专利名称：草酸缺陷型Aspergillus Niger菌株生产多肽的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于生产多肽的草酸缺陷型Aspergillus Niger菌株，涉及其用途以及获得此类菌株的方法。
背景技术：
草酸是发酵期间细胞培养上清液中积累的人们不想要的副产物，其导致对人们想要的化合物的下游加工中的困难。
四份名为Ru1-Ru4(下文中定义)的现有技术的俄国文献，描述了用经典的诱变方法来获得草酸缺陷型Aspergillus Niger(A.niger)菌株的方法。草酸缺陷型A.niger菌株被定义为较其来源的亲本菌株生产更少草酸的菌株。这几篇文献表示，对诱变剂的选择并非关键UV、化学物质或这两者的组合作为诱变体，都可获得草酸缺陷型A.niger菌株。文献使用色谱试验来选择较之其来源的亲本菌株生产更少草酸或更多柠檬酸的菌株。文献中没有对用上述菌株来生产多肽的设想。
-Ru1On methods of selecting A.niger mutants with altered capacity tosynthesize organic acids，ID Kasatkina and E.G.Zheltova，Mikrobiologiya，vol34，no 3，p511-518，May-June 1965.
-Ru2RU2089615，New strains of A.niger has properties of producer ofcitric acid and can be used in microbiological industry(DW1998-249164).
-Ru3The variability of A.niger，a producer of citric acid，under theinfluencee of the separatee and combined action of nitrosomethylurea andultraviolet rays，E.Y.Shcherbakova，Z.S.Karadzhova and V.P.Ermakova，Mikrobiologiya，vol 43，no 3，p508-513，May-June 1974.
-Ru4Change in the ratio of citric acid and oxalic acids in A.niger underthe influence of mutagenic factors，V.M.golubtsova，E.Y.Shcherbakova，L.Y.Runkovskaya and V.P.Eramkova，Mikrobiologiya，vol 48，no 6，p1060-1065，November-December 1979.
另一份文献WO 00/50576描述了草酰乙酸水解酶缺陷型宿主细胞可被用于生产人们想要的化合物，例如多肽、初级和次级代谢物。上述宿主细胞较之其来源的亲本细胞具有较少的草酰乙酸水解酶活性。作为结果，上述草酰乙酸水解酶(oxaloacetate hydrolase，OAH)缺陷型细胞较之其来源的亲本细胞生产更少的草酸。该专利申请没有展示能表明草酰乙酸水解酶缺陷型细胞是合适的多肽生产者的实验数据。此外，Pedersen et al，(Pedersen，H.，et al，Metabolic Eng.，(2000)2，34-41)后来还描述经过包含编码葡糖淀粉酶的DNA序列的DNA构建体转化的草酰乙酸水解酶缺陷型Aspergillus niger菌株，在相同的培养条件下，生产的葡糖淀粉酶达不到其来源的野生型菌株的水平突变体生产的葡糖淀粉酶较野生型要少50％。此种突变体不适合在工业环境中被用作为多肽生产者。
对于下述草酸缺陷型A.niger菌株的需要仍然存在，所述菌株生产的多肽的量至少是野生型菌株所能生产出的多肽的量，其可在工业环境中被用作为多肽生产者。
发明内容
适合用于在工业环境中生产给定多肽或酶的草酸缺陷型A.niger菌株已被分离出来，其中，令人惊奇地，在相同的培养条件下，草酸缺陷型菌株生产与其来源的野生型菌株至少相等量的多肽或酶。优选地，在相同的培养条件下，突变体生产的多肽或酶的量至少是A.niger菌株CBS 513.88所生产的量。
在本申请中，A.niger菌株CBS 513.88被用作在A.niger培养物中可获得的草酸水平的野生型参照，A.niger培养物中可获得的多肽水平的野生型参照，以及A.niger培养物中可获得的细胞内OAH活性的野生型参照。草酸缺陷型A.niger菌株被定义为在同样培养条件下，较之A.niger菌株CBS 513.88，生产更少草酸的菌株。优选地，在相同的培养条件下，所用的草酸缺陷型A.niger菌株生产的草酸的量不超过其来源的野生型菌株所生产的一半。更优选地，在相同的培养条件下，所用的草酸缺陷型A.niger菌株生产的草酸的量不超过其来源的野生型菌株所生产的三分之一。最优选地，在相同的培养条件下，所用的草酸缺陷型A.niger菌株生产的草酸的量不超过其来源的野生型菌株所生产的五分之一。更优选地，在相同的培养条件下，所用的草酸缺陷型A.niger菌株生产的草酸的量不超过A.niger菌株CBS 513.88所生产的一半。更优选地，在相同的培养条件下，所用的草酸缺陷型A.niger菌株生产的草酸的量不超过A.niger菌株CBS 513.88所生产的三分之一。最优选地，在相同的培养条件下，所用的草酸缺陷型A.niger菌株生产的草酸的量不超过A.niger菌株CBS 513.88所生产的五分之一。根据本发明的一种优选的实施方式，通过本申请下文中所定义的方法，已获得所用的草酸缺陷型A.niger菌株。
