专利名称：使用pei/单链寡核糖核苷酸复合物下调靶基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用阳离子聚合物和单链核糖核苷酸寡聚体降低靶基因表达的方法。
背景技术：
mRNA封闭(knock-down)试剂，例如反义寡核苷酸(ASO)或短的RNA双链(也被称为小干涉RNA，siRNA)，成为调节基因表达从而帮助阐明其在疾病发展中的功能和假定角色的有力工具。
起初，实现基因特异性抑制的最常用途径是反义技术，其中，把与目的基因信使RNA互补的单链核酸(寡脱氧核苷酸或寡核糖核苷酸)引入细胞(Thompson，2002)。更近来，基于使用适当的转染试剂向细胞内递送，证实短的RNA双链(也被称为小干涉RNA，siRNA)能通过被称为RNA干涉的机制(Fire等，1998)在哺乳动物细胞内有效地抑制基因表达(Elbashir等，2001)。siRNA由两条互补RNA链形成，该siRNA具有19-21个核苷酸的双链区，每条链具有1-3个核苷酸的突出端。RNA干涉已被描述为天然发生的抵御病毒dsRNA的防御机制。提出的作用机制提示双链siRNA解链之后形成ssRNA-酶复合物，其作为基因沉默过程的中间体，从而模糊了RNAi和反义作用之间的区别(Martinez等，2002，Schwarz等，2002)。
然而，以寡核苷酸为基础的途径具有涉及递送、稳定性和剂量要求的大量限制。未修饰的磷酸二酯寡核苷酸，特别是更大的寡核糖核苷酸对核酸酶降解高度敏感，通常，核酸的自发摄取极为低效。因而，发展寡核苷酸技术的许多努力集中于产生增强细胞摄取的转染试剂和合成经修饰的核酸，所谓核酸既对核酸酶消化稳定也易于扩散进入细胞。在过去的十年中，已设计出磷酸二酯键的相似物和新的化学修饰核苷构件，例如2’-O-MOE(甲氧乙基)衍生物(Martin等，1995)，显著改进了传统磷酸二酯和硫代磷酸反义寡聚体的稳定性、效力和选择性。
最近在HeLa细胞中证明使用未修饰ssRNA经RNAi机制在哺乳动物细胞内的基因沉默(Martinez等，2002；Schwarz等，2002)。然而，ssRNA的效力比dsRNA低。另外，已知HeLa细胞缺乏核酸酶。因此，Martinez和Schwarz的途径并非普遍适用，因为，其不能应用于例如具有更强核酸酶活性的其它细胞系。例如，在用于其它哺乳动物细胞系(如H-9、MOLT-3或T-24细胞)并假定经反义机制起作用的ssRNA必须经过充分修饰以引起mRNA降解(Agrawal等，1992；Wu等，1998)。用于稳定ssRNA的化学修饰可能具有取决于所涉及的调节机制的负面作用。更具体的，修饰的ssRNA可能通过反义机制让mRNA降解，但是可能对与其它下调途径有关的酶复合物具有较低的亲合力，例如在RNA干涉途径中诱导形成的RISC-复合物。通过对比，应用于RNA双链3’-末端的化学修饰对沉默活性具有最小影响或没有影响(Schwarz等，2002)。然而，明确需要以未修饰ssRNA用于RNAi的通用适用方法，因为这样的方法就试剂成本而言显然有利，但是由于ssRNA与dsRNA相比的低稳定性，这类方法受限于其效力。因其与涉及siRNA双链的具有3’修饰突出端的单链RNA相似，可以在siRNA途径中起作用的最低限度3’修饰的磷酸二酯单链RNA，也可能作为反义封闭试剂起作用。因此，无疑需要能够将3’最低限度修饰的单链RNA用于下调特定靶基因的方法。
现在，本发明提供能够通过应用与阳离子多聚体结合的最低限度修饰的ssRNA来下调哺乳动物细胞中特定靶基因的方法。本发明因此首次提供ssRNA作为基因抑制剂在RNA干涉中的有效用途，尤其是用于高通量筛。
发明概述本发明涉及使用ssRNA和阳离子聚合物(例如PEI)来封闭靶基因。
