专利名称：制备dna接头的方法
技术领域：
本发明涉及两种DNA接头，尤其是涉及采用独特的生物合成法生产DNA接头的方法。
背景技术：
在后基因组时代，仅仅知道有限的基因序列是不够的。常规PCR技术是扩增两段已知序列之间的DNA片段，而如何扩增一段已知目的序列旁侧的DNA序列，就成为二十世纪八十年代的研究热点。诸如Plamid rescue，inverse-PCR(IPCR)，random primed PCR，adaptor-ligation PCR等技术相继被应用于该领域。其中adaptor-ligation PCR技术以其流程少，方法简便，节约时间诸多优点尤为众人推崇。
RFLP是根据不同基因组的限制内切酶位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生变化，这种变化可以通过特定探针进行杂交检测，检测不同遗传位点等位变异，对特定的基因组限制性内切酶所产生的DNA片段是特异的，它可作为该基因组的特有指纹。从而可以比较不同生物品种DNA水平的差异(即多态性)。
AFLP(Amplified fragment length Polymorphism)是由荷兰Keygee公司科学家Zabem等发明的DNA指纹技术，它结合了RFLP和PCR技术特点，具有RFLP的稳定性和PCR技术的高效性。其原理是基因DNA经酶切后，形成分子量大小不等的随机限制性DNA片段，用特定的同酶切点互补的接头连接在酶切片断的两端，然后用特异同结头互补的引物进行PCR扩增、电泳、放射性或非放射性显示DNA指纹。
AFLP技术用PCR的方法避免了分子杂交的复杂程序，灵敏度高、快速、多态性强、DNA用量少，从某种意义上讲，AFLP指纹的出现是DNA指纹技术的重大突破，近年来广泛应用于遗传育种研究，在基因鉴定、基因作图、基因表达中有着广泛的应用前景。
接头是adaptor-ligation PCR和AFLP方法的关键因素，接头制备传统的合成方法是用DNA自动合成仪人工合成，但因其操作繁琐，仪器昂贵，而无法推广至一般应用单位。另外人工合成的接头连接效率低下，这也是影响其广泛应用的重要原因。
发明内容
本发明目的是应用生物合成法代替人工合成法，解决现有合成方法生产成本高，连接效率低等技术问题。
本发明目的还在于通过构建质粒突变体，将质粒转化入细菌大量扩增，最后酶切、分离得到目的接头，而且可以制备多种接头。本发明目的还在于提供一种具有合成方便，生产成本低，连接效率高，适用范围广，可选择酶切位点多等特点的接头制备的方法。
本发明的目的是这样实现的制备DNA接头的方法，选择有一个多克隆位点的长度100bp-100K常用质粒，以此质粒为模板设计引物，通过突变PCR方法构建突变质粒，导入细菌扩增，最后酶切分离得到目的接头。
方法一是突变PCR方法是构建两种在特定序列有差异的质粒即突变质粒，在ScaII和多克隆位点之间的片段引入新的酶切位点分别构建两种突变质粒，两种新质粒分别命名为pGAT1，pGAT2；pGAT2比pGAT1多40-100bp的片段；将突变质粒分别导入细菌扩增，并将扩增的等量pGAT1，pGAT2混合、变性、复性，复性杂交后会产生三种质粒分子，其中有两种为亲本质粒，另一种为新的杂合质粒pGAT3，含有40-100bp的不配对区域，将等量突变质粒DNA混合、变性、复性；酶切去除纯合质粒，最后杂合质粒中分离得到adaptor-ligation PCR中所使用的目的接头。
一般构建两种在特定序列有差异的质粒，一种比另一种多70bp左右的片段。
变性、复性反应后的混合物分别用新引入的两种限制性内切酶(如Acc65I和XhoI，KpnI和SacI，Cfr6I和XbaI等)切割，从而分离出杂合质粒；以SacII和所要求的内切酶切割杂合质粒pGAT3，即可以分离得到目的接头。
本发明的方法还包括突变PCR方法指在质粒中引入新的多克隆位点和单酶切位点SacII，得到突变质粒pGAT4，此突变质粒使得两个多克隆酶切位点分别含有EcoRI和MseI位点，导入细菌扩增，用SacII、EcoRI、MseI酶切pGAT4，即可得到EcoRI接头和MseI接头的混合物。此为AFLP中所常用的接头。本发明的特点是通过构建质粒突变体，将质粒转化入细菌大量扩增，生产成本低，连接效率高，适用范围广，可选择酶切位点多等特点的接头制备。
图1是Adaptor-ligation PCR中所使用的接头制备过程示意2是AFLP中所使用的接头制备过程，以常用的EcoRI接头和MseI接头为例的示意图具体实施方式
下面通过实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。
实施例1首先，介绍Adaptor-ligation PCR中所使用的接头制备过程，如图1选择有一个多克隆位点，繁殖效率高的常用质粒，如pBR322质粒，pUC系列质粒等。
本例选择pCIMA0380为模板，距其多克隆位点约400bp处有一酶切位点SacII。
一、以pCIMA0380为模板，在ScaII和多克隆位点之间设计四对引物，在其中四条引物的5’末端引入两个新的酶切位点(如Acc65I和XhoI，KpnI和SacI，Cfr6I和XbaI)，如图中黄、绿色所标记线段，且反应三与反应一所设计的引物一端结合位点不同，相差约70bp。