优选地，在相同的培养条件下，本发明的草酸缺陷型A.niger菌株较之其来源的野生型菌株生产的给定多肽更多。更优选地，在相同的培养条件下，本发明的草酸缺陷型A.niger菌株较之A.niger菌株CBS 513.88生产的给定多肽更多。
对技术人员来说，多种不同的用于检测多肽的系统都是已知的。检测系统包括任何可能用于检测多肽或酶活性的试验。仅仅举例而言，上述试验系统包括但不限于基于比色、光度、浊度、粘度、免疫、生物、色谱的试验，以及其它可获得的试验。
优选地，如果所生产的多肽是酶，所生产出的活性酶的量是通过在模式反应中测量其活性来确定的(见实施例)。
优选地，本发明的草酸缺陷型A.niger菌株是在模式反应中进行检测时，具有可检测到的细胞内OAH活性的菌株(见实施例中的实验信息)。更优选地，在模式反应中进行检测时，本发明的草酸缺陷型A.niger菌株具有的细胞内OAH活性在其来源的野生型菌株的细胞内OAH活性的0.1至100％的范围内，优选在0.5至90％之间，更优选在0.5至80％之间，进一步更优选在1至50％之间，最优选在1至25％之间，进一步最优选在1至10％之间。根据另一种优选的实施方式，在模式反应中检测时，草酸缺陷型A.niger菌株具有的细胞内OAH活性在被保藏的CBS513.88的细胞内OAH活性的0.1至100％的范围内。更优选地，本发明的草酸缺陷型A.niger菌株是在模式反应中检测时，其具有的细胞内OAH活性在被保藏的CBS 513.88的细胞内OAH活性的1至90％的范围内的菌株。
此类草酸缺陷型菌株仍具有可检测到的OAH活性是令人吃惊的，因为人们认为OAH是对草酸形成有用的唯一分子。仍具有可检测到的OAH活性的突变体较之不具有可检测到的OAH活性的草酸缺陷型菌株具有若干优点(Pedersen H et al，Metabolic Eng.(2000)2，34-41)在相同的培养条件下，它们能生产的给定多肽的量至少是野生型菌株所生产的量。此外，有机酸的内在代谢途径很可能不会被扰乱。
根据另一种优选的实施方式，本发明的草酸缺陷型A.niger菌株的特征在于已用包含编码多肽的基因的表达构建体对该菌株进行了转化，在相同的培养条件下，所述菌株生产的多肽的量至少是其来源的野生型菌株所生产出的量，其中野生型菌株也已经经过了与转化草酸缺陷型菌株相同的表达构建体的转化。
编码将被生产的多肽的基因可以与所用的草酸缺陷型A.niger菌株同源或异源。术语“异源”表示该多肽不是该A.niger细胞天然的。优选地，包含在表达构建体的基因是对A.niger来说异源的基因。
优选的异源多肽是人血清清蛋白、乳铁蛋白、凝乳酶或磷脂酶A2。根据本发明的一种优选实施方式，已用包含编码所述多肽的DNA序列的DNA构建体对草酸缺陷型菌株进行了转化。优选地，所述多肽是酶。能被生产的酶是糖酶，例如纤维素酶，例如内切葡聚糖酶、β-葡聚糖酶、纤维二糖水解酶或β-葡萄糖苷酶(β-glucosidease)、半纤维素酶，或果胶水解酶(pectinolytic enzyme)，例如木聚糖酶、木糖苷酶、甘露聚糖酶、半乳聚糖酶(galactanase)、半乳糖苷酶、阿拉伯聚糖酶、鼠李半乳糖醛酶(rhamnogalacturonase)、半乳糖醛酶(galacturonase)、裂解酶或淀粉分解酶；磷酸酶，例如肌醇六磷酸酶，酯酶，例如磷脂酶、蛋白水解酶(proteolytic enzyme)，氧化还原酶，例如氧化酶，转移酶或异构酶。优选地，将被生产的淀粉分解酶是α(alpha)淀粉酶(EC 3.2.1.1.，α-1，4-葡聚糖-4-葡糖苷水解酶或EC 3.2.1.2)。此外，优选地，该DNA序列编码真菌的α淀粉酶。最优选地，编码真菌α淀粉酶的DNA序列是从A.niger或Aspergillus oryzae中获得的。根据另一种实施方式，将被生产的酶是脯氨酸特异性的内切蛋白酶(EC 3.4.16.2)。根据另一种实施方式，将被生产的酶是磷脂酶A1(PLA1)(EC 3.1.1.32)。此外，优选地，该DNA序列编码真菌的PLA1。最优选地，编码真菌PLA1的DNA序列是从Aspergillus niger或Aspergillus oryzae中获得的。
编码将被生产的多肽的DNA序列可被可操作地连接到合适的DNA调控区域上，以确保所述DNA的高水平表达，以及优选地，确保所述多肽的高分泌水平。如果将被生产的多肽是Aspergillus niger天然的，其天然分泌信号是优选被使用的。或者，如果将被生产的多肽对Aspergillus niger来说不是天然的，优选地，制造包含融合到将被生产的异源基因上的Aspergillus niger葡糖淀粉酶基因的融合构建体。根据本发明的一种优选的实施方式，使用Aspergillus oryzae α淀粉酶基因的调控区域。根据本发明的一种更为优选的实施方式，使用A.niger葡糖淀粉酶的调控区域。根据本发明的一种优选的实施方式，使用α淀粉酶的分泌信号。DNA构建体还可以包含选择性标记。或者，选择性标记可以存在于第二DNA构建体中。举例而言，上述标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶基因)、营养缺陷标记基因例如argB、trpC或pyrG，以及抗生素抗性基因，它们提供对例如腐草霉素、潮霉素B或G418的抗性。