第一方面，本发明提供降低靶基因表达的方法，包括将细胞暴露于单链寡核糖核苷酸和PEI，其中所述单链寡核糖核苷酸包括小于50个、优选小于25个核苷酸的区域，该区域与由所述靶基因编码的mRNA互补。在另一个优选的实施方案中，互补区域为10至30个、更优选15至25个、在特别优选的实施方案中为19至21个核苷酸。在另一个优选的实施方案中，互补区域对应由该靶基因编码的mRNA的16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。
根据本发明优选的实施方案，所述细胞为真核细胞，更优选为哺乳动物细胞，最优选为人类细胞。所述PEI优选为线性PEI，N/P比值优选在2和10之间，更优选在3和8之间。
根据本发明另一个实施方案，所述ssRNA包括1、2、3或4个错配。在一个实施方案中，错配是毗邻的。
根据本发明另一个实施方案，所述单链寡核糖核苷酸包括1至10、优选1至8、更优选1至6个化学修饰的核糖核苷酸残基。特别优选的是具有1、2、3、4或5个化学修饰残基的寡核糖核苷酸。优选的化学修饰是2′-O-MOE修饰或在核苷间主链中的修饰，例如硫代磷酸酯。
根据本发明优选的实施方案，所述靶基因是人类基因。优选该基因在病理状态下过表达，更优选该基因为癌基因、细胞因子基因、病毒基因、细菌基因、发育基因或朊病毒基因。
根据本发明的相关方面，提供所述方法，其中靶基因经RNA干涉下调。
在另一个相关方面中，本发明提供用于RNA干涉的ssRNA和PEI。
另一方面，本发明提供包含足够量以抑制靶基因表达的ssRNA和PEI的试剂盒，其中所述ssRNA包含与靶基因互补的区域。
附图简述
图1显示通过线性PEI介导转染400nM P2X3单链，导致P2X3 mRNA的抑制。
图2显示通过线性PEI介导转染200nM P2X3单链，导致P2X3mRNA的抑制。
发明详述缩写ASO 反义寡核苷酸CHO 中国仓鼠卵巢细胞系FBS 胎牛血清MEM 最低限度基本培养基ON 寡核苷酸RT-Q-PCR 实时定量反转录酶PCR(1)PEI (线性)聚乙烯亚胺PBS 磷酸缓冲盐溶液RNAi RNA干涉siRNA小干涉RNATOM 2′-O-[(三异丙基甲硅烷)氧基]甲基2′-O-[(triisopropylsilyl)oxy] methyl2’-O-MOE2’-O-甲氧乙基2’-O-Me 2’-O-甲基设想此处说明的本发明不限于所描述的特定方法、方案和试剂，它们可以变化。也应当理解，此处使用的术语仅用于说明特定实施方案的目的，无意以任何方式限制本发明的范围。
除非另有说明，如此处所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员的通常理解具有相同含义。尽管任何与此处所描述的方法和材料相似或等价的方法和材料都可以用于本发明的实践或测试，现在描述优选的方法、设备和材料。本文提及的所有出版物都引入为参考，以便说明和公开出版物中报道的材料和方法，这些材料和方法可能被联合用于本发明。
在本发明的实践中，使用了分子生物学中的许多常规技术。这些技术广为人知，并在例如Harlow，E.和Lane编.1988，“AntibodiesALaboratory Manual”，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，《Current Protocols in Molecular Biology》，I、II和III卷，1997(F.M.Ausubel编)；Sambrook等，1989，《Molecular CloningA LaboratoryManual》，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.