剂，通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生酶偶联反应，再将最终反应物置于生化分析仪下，检测主波长吸光度变化的情况(速度)，从而测算出血氨的含量。采用本发明完全可以通过生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内外源物质的污染，便于推广应用。
文档编号C12Q1/48GK1778963SQ200410065559
公开日2006年5月31日 申请日期2004年11月23日 优先权日2004年11月23日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司