优选地，标记基因是来自Aspergillus nidulans的乙酰胺酶基因。更优选地，来自来自Aspergillusnidulans的乙酰胺酶基因被融合到gpdA启动子上。转化A.niger的方法是技术人员熟知的(Biotechnology of Filamentous fungiTechnology andProducts.(1992)Reed Publishing(USA)；Chapter 6Transformation pages 113to 156)。技术人员将意识到对A.niger的成功转化并不局限于对本文中特别示出的载体、选择标记系统、启动子和转化方案的使用。转化之后，典型地，在有盖培养皿的固体培养基上培养A.niger群落。典型地，对固体培养基培养后选出的转化子在瓶中进行三至七天的培养，以检查所述多肽的表达。
典型地，为在草酸缺陷型A.niger菌株中对多肽进行工业环境下的生产，可以使用分批进料(fed-batch)发酵方法。在发酵结束时，按照技术人员已知的技术来纯化所述多肽。下文对此种回收技术的例子进行了解释。当发酵停止时，必须杀死宿主。这是通过在某个特定温度下加入灭菌试剂来完成的，这个温度是该试剂能有效工作的温度。例如，灭菌试剂可以是苯丙酸钠或山梨酸钾。根据所选用的灭菌试剂的种类，通过用技术人员已知的经典冷却方法，将培养液的温度调节至该试剂相应的工作温度。在多肽被分泌到发酵培养基中的情况下，对细胞物质和多肽的分离例如是简单的过滤过程用装备有纺织布(textile cloth)的膜压滤机来过滤发酵培养液(膜压滤机和纺织布可从Harborlite获得)。为提高过滤效果，可以使用的合适的助滤剂以及合适的滤布预涂层(pre-coat)。
为去除任何残留的小颗粒，可以进行额外的过滤步骤，以获得干净的滤液。可在平均孔径典型为1-10微米的滤板上对所述滤液进行精细过滤。技术人员已知若干种类型的滤板，它们在此都是合适的。接着，可以用孔径为大约0.4微米的过滤器来进行灭菌过滤，以去除大部分的微生物。在这两次过滤中，预涂层可被用于提高过滤效果。然后通过超滤(UF)对所述滤液进行富集，富集因子典型地为10-25。若干种UF膜在此都是合适的。UF期间，典型的分子量小于几千(还取决于分子形状)的分子都从滤液中被移出。因此，UF之后，低分子量分子与目标多肽的相对数量可被降低10-25倍。UF的持续时间根据滤液的粘度和可过滤性(filterability)(其随原材料的天然特性的变动而改变)而变动。在此阶段，超滤物中存在的多肽的浓度通常足够高到能将多肽制成液体或干燥制剂的地步，具体制剂种类取决于预期应用。
为获得适合于高产量地生产多肽并可被用作工业环境中的多肽生产者的草酸缺陷型A.niger菌株，发展了一种方法。该多肽可以是与所述A.niger同源或异源的。在异源多肽或酶的情况下，可以按照如前所述的内容，将要应用本发明方法的野生型菌株可以先被转化，使其能表达编码此类多肽或酶的基因。在相同的培养条件下，此类草酸缺陷型A.niger菌株生产的多肽的量至少是其来源的野生型菌株所生产出的量。优选地，在相同的培养条件下，草酸缺陷型A.niger菌株生产的多肽比其来源的野生型菌株更多。根据另一种优选实施方式，在相同的培养条件下，突变体生产的多肽的量至少是A.niger菌株CBS 513.88所生产出的量。更优选地，在相同的培养条件下，突变体生产的多肽比A.niger菌株CBS 513.88更多。
该方法包括如下步骤a)对A.niger进行UV照射，b)对a)中获得的存活的菌落进行MTP培养c)对MTP培养物进行筛选，其中，生产的草酸的量不超过其来源的野生型菌株在相同培养条件下所生产的量的一半的突变体被选出，d)对步骤c)所获得的突变体进行第二次筛选，其中，生产的多肽的量至少是其来源的野生型菌株在相同培养条件下所生产的量的突变体被选出。
根据一种优选的实施方式，所述方法包括如下步骤a)建立如下培养条件，使得在发酵结束时，发酵培养基中，微孔滴定板(MTP)上生产至少15mM的草酸，或在瓶培养物中生产出至少30mM的草酸，b)对A.niger进行UV照射，c)在a)所保持的培养条件下对b)中获得的存活的菌落进行MTP培养，d)对MTP培养物进行筛选，其中，生产的草酸的量不超过其来源的野生型菌株在相同培养条件下所生产的量的一半的突变体被选出，e)对步骤d)所获得的突变体进行第二次筛选，其中，生产的多肽的量至少是其来源的野生型菌株在相同培养条件下所生产的量的突变体被选出。
根据另一种优选的实施方式，该方法包括如下步骤a)建立如下培养条件，使得在发酵结束时，发酵培养基中，微孔滴定板(MTP)上生产至少15mM的草酸，或在瓶培养物中生产出至少30mM的草酸，b)对A.niger的分生孢子进行UV照射，
c)在a)所保持的培养条件下对b)中获得的存活的菌落进行MTP培养，d)对MTP培养物进行筛选，其中，生产的草酸的量不超过其来源的野生型菌株在相同培养条件下所生产的量的一半的突变体被选出，e)对步骤d)所获得的突变体进行第二次筛选，其中，生产的多肽的量至少是其来源的野生型菌株在相同培养条件下所生产的量的突变体被选出。
根据另一种优选的实施方式，该方法包括如下步骤a)对A.niger进行UV照射，b)对a)中获得的存活的菌落进行MTP培养c)对MTP培养物进行筛选，其中，生产的多肽的量至少是其来源的野生型菌株在相同培养条件下所生产的量的突变体被选出，d)对步骤c)所获得的突变体进行第二次筛选，其中，生产的草酸的量不超过其来源的野生型菌株在相同培养条件下所生产的量的一半的突变体被选出。
上述方法的每一步将在下面被进一步地阐述。