；《DNA CloningA Practical Approach》I和II卷，1985(D.N.Glover编)；《Oligonucleotide Synthesis》，1984(M.L.Gait编)；《Nucleic Acid Hybridization》，1985，(Hames和Higgins)；《Transcriptionand Translation》，1984(Hames和Higgins编)；《Animal Cell Culture》，1986(R.I.Freshney编)；《Immobilized Cells and Enzymes》，1986(IRLPress)；Perbal，1984，《A Practical Guide to Molecular Cloning；the series，Methods in Enzymology》(Academic Press，Inc.)；《Gene Transfer Vectorsfor Mammalian Cells》，1987(J.H.Miller和M.P.Calos编，Cold SpringHarbor Laboratory)；以及《Methods in Enzymology》Vol.154和Vol.155(分别为Wu和Grossman，Wu编)中得到解释。
除非上下文另外明确指出，如此处和附带的权利要求中所使用的，单数形式的“a”、“an”和“the”包括复数含义。
出于本发明目的，“ssRNA”或“寡核糖核苷酸”交替指如本领域通常定义并理解的单链核糖核酸寡聚体。
根据本发明，“化学修饰”或“修饰”包括核糖核苷寡聚体经化学手段的所有改变，例如化学部分的添加或去除、或以一个化学部分取代另一个化学部分。特别是核苷间键(internucleosidic bond)中非桥接氧原子被硫原子取代、以及向糖单元2′-OH基团添加取代基，都包括在术语化学修饰内。
“RNA干涉”是本领域常用术语。能够测量靶基因通过RNA干涉的下调或确定通过RNA干涉机制是否发生靶基因下调的试验为本领域公知，这类试验描述于如Caplen等，2001；Elbashir等，2001，D.Hüsken等，2003中。
本发明使用ssRNA和线性阳离子多聚体已成功地下调了靶基因的表达。迄今为止，由于其高核酸酶敏感性，未修饰的ssRNA作为mRNA封闭试剂而受到限制。通常通过化学修饰实现ssRNA的稳定，例如用硫代磷酸酯键取代所有的磷酸二酯键(Agrawal等，1992；Wu等，1998)，或通过使用嵌合化合物，例如具有2’-OMe翼(8至12个2’-修饰的核糖核苷酸)以及5至9个硫代磷酸酯修饰的最小间隙，来诱导mRNA降解(Wu等，1998)。根据本发明，发明人发现通过使用阳离子多聚体(尤其是线性PEI)，可以有效地转染并稳定最低限度修饰的ssRNA，以致磷酸二酯ssRNA用作mRNA封闭试剂变得可行。因此，这类阳离子转染试剂的使用克服了需要广泛化学修饰用于靶基因下调的ssRNA，并首次允许磷酸二酯ssRNA应用于此目。
第一方面，本发明提供通过将细胞暴露于ssRNA和阳离子聚合物而下调靶基因的方法。所述阳离子多肽包括(但不限于)多聚赖氨酸、多聚精氨酸、多聚组氨酸、聚乳酸交酯以及乳酸和羟基乙酸的共聚物(P(LA-GA))、多糖(DEAE-葡聚糖)。在特别优选的实施方案中，阳离子多聚体是聚乙烯亚胺(PEI)，更优选为线性PEI。
根据本发明，使用的PEI优选分子量100至1,000,000道尔顿的线性PEI，更优选500至200,000道尔顿或1,000至100,000。可以对PEI进一步修饰，例如通过诸如聚乙二醇(PEG)之类的亲水聚合物。可商业获得多种类型的PEI，例如购自Aldrich或Bayer。适宜的PEI试剂的生产方法也为本领域公知，例如Fischer等，1999。
聚乙烯亚胺(PEI)是乙烯亚胺的阳离子聚合物，当在水溶液中完全质子化时，展现最高的正电荷密度。每三个原子有一个可以被质子化的氨基氮(Boussif，O.等，1995；Behr，J.P.，1997)。支链PEI随分支程度不同而含有一级、二级和三级氨基基团，从而在多种pH可以质子化，而线性PEI主要或只含有二级氨基基团。线性PEI是低分子量聚合物，通常约20000-25000Da。商业线性PEI“JetPEI”的结构为HO(CH2)2-(CH2-CH2-NH)n-(CH2)2-OH