二、通过四个PCR扩增反应得到的四种产物中，产物一与产物二一端具有相同的酶切位点，用黄色片段表示；产物三与产物四一端也具有相同的酶切位点，用绿色线段表示；产物一比产物三一端相差70bp，以红色线段表示；产物二与产物四等长。两种新质粒分别命名为pGAT1，pGAT2。
三、用黄、绿两种限制性内切酶分别酶切产物一与产物二、产物三与产物四，形成相同的粘性末端后连接成两种大片段。
四、将两种大片段置换入原来的质粒，并转化进大肠杆菌大量扩增。
五、将等量pGAT1，pGAT2混合、变性、复性，复性杂交后产生三种质粒分子，其中有两种为亲本质粒，另一种为新的杂合质粒pGAT3，含有70bp的不配对区域，产生一个泡状区域。
六、反应后的混合物分别用黄、绿两种酶切，从而分离出杂合质粒。
七、使用时根据用户要求，用SacII和所要求的内切酶切割杂合质粒pGAT3，得到的小片段即为目的接头。
制备过程中，在接头中引入一段70bp不配对区域，通过对该区域的序列设计接头引物，可以降低Adaptor-ligation PCR中非特异性的扩增。
实施例2其次，介绍AFLP中所使用的接头制备过程，以常用的EcoRI接头和MseI接头为例，如图2选择有一个多克隆位点，繁殖效率高的常用质粒，如pBR322质粒，pUC系列质粒等。
本例选择pCIMA0380为模板，距其多克隆位点约400bp处有一酶切位点SacII。
一、以pCIMA0380为原始质粒，设计引物，通过突变PCR及相应的酶切操作，在原始质粒SacII——多克隆位点1的片段外引入新的多克隆位点2和单酶切位点SacII，命名为pGAT4。多克隆位点1含有EcoRI位点，多克隆位点2含有MseI位点；并将新质粒pGAT4转化进大肠杆菌大量扩增。
二、用SacII、EcoRI、MseI酶切pGAT4，即可得到EcoRI接头和MseI接头的混合物。
以这种方法制备的接头，虽然比普通接头多几十个碱基，但实验表明，这种天然接头使用效果更好。
另外，也可以根据使用者要求引入不同的酶切位点，从而得到相应的两种接头混合物(如PhoI和XhoI)。
权利要求
1.制备DNA接头的方法，其特征是选择有一个多克隆位点的长度100bp-100K常用质粒，以此质粒为模板设计引物，通过突变PCR方法构建突变质粒，导入细菌扩增，最后酶切分离得到目的接头。
2.由权利要求1所述的制备DNA接头的方法，其特征是所述突变PCR方法是构建两种在特定序列有差异的质粒即突变质粒，在ScaII和多克隆位点之间的片段引入新的酶切位点分别构建两种突变质粒，两种新质粒分别命名为pGAT1，pGAT2；pGAT2比pGAT1多40-100bp的片段；将突变质粒分别导入细菌扩增，并将扩增的等量pGAT1，pGAT2混合、变性、复性，复性杂交后会产生三种质粒分子，其中有两种为亲本质粒，另一种为新的杂合质粒pGAT3，含有40-100bp的不配对区域，将等量突变质粒DNA混合、变性、复性；酶切去除纯合质粒，最后杂合质粒中分离得到adaptor-ligation PCR中所使用的目的接头。
3.由权利要求1所述的制备DNA接头的方法，其特征是所述突变PCR方法是在质粒中引入新的多克隆位点和单酶切位点SacII，得到突变质粒pGAT4，此突变质粒使得两个多克隆酶切位点分别含有EcoR I和Mse I位点，导入细菌扩增，用SacII、EcoR I、Mse I酶切pGAT4，即可得到EcoR I接头和Mse I接头的混合物。此为AFLP中所常用的接头。
4.由权利要求2所述的制备DNA接头的方法，其特征是构建两种在特定序列有差异的质粒，一种比另一种多70bp的片段。
5.由权利要求2所述的制备DNA接头的方法，其特征是变性、复性反应后的混合物分别用新引入的两种限制性内切酶切割，从而分离出杂合质粒；以SacII和所要求的内切酶切割杂合质粒pGAT3，即可以分离得到目的接头。
6.由权利要求2所述的制备DNA接头的方法，其特征是两种限制性内切酶为Acc65I和XhoI、KpnI和SacI或Cfr6I和XbaI。
7.由权利要求3所述的制备DNA接头的方法，其特征是以SacII、EcoR I、Mse I酶切pGAT4，即可得到EcoR I接头和Mse I接头的混合物。
8.由权利要求3所述的制备DNA接头的方法，其特征是引入不同的酶切位点，得到PhoI和XhoI接头混合物。
全文摘要
制备DNA接头的方法，选择有一个多克隆位点的长度100bp－100K常用质粒，以此质粒为模板设计引物，通过突变PCR方法构建突变质粒，在ScaII和多克隆位点之间的片段引入新的酶切位点分别构建两种突变质粒或在质粒中引入新的多克隆位点和单酶切位点SacII，得到突变质粒pGAT4，导入细菌扩增，最后酶切分离得到目的接头。本发明采用独特的生物合成技术生产两种DNA接头(adaptor)，即adaptor－ligation PCR所使用的接头和AFLP中所使用的系列接头的方法。这种由生物合成的天然DNA接头，具有合成方便，生产成本低，连接效率高，适用范围广，可选择的酶切位点多等特点。
文档编号C12N15/09GK1618962SQ200410065679
公开日2005年5月25日 申请日期2004年11月12日 优先权日2004年11月12日
发明者田大成, 孙小芹, 杜建厂 申请人:南京大学