根据本发明的一种优选的实施方式，在第一步中，A.niger的菌落首先在培养基中被培养，其中允许在发酵结束时，发酵培养基中，MTP上生产至少30mM的草酸，或在瓶培养物中生产出至少100mM的草酸。发酵时间应为至少3天。该方法的另一种优选的实施方式中，培养基的pH不需要被人工校正。该步骤中培养基的pH保持在3至7之间，优选在3.5至6.5之间，更优选在4至6之间。最优选地，培养基的pH保持在pH 5至6之间。在那样的pH值下，已知会有高产量的草酸生产。优选用2-[N-吗啡啉]乙磺酸(MES)溶液来缓冲培养基的pH，所述溶液的浓度在0.1至1M之间，更优选在0.15至0.55M之间。最优选地，MES的浓度为0.5M。该步骤的培养基中存在有氮源。优选地，氮源是被细胞吸收之后不使发酵培养基酸化的氮源。更优选地，该步骤培养基中的氮源是尿素。根据本发明的一种优选的实施方式，该步骤中所用的培养基是瓶装的培养基2(flask defined medium2，FDM2)(见实施例1)。根据本发明的一种优选的实施方式，该步骤中所用的A.niger是WT2或A.niger菌株CBS513.88(见实验信息)。
在第二步中，对A.niger进行UV照射，使得存活率在0.01％至60％之间。优选地，存活率在0.05％至50％之间。更优选地，存活率为0.1％。技术人员熟知，分生孢子是通过物理或化学手段来对A.niger进行诱变的优选材料。然而，突变体也还可以从菌丝体细胞来获得。本文所述的筛选方法可用于对从分生孢子或菌丝体细胞获得的突变体进行筛选。
在第三步中，对第二步所获得的存活的群落的MTP培养进行至少3天。
在第三步MTP培养结束时，可在第四步中，基于突变体草酸生产量来对其进行筛选(草酸筛选步骤)。优选地，相同的培养条件下，生产的草酸的量不超过其来源的野生型所生产的量的三分之一的突变体被选出。更优选地，相同的培养条件下，生产的草酸的量不超过其来源的野生型所生产的量的五分之一的突变体被选出。
实施例中描述了可以用来对培养基中存在的草酸定量的试验。为实用的原因，最好的突变体(最低量的草酸生产者)被保留，以用于进一步的鉴定。优选地，保留5至50个突变体用于进一步的鉴定。典型地，瓶培养7天之后，可以检查是否上述被选出的突变体生产的草酸较野生型菌株少得多在图7描述的情况下，突变体的发酵培养基中仅发现少于5mM的草酸，而野生型菌株中为40-45mM。7天的发酵之后，可以进一步地检查选出的突变体对培养基的酸化是否比野生型菌株要少。还可以在发酵期间不同的时间间隔，通过对生产出的生物物质进行测量，以及对残余葡萄糖浓度进行测量，来对下述问题进行检查突变体中测量到的低草酸水平不是被选出的突变体生长不良和/或代谢活性过低的后果。
可在草酸筛选步骤之间或之后用于突变体的第二筛选步骤如下选出生产的多肽的量至少是其来源的野生型在相同培养条件下所生产的量的突变体。优选地，在相同的培养条件下，突变体生产的给定多肽要比其来源的野生型菌株所生产的更多。根据另一种优选的实施方式，在相同的培养条件下，突变体生产的多肽的量至少是A.niger菌株CBS 513.88所生产的量。更优选地，在相同的培养条件下，突变体生产的给定多肽要比A.niger菌株CBS 513.88所生产的更多。为进行该最后步骤，在合适的液体培养基中，对前面步骤中获得的突变体和野生型对照物进行至少三天的培养。优选地，培养进行至少五天。在培养结束时，使用本申请前文所定义的用于检测所述多肽的系统，可以测定生产出的多肽的量。优选地，如果所生产的多肽是酶，所生产出的活性酶的量是通过在模式反应中测量其活性来确定的(见实施例)。
可选的第六步可被进一步用于筛选在模式反应中进行检测时可检测到细胞内OAH活性的草酸缺陷型A.niger菌株。优选地，模式反应是实施例的实验信息中描述的。更优选地，该步骤使得下述草酸缺陷型菌株被选出，在模式反应中进行检测时，所述菌株具有的细胞内OAH活性在其来源的野生型菌株的细胞内OAH活性的0.1至100％的范围内，优选在0.5至90％之间，更优选在0.5至80％之间，进一步更优选在1至50％之间，最优选在1至25％之间，进一步最优选在1至10％之间。根据另一种优选的实施方式，在模式反应中检测时，草酸缺陷型A.niger菌株具有的细胞内OAH活性在被保藏的CBS 513.88的细胞内OAH活性的0.1至100％的范围内。更优选地，本发明的草酸缺陷型A.niger菌株是在模式反应中检测时，其具有的细胞内OAH活性在被保藏的CBS 513.88的细胞内OAH活性的1至90％的范围内的菌株。
本发明还涉及草酸缺陷型A.niger菌株生产给定多肽的用途。因此，本发明还涉及生产给定多肽的方法，其中使用本发明定义的草酸缺陷型A.niger菌株。在相同的培养条件下，此类菌株生产的所述多肽的量至少与其来源的野生型菌株所生产的量相等。优选地，在相同的培养条件下，该菌株生产的所述多肽比其来源的野生型菌株所生产的更多。根据另一种优选的实施方式，在相同的培养条件下，该菌株生产的所述多肽或酶的量至少与A.niger菌株CBS 513.88所生产的量相等。更优选地，在相同的培养条件下，该菌株生产的所述多肽或酶比A.niger菌株CBS 513.88所生产的更多。
图1示出了草酸试验的标准曲线。测出的光密度以溶液中存在的草酸浓度的函数被给出。
图2示出了发酵期间，有或没有pH校正的情况下，FDM1培养基中野生型A.niger培养上清液pH的变化。
图3示出了在有或没有pH校正的情况下，FDM1培养基中对野生型A.niger进行发酵的期间获得的平均草酸产量。