因此，在一个实施方案中，本发明提供PEI(特别是线性PEI)和ssRNA在靶基因下调中的用途，ssRNA优选未经修饰或最低限度修饰的。
靶基因下调需要的ssRNA的量可以经验性确定，并且在本领域技术人员技能内。阳离子聚合物的量取决于使用的ssRNA的量。例如，对于PEI，PEI总氮原子数量对ssRNA磷酸基团数量的比值(N/P比值)是确定PEI量以有效递送给定量的ssRNA的适宜参数。在优选的实施方案中，N/P比值从2至10，更优选从3至8。特别优选的比值为5。优选的比值是线性PEI有效复合寡核苷酸，以允许该复合物的摄取以及摄取后从内体释放的必要量(即氮原子的量)。在某一确定的ssRNA浓度，可能有足够的PEI来引起高效率的摄取，但是不诱导从内体的有效释放(尤其是在低ssRNA浓度下)。
可用于反义技术的核糖核苷酸和寡核糖核苷酸的多种化学修饰为本领域公知(见例如Freier S.M.和Altmann K.H.，1997)。尽管在特别优选的实施方案中，ssRNA主要由未修饰的核糖核苷酸组成，本发明也设想使用含有一些化学修饰的ssRNA。根据本发明，优选的化学修饰的ssRNA包含1至10，优选1至5个合成的核糖核苷酸类似物，所述类似物含有2′-OH基的修饰(特别是2′-O-烷基)；或化学修饰的ssRNA含有1至10、优选1至5个合成的脱氧核糖核苷酸，或含有3’-末端羟基功能的任何修饰。在更优选的实施方案中，修饰为2′-OMe、2′-O-MOE。尽管优选含有磷酸二酯核苷间键的ssRNA，但可以化学修饰有限量的核苷间键。因此，在本发明另一优选的实施方案中，ssRNA包括1至10、优选1至5个磷酸二酯主链的修饰，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯(boranophosphate)、phosphoroselenoate、phosphorodiselenoate，phosphoroanilothioate、phosphoranilidate、磷酰胺酯(phosphoramidate)、肽及此类键。在另一个优选的实施方案中，修饰定位于ssRNA分子的5′和/或3′末端。在本发明的另一个优选实施方案中，ssRNA含有5′磷酸。然而，ssRNA可以另外或替代地含有本领域公知的其它众多修饰(Freier S.M.和Altmann K.H.，1997)，修饰的残基数量更优选为1至5。
在另一个优选的实施方案中，ssRNA包括一个或多个脱氧核糖核苷酸。优选的是一段1至10个、优选1至5个脱氧核糖核苷酸，可能在核糖核苷酸链的一侧或两侧，优选在3’-末端。
ssRNA包括小于50个核苷酸的区域，优选多于15个与将被下调的给定靶基因互补的核苷酸。更优选的是16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸的长度。在特别优选的实施方案中，ssRNA由与给定靶基因互补的区域组成。在本发明的另一个实施方案中，互补区域含有1、2、3或4个错配。
可被阳离子聚合物(尤其是PEI)转染的各种细胞可用于本发明。优选的细胞是真核细胞、哺乳动物细胞，更优选的是啮齿动物，特别优选的是人类细胞。细胞可以来至多种组织，它们包括(而不限于)例如内细胞团、胚胎外外胚层或胚胎干细胞、全能或多能、分裂的或非分裂的、软组织或上皮、不死的或转化的细胞等。细胞可以是干细胞或分化细胞。分化的细胞型包括(而不限于)脂肪细胞、成纤维细胞、肌细胞、心肌细胞、内皮、树突状细胞、神经元、神经胶质、肥大细胞、血细胞和白细胞(例如红细胞、巨核细胞、淋巴细胞(例如B、T和天然杀伤细胞)、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱细胞、血小板、粒细胞)、上皮细胞、角质细胞、软骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、肝细胞和内分泌或外分泌腺细胞以及感觉细胞。