图4示出了在没有pH校正的情况下，用铵或尿素作为氮源的FDM1培养基中，作为MES浓度函数的对野生型A.niger进行发酵的期间获得的平均草酸产量。
图5示出了在没有pH校正的情况下，FDM2培养基中对野生型A.niger进行发酵的期间获得的平均草酸产量。
图6示出了在MDM1培养基中对野生型和一些被选出的草酸缺陷型A.niger进行发酵期间的pH变化。
图7示出了作为草酸产量函数的、野生型和34个突变体在FDM2培养基中进行发酵之后生产出的平均α淀粉酶产量。
图8示出了在三种草酸缺陷型A.niger突变体和野生型中测量到的OAH活性。
图9示出了在没有pH校正的情况下，FDM2培养基中对野生型和草酸缺陷型A.niger进行发酵的期间获得的平均草酸产量。
图10示出了在FDM2培养基中对野生型和草酸缺陷型A.niger进行发酵的期间存在的残余葡萄糖浓度。
图11示出了FDM2培养基中发酵的野生型和草酸缺陷型A.niger的培养上清液中的pH变化。
图12示出了在FDM2培养基中对野生型和草酸缺陷型A.niger进行发酵的期间所产生的生物物质的变化。
图13示出了在包含估计相同的拷贝数的用于编码脯氨酸特异性内切蛋白酶的基因的WT1和FINAL(突变体22)中的脯氨酸特异性外切蛋白酶的产量。
图14示出了在摇瓶中的WT1和FINAL(突变体22)的磷脂酶A1产量。
实施例实验信息菌株WT1A.niger菌株被用作草酸水平、给定多肽水平和细胞内OAH活性水平的对照物。该菌株被保藏于CBS中心，保藏编号为CBS 513.88。
WT2包含整合进基因组的数个拷贝的包含A.oryzae α-淀粉酶基因的表达盒的WT1菌株。该基因已在别处被描述过(Wirsel et al.，(1989)，Mol.Microbiol.33-14)。用来自A.niger的葡糖淀粉酶基因的信号序列来替代A.oryzae α-淀粉酶基因编码的原始信号序列。通过本领域技术人员已知的技术来对WT2进行构建和筛选，这些技术在EP 635 574 A1和WO98/46772中有所描述。
OAH活性试验按照下文所述对不同的A.niger菌株进行摇瓶发酵。在无挡板的500ml摇瓶中的100ml OAH培养基中，于30℃、170rpm对细胞进行三天的培养。OAH培养基如下面表1中所定义的。然后，通过加入Na2CO3将pH调为8，并对细胞进行额外的15至18小时的培养。通过过滤收集菌丝体，用0.9％(w/v)的NaCl对其进行洗涤，在液氮中冷冻，并贮存于-80℃。在液氮下于研钵中对经冷冻的细胞进行破碎，然后将其悬浮在下述抽提缓冲液中100mM MOPS缓冲液，pH7.5(MOPS＝吗啡啉丙磺酸)，2mM MnCl2，20mM DTT，5％蔗糖。在Eppendorf离心机5417R中，于4℃、14000rpm下对悬浮液进行20分钟的离心。在25℃下对925μl的试验缓冲液(试验缓冲液100mM MOPS，pH7.5/2mM Mn2+)进行预加热。将25μl 40mM的草酰乙酸溶液加入到该经过预加热的混合物中。草酰乙酸溶液是通过将0.053g草酰乙酸溶于10ml试验缓冲液中来制备的。50μl离心之后获得的悬浮液被加入到经预热的混合物中。根据Pedersen et al，2000，Mol.Gen.Genet.263281-286所述的方法来测定OAH活性。主要使用草酰乙酸作为底物。从草酰乙酸的吸光系数和255nm处吸光率降低的速率(delta A/min)来测定酶活，其中对吸光度降低速率的测量持续3分钟，时间间隔为20秒。该试验进行于25℃。
表1OAH培养基痕量金属溶液ZnSO4·7H2O 0.143gCuSO4·5H2O 0.025gNiCl2·6H2O 0.005gFeSO4·7H2O 0.138gMnCl2·4H2O 0.060g水加至10mlOAH培养基，pH＝2.5或4.5，蔗糖 20gKH2PO41.5gMgSO4·7H2O 1gNaCl 1gCaCl2·2H2O 0.1gNaNO315g痕量金属溶液 0.5ml(用HCl调pH至2.5)水加至1升蛋白质试验样品中的蛋白质含量根据Coomassie Plus Protein试验按照制造商提供的说明书来测定，使用牛血清清蛋白作为标准(Pierce，产品编号23236)。
实施例1中，α淀粉酶作为下述酶的例子被给出，草酸缺陷型A.niger菌株对所述酶的生产水平至少与突变体来源的亲本菌株在相同培养条件下的生产水平相同。
实施例1 制备作为高产量多肽生产者的草酸缺陷型Aspergillus niger突变体的方法从WT2开始来制备草酸缺陷型A.niger菌株。
1.生长培养基在振荡速率220rpm的旋转式摇床上，在96孔微滴定板(MTP)或带挡板的300ml瓶中，在34℃对培养物进行培养。
瓶中的预培养物被每ml 17000孢子接种。100ml培养物被10ml预培养物接种。
表2瓶中预培养物培养基1(FPM1)，pH5.5(所有成分都以克每升的形式给出)
表3瓶装培养基1(FDM1)，pH6(所有成分都以克每升的形式给出)
(*2-[N-吗啡啉]乙磺酸)瓶装培养基2(FDM2)，pH6FDM2培养基与FDM1有着相同的组成，除了其中存在每升15克尿素，代替每升15克(NH4)2SO4。该培养基每升含有100克MES，而不是30克。
表4微滴定板装的培养基1(MDM1)，pH6(所有成分都以克每升的形式给出)
(*2-[N-吗啡啉]乙磺酸)