ssRNA既可以通过本领域充分建立的化学方法、也可以通过生物学方法合成，例如，通过使用细胞RNA聚合酶或噬菌体RNA聚合酶(例如T3、T7、SP6)的体外转录。
如此处所公开的，本发明不限于任何类型的靶基因或核苷酸序列。例如，靶基因可以是细胞基因、内源性基因、癌基因、转基因、或包括翻译或非翻译RNA的病毒基因。仅出于说明目的，而不应理解为限制，列出下列可能的靶基因类别转录因子和发育基因(例如黏附分子、细胞周期蛋白抑制剂、Wnt家族成员、Pax家族成员、翼状螺旋家族成员、Hox家族成员、细胞因子/淋巴因子及它们的受体、生长/分化因子及它们的受体、神经递质及其受体)；癌基因(例如ABLI、BCLI、BCL2、BCL6、CBFA2、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、ERBB2、ETSI、ETV6、FGR、FOS、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCLI、MYCN、NRAS、PIMI、PML、RET、SKP2、SRC、TALI、TCL3以及YES)；肿瘤抑制基因(例如APC、BRAI、BRCA2、CTMP、MADH4、MCC、NFI、NF2、RBI、TP53以及WTI)；以及酶(例如ACP去饱和酶和羟化酶、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(pyrophorylases)ATP酶、醇脱氢酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、过氧化氢酶、环氧酶、脱羧酶、糊精酶、DNA和RNA聚合酶、半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、GTP酶、螺旋酶、整合酶、胰岛素酶、转化酶、异构酶、激酶、乳糖酶、脂肪酶、脂肪氧化酶、溶菌酶、过氧化物酶、磷酸酶、磷脂酶、磷酸化酶、蛋白酶和肽酶、重组酶、反转录酶、端粒酶(包括RNA和/或蛋白质组分)，以及拓扑异构酶)。
ssRNA优选包括与一个单基因互补的区域，但是也可以含有不止一个与一个以上基因互补的区域。也设想将基因暴露于若干物种的ssRNA的方法，其中ssRNA包括与不同基因互补的区域。
可通过抑制代谢途径中一个或多个位点的酶或有关发病机理的基因而增强效果通过靶定多个不同组分，可以影响多种活性并放大效果。也可以通过抑制途径的反馈控制或不需要的代谢副产物的产生来控制新陈代谢。
可以将细胞体外或离体暴露于ssRNA和PEI，随后置入动物以影响治疗，或者直接在体内给与ssRNA和PEI。因此可以设想基因治疗的方法，一般通过在PEI存在下将靶基因特异的ssRNA引入细胞。可以使用任何已知导致疾病或需要治疗的状况的靶基因。例如，可以使用归巢病毒载体(homing Viral vector)、肿瘤特异性启动子或通过设计有效抑制肿瘤特异性基因(例如端粒酶)和癌基因的ssRNA分子，来靶定肿瘤细胞。治疗包括减轻或避免任何疾病相关症状或病理学相关的临床指征，这可能包括预防性治疗。另一个优选的实施方案涉及把用ssRNA和PEI处理的ES细胞施予个体，以抑制要求的靶基因。
可以靶定抑制来自任何病原体的基因。例如，可以直接导致宿主免疫抑制或病原体复制、传播或保持感染所必需的基因。可以锚定处于病原体感染危险中的细胞或已经被感染的细胞，例如被人类免疫缺陷病毒(HIV)传染病、流行性感冒传染病、疟疾、肝炎、疟原虫、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒和口蹄疫病毒感染的细胞，以通过引入本发明的RNA进行治疗。靶基因可以是病原体或宿主基因，其负责病原体向其宿主的进入、药物被病原体或宿主的代谢、病原体基因组的复制和整合、感染在宿主中的建立或传播、或下一代病原体的组装。可以设想预防(即预防或降低感染的风险)和降低感染相关症状频率或严重性的方法。