2.用于在A.niger培养物上清液中检测草酸的试验商业上可获得的来自“Sigma Diagnostics”的试剂盒(Sigma.OXALATE诊断试剂盒，目录编号591，2000-2001)被用于对草酸进行定量。制造商推荐的体积被缩小，以使最终试验体积为48μl，试验在384孔MTP中进行。Beckman Multimek 96被用于全部液体的转移，在BMG分光荧光计中于550nm处读出吸光率。图1中给出了草酸试验的标准曲线(光密度、OD，作为草酸浓度的函数)。在上述条件下发现试验直到2.5mM都是线性的。
3.建立培养条件以使草酸生产最大化本部分所用的野生型菌株都是WT1。
pH被描述为对草酸生产来说最为关键的参数。为获得高的草酸产量，A.niger培养物的pH应被保持为接近于6(Kubicek，C.P.，et al，Appl.Environ.Microbiol.(1988)54，633-637；和Ruijter，G.J.G.，et al，.Microbiology(1999)145，2569-2576)。对于低于4的pH值草酸的产生会急剧下降(Ruijter，G.J.G.，van de Vondervoort，P.J.I.，and Visser，J.1999.Microbiology 145，2569-2576)。在A.niger培养物中很难保持接近6的pH，因为真菌会生产出若干有机酸。为验证FDM1培养基中培养物pH有多关键，用野生型A.niger菌株来进行三次同样的瓶培养，其中通过加入灭菌的氢氧化钠每天进行人工pH校正或者不进行校正。在FDM1培养基接种之前在FPM1培养基中进行48小时的预培养阶段。A.niger生长期间，在FDM1培养基中存在有0.15M MES(30g/L)来缓冲培养基的酸化。
如图2所示，培养基中存在的缓冲液不足以平衡A.niger生产的有机酸，图3显示，培养物pH会对草酸产量产生极大的影响。pH经过校正的培养物产生的草酸较之pH没有经过校正的培养物要多大约5倍。
在对草酸缺陷型菌株进行筛选的期间，A.niger在能产生最大的草酸产量的条件下生长，从而可以选出草酸缺陷型菌株，并很轻易地将其与草酸生产为野生型水平的菌株分开。为实用的目的，在最初筛选阶段，当大量突变体仍然处于评估之时，人工pH校正无法作为获得最大草酸产量的可选项。为在不需要校正培养物pH的情况下提高草酸生产的水平，对FDM1培养基中的两个参数进行调节，它们是培养基中MES的浓度以及氮源的属性。
如图4所示，增加MES浓度以及用尿素代替硫酸铵会对最高的草酸浓度产生较大的影响，这可发生于没有pH校正的A.niger培养物上。图5中，6或7天的发酵后达到最高的草酸浓度，这取决于发酵培养基的组成。
1M MES会影响A.niger的生长，0.5M的中间浓度的MES被选择。因此，最终被选来在筛选阶段进行瓶培养的生长培养基是MES浓度为0.5M并用尿素代替硫酸铵的FDM1。从此，将该培养基称为FDM2。
图5显示在FDM2中，无需pH校正就达到的草酸浓度与经过pH校正的FDM1中所达到的相当(与图3相比)。因此，这样就不再需要pH校正了。
4.第一次筛选草酸生产从在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基(Difco，POTATODEXTROSE AGAR，培养基，目录编号213400，1996-1997年)形成孢子的WT2菌落来收集A.niger分生孢子。对10ml的含有每ml 4×106个分生孢子的悬浮液在254nm处进行UV照射(Sylvania，15 Watts BlackLight Blue管，模式FT15T8/BLB)，直到获得0.1783J/cm2的能量。菌落最初数量中0.1％的存活者被获得。将经过诱变的孢子溶液涂布到PDA培养基平板上，用Genomic Solutions Flexys菌落收集器(picker)收集10000个存活的菌落，它们再在96孔微滴定板(MTP)上进一步生长。在34℃对上述被称为“主平板(masterplate)”的MTP进行培养，直到有明显的孢子形成。
用Genomic Solutions Flexys菌落收集器将上述主平板复制涂布到含有40μl FPM1的MTP上，并在34℃培养48小时。然后加入170μl的MDM1，再在34℃对MTP进行进一步的7天的培养。
对10000个单独培养物的上清液进行检验草酸存在情况的试验。在所用的培养条件下，WT1和WT2培养物中所达到的草酸浓度在40mM的范围之内。生长培养基中草酸浓度低于12mM的突变体被选出来进行下一轮的筛选。保留下来255个突变体。第二轮筛选比第一轮更为严谨，从而可以除去假阳性。
第二轮突变体筛选由四份MTP培养和草酸试验组成。所用的条件与上文所述的相同。下面的表5中的第二列列出了野生型MTP培养物和突变体中最低生产者所达到的草酸浓度。
表5突变体
1U/ml是每小时将1g可溶淀粉转化为产物所需的α淀粉酶的量。在pH5.5和30℃通过加入碘之后在620nm处的吸光率来测量该产物的形成。和碘一起培养的时间在15至25分钟之间。
图6显示，较之野生型菌株，筛选出的突变体菌株在生长期间对MDM1生长培养基的酸化较少。
5.第二次筛选α淀粉酶生产作为第二筛选步骤，随后根据生产α淀粉酶的能力来对前段中获得的34个突变体进行筛选。
这34个突变体及WT2以与前述相同的方式生长，对它们的α-淀粉酶生产能力进行鉴定。
用来自Megazyme的α淀粉酶试验试剂盒(Megazyme，CERALPHAα淀粉酶试验试剂盒，目录参考号K-CERA，2000-2001年)来测定培养物上清液中存在的α-淀粉酶活性。表5第三列列出了在WT2和34个突变体中检测到的α淀粉酶的平均产量。
图7示出了作为草酸产量函数的、野生型和34个突变体的平均α淀粉酶产量。从表5第三列和图7中可以观察到，所有34个突变体生产的α-淀粉酶都比其来源的野生型菌株明显要多。前段中发现的所有草酸突变体被留下，作为能生产至少是其来源的野生型在相同培养条件下生产的酶的量的突变体。突变体15、19和22被选来作进一步的筛选。
6.第三次筛选OAH活性作为额外的筛选，对前段中选出的三个突变体(15、19、22)以及作为对照的WT1和WT2测量细胞内的OAH活性。对一些菌株而言，测量进行两次(A、B)，如图8中所示。用来测量OAH活性的试验方法在实验数据中有所描述。突变体15和22显示了可检测到的OAH活性(图8)大约是WT1或WT2的10％-20％。令人吃惊地，突变体19显示了高的OAH活性，其与WT2的接近。令人吃惊地，上述三种草酸缺陷型突变体仍然具有相对较高的OAH活性。此外，他们还有良好的酶生产能力。
实施例2 对A.niger草酸缺陷型突变体的鉴定1.生长培养基表6FPM1和FDM2培养基；如实施例1中所定义的。
瓶预培养物培养基2(FPM2)，pH5.5(所有成分都以克每升的形式给出)
2.对A.niger草酸缺陷型突变体的鉴定突变体18、22、15、23、19、33在48小时的FPM1预培养阶段之后，被培养于FDM2培养基中，并根据它们的草酸产量和若干生长参数(残余葡萄糖、pH和形成的生物物质)对其进行鉴定。用FDM2培养基获得的结果验证了突变体较之野生型菌株的低水平草酸生产(图9)。
用来自“Sigma Diagnostics”(Sigma，GLUCOSE诊断试剂盒，目录号510-A，2000-2001年)葡萄糖试验试剂盒对野生型和突变体菌株生长期间FDM2培养基中存在的残余的葡萄糖进行检测。如图10所示，7天的生长之后，一些突变体培养物中的葡萄糖几乎完全被消耗殆尽，这暗示被选出的突变体中发现的低草酸水平并非是低代谢活性的反映。仅有突变体23看似代谢活性降低。
培养物的pH也被测量。如前面观察到的(见实施例1)，突变体的培养基的酸化没有野生型培养物的高(见图11)。
最后，为了确保降低的突变体的草酸产量并非是由生长不良导致的，通过对不同生长时间培养物中形成的生物物质的干重进行称量来检测生物物质的形成。在每个关注的时间间隔处毁掉瓶子，并对瓶中全部生物物质的干重含量予以测定。
如图12所示，突变体显示了多样的生长情况，但经过7天的培养之后，却都趋于达到与亲本菌株WT2同样的生物物质水平。突变体23是唯一显示低水平生物物质形成的菌株，但该水平仍可与作为WT2来源的WT1野生型菌株相比。突变体23未被留下来作为用于下一步鉴定的草酸缺陷型菌株。对突变体的孢子形成能力进行了视觉评估。我们发现，突变体的孢子形成水平可与其来源的野生型菌株相比。仅有一种突变体孢子形成能力看似较低。
在后面的实施例中，突变体22被用作草酸缺陷型A.niger菌株，以生产不同的酶。该突变体从WT2获得，早期来自WT1。为在该突变体中表达其它的酶，按照EP 635 574 A中描述的方法去除α淀粉酶基因的所有拷贝，其中使用乙酰胺酶基因作为选择标记基因。在下面的实施例中，将该没有任何外来酶编码基因的突变体命名为FINAL。为在WT1中表达特定的酶，被引入到FINAL中的表达构建体也被引入到WT1中，如下面的实施例所述。检查拷贝数。对突变体22对脯氨酸特异性内切蛋白酶和PLA1的生产进行检测，并将其与WT1相比。在相同的培养条件下，突变体22生产的所有受试酶的量都与其来源的WT1相等，或是甚至更高。
实施例3 WT1和FINAL菌株对脯氨酸特异性内切蛋白酶的生产的比较被使用的编码脯氨酸特异性内切蛋白酶的基因，在别处已被公开(WO 02/45524)。为在WT1和FINAL中表达WO 02/45524所述的脯氨酸特异性内切蛋白酶，通过WO 02/45524所述的共转化将WO 02/45524中描述的构建体(pGBFIN11-EPO)引入上述菌株。
具有近似的估计拷贝数的转化子被选择来进行摇瓶实验，所述实验用500ml带挡板的摇瓶在保温摇床中于34℃和170rpm下，于100ml如EP635 574 A1中所述的培养基中进行。四天的发酵之后，测定样品中脯氨酸特异性内切蛋白酶的活性。用Z-Gly(cine)-Pro(line)-pNA作为底物，在pH5和大约37℃下，及时对脯氨酸特异性内切蛋白酶的蛋白水解活性进行分光光度的测量。1U的脯氨酸特异性内切蛋白酶被定义为在pH5和37℃下，每分钟转化1微摩尔Z-Gly(cine)-Pro(line)-pNA的酶的量。
图13显示，具有不同的估计拷贝数的A.niger转化子的脯氨酸特异性内切蛋白酶活性被包括在42至135U/l的范围内。估计为一个拷贝数的菌株具有42-46U/l的活性，其与两至三个拷贝的菌株的活性很好地相关。我们得出结论在相同的培养条件下，FINAL生产的脯氨酸特异性内切蛋白酶的量至少与WT1生产的量相等。
实施例4 WT1和FINAL菌株对磷脂酶A1(PLA1)的生产的比较我们选择在WT1和FINAL中表达来自A.oryzae的PLA1。编码该酶的基因已被公开(Watanabe I，et al，Biosci.Biotechnol.Biochem.(1999)，Vol63，numero 5，pages 820-826)。用与WO 02/045524中所述的在pGBFIN11-EPO中克隆脯氨酸特异性内切蛋白酶的同样的技术，将该基因克隆进pGBFIN11。通过WO 02/45524中所述的共转化将该构建体引入上述菌株。WT1和FINAL的三个独立转化子被用来检测摇瓶中PLA1的表达。用500ml带挡板的摇瓶，在保温摇床中，于34℃和170rpm下，在100ml与如EP 635 574 A1中所述的相同的培养基中，对具有近似的估计拷贝数的转化子进行培养。发酵2、3、4、5天后，测定样品PLA1活性。为对来自Aspergillus niger的磷脂酶(PLA1)的PLA1活性进行分光光度的测定，使用人工底物1，2-二硫二辛酰磷脂胆碱(1，2-dithiodioctanoylphophatidylcholine，diC8，底物)。PLA1水解A1位的硫键，分解出硫辛酸(thio-octanoic acid)。硫辛酸与4，4-二硫吡啶(染色试剂，4-DTDP)反应，形成4-硫吡啶酮。4-硫吡啶酮与4-巯基吡啶之间有互变异构平衡，4-巯基吡啶吸收波长为334nm的光。测量该波长处的消光变化。一个单位被定义为在37℃和pH4.0下，每分钟从1，2-二硫二辛酰磷脂胆碱释放出1nmol硫辛酸的酶的量。
通过将1g diC8晶体溶于66ml乙醇和264ml乙酸缓冲液来制得底物溶液。乙酸缓冲液包含0.1M的pH3.85的含有0.2％Triton-X100的乙酸缓冲液。染色试剂是11mM的4，4-二硫吡啶溶液。这是通过在2ml的Eppendof样品杯中称量5.0mg的4，4-二硫吡啶并将其溶于1.00ml乙醇中来制得的。加入1.00ml的milli-Q水。结果被示于图14中。其显示，WT1培养物的转化子中PLA1活性在4-5天之后降低。然而，FINAL转化子中PLA1活性在发酵期间积累起来，而且没有观察到活性降低。我们得出结论在相同的培养条件下，FINAL生产的PLA1多于其来源的野生型副本。
关于被保藏微生物的说明(PCT Rule 13bis)
表PCT/RO/13权利要求
1.一种用于生产给定酶的草酸缺陷型A.niger菌株，其中，在相同的培养条件下，所述草酸缺陷型菌株生产的所述酶的量至少与其来源的野生型菌株所生产的量相等。
2.如权利要求1所述的草酸缺陷型A.niger菌株，其中，在相同的培养条件下，所述草酸缺陷型菌株生产的所述酶比其来源的野生型菌株要多。
3.如权利要求1或2所述的草酸缺陷型菌株，其中，当在模式反应中检测时，所述草酸缺陷型菌株具有的细胞内OAH活性在其来源的野生型菌株的细胞内OAH活性的1％至25％之间。
4.一种草酸缺陷型A.niger菌株，其特征在于当该菌株已经过了包含编码酶的基因的表达构建体的转化，在相同的培养条件下，所述菌株生产的酶的量至少是其来源的野生型菌株所生产出的量，其中，所述野生型菌株已经经过了与转化草酸缺陷型菌株相同的表达构建体的转化。
5.如权利要求4所述的草酸缺陷型A.niger菌株，其特征在于所述基因是异源基因。
6.如权利要求1至5中任意一项所述的草酸缺陷型A.niger菌株，其中，在相同的培养条件下，所述菌株生产的所述酶的量至少是A.niger菌株CBS 513.88所生产的量，优选更多。
7.如权利要求1至6中任意一项所述的草酸缺陷型A.niger菌株，其中所述的酶是真菌α淀粉酶。
8.如权利要求7所述的草酸缺陷型A.niger菌株，其中所述的真菌α淀粉酶来自Aspergillus oryzae或A.niger。
9.一种获得下述草酸缺陷型A.niger菌株的方法，所述菌株适于在相同的培养条件下生产出至少是其来源的野生型菌株所生产出的量的酶，所述方法包括如下步骤a)对A.niger进行UV照射，b)在a)所保持的培养条件下对a)中获得的存活的菌落进行MTP培养，c)对MTP培养物进行筛选，其中，生产的草酸的量不超过其来源的野生型菌株在相同培养条件下所生产的量的一半的突变体被选出，d)对步骤c)所获得的突变体进行第二次筛选，其中，生产的酶的量至少是其来源的野生型菌株在相同培养条件下所生产的量的突变体被选出。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述方法包括额外的步骤e)，其中，对步骤d)中选出的突变体进行进一步的筛选，以选出在模式反应中检测时具有的细胞内OAH活性在其来源的野生型菌株的细胞内OAH活性的1％至25％之间的突变体。
11.如权利要求1至8中任意一项所述的或通过权利要求9或10中任意一项所述的方法可获得的草酸缺陷型A.niger菌株用于生产给定的酶的用途。
全文摘要
本发明涉及草酸缺陷型Aspergillus Niger菌株生产一种给定的酶的用途，其中，在同样的培养条件下，草酸缺陷型菌株生产的酶的量至少与其来源的野生型菌株相等。优选地，在相同的培养条件下，草酸缺陷型A.Niger菌株较其来源的野生型菌株生产更多的酶。更优选地，草酸缺陷型A.Niger菌株是这样的当已用包含编码酶的基因的表达构建体对该菌株进行了转化时，在相同的培养条件下，所述菌株生产的酶的量至少是其来源的野生型菌株所生产出的量，所述野生型菌株也是已经经过了与转化草酸缺陷型菌株相同的表达构建体的转化。本发明还涉及获得此类草酸缺陷型A.niger菌株的方法。本发明进一步地涉及获得一种酶的方法，其中使用草酸缺陷型A.niger菌株，在相同的培养条件下，该菌株生产的酶的量至少与其来源的野生型菌株相等。
文档编号C12R1/685GK1836033SQ200480003643
公开日2006年9月20日 申请日期2004年2月5日 优先权日2003年2月5日
发明者蒂鲍特·乔斯·维恩策尔, 罗希尔·莫伊伦贝格, 琼马克·莫里斯·克劳德·拉德里埃 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司