本发明也提供鉴定生物体中基因功能的方法，包括使用ssRNA和PEI抑制之前未知功能的靶基因的活性。替代传统遗传筛选的费时费力的突变体分离，功能基因组学设想通过本发明降低靶基因活性的量和/或改变靶基因活性的时程来确定未描述特征的基因的功能。本发明可以用于确定药物的潜在靶标、理解发育相关的正常和病理事件、确定负责出生后发育/衰老的信号途径等。不断提高的从基因组和表达基因源(包括人类基因组)获得核酸序列信息的速度，可以与本发明结合，以确定例如在哺乳动物系统、尤其是人类细胞培养系统中的基因功能。对对于本领域普通技术人员，显然可以使用计算机辅助的搜索技术从数据库中可获得的核酸序列确定推定的开放阅读框。
因此，本发明的另一方面，提供给DNA序列归属功能的方法，由此将细胞暴露于PEI及ssRNA，该ssRNA与未归属功能的所需DNA序列互补，并具有足以抑制基因表达的量，鉴定该哺乳动物细胞与野生型相比的表型，给所需核酸归属表型。
根据可以从表达序列标签(EST)获得的部分序列，抑制基因表达将是简单的试验。生长、发育、新陈代谢、疾病抗性或其它生物学过程中的功能改变将成为EST基因产物的正常角色的指示。如果数据库筛选发现与已知功能蛋白质的同源区域，可以使用以该功能为基础的更特定的生物化学试验测试该EST序列(或其抑制)的功能。
使用PEI可以将ssRNA方便地引入完整的哺乳动物细胞，这种方便允许本发明用于高通量筛选(HTS)。例如，可以化学合成或体外转录产生ssRNA。
可以将含有足以抑制靶基因(例如差异表达的基因)的量的PEI和ssRNA的溶液可置于位于微量滴定板上作为有序阵列的单个孔中，可以通过蛋白质组、基因组和标准分子生物学技术测试各孔中细胞由于靶基因活性抑制在行为和发育中的任何改变或修饰。这样的筛选尤其适合来自哺乳动物的组织培养。
可以高通量形式测试响应受调节启动子(例如，以报告基因构建体转染)产生比色、荧光或发光信号的细胞，以鉴定调节启动子的DNA结合蛋白。在该试验的最简单形式中，负调节物的抑制导致信号的增加，正调节物的抑制导致信号的降低。
本发明可用于允许必需基因的抑制。这类基因可能是只在发育或细胞区室的特定阶段为细胞或生物体存活所必需。当靶基因的活性不是存活所需时，可以通过抑制靶基因活性产生条件突变的功能等价物。本发明允许在发育的特定时期在生物体内定位添加ssRNA，而不向靶基因组引入永久性突变。
本发明也提供试剂盒，包括至少一种试剂或构建体，该试剂是使用阳离子聚合物(特别是PEI)作为转染试剂于体外、离体或体内执行ssRNA向测试样本或个体引入所必需的试剂，该构建体的表达抑制哺乳动物细胞内靶基因的表达。该试剂盒含有足量以抑制靶基因表达的ssRNA和PEI，其中ssRNA含有与靶基因互补的区域。这样的试剂盒也可以包括允许试剂盒使用者实践本发明的说明书。
仅出于说明的目的，在下面的实施例中进一步描述本发明。此公开内容和实施例中涉及但是没有明确说明的分子遗传学、蛋白质和肽生物化学以及免疫学方法，在科学文献中有报导，并且为本领域技术人员所熟知。
实施例材料JetPEITM购自Polyplus-Transfection(CatNo 101-10)。它由以7.5mM浓度(以氮原子表示)提供的线性聚合物组成。
细胞系如先前所描述的(Dorn等，2001)，产生表达重组体鼠P2X3的稳定转染的中国仓鼠卵巢细胞系(CHO-K1)(ATCC CCL61，Rockville，MD)。在以5％CO2潮湿的箱内，在添加10％(v/v)FBS、2mM谷氨酰胺和10000IU/500ml青霉素/链霉素的最低基本培养基(MEM-α)中培养细胞。
寡核苷酸合成按照制造商(xeragon)说明，使用TOM-亚磷酰胺化学合成用于siRNA实验的寡核糖核苷酸，并以RP-HPLC纯化。以毛细管凝胶电泳评估纯度。根据260nM消光系数使用UV进行定量。
如别处所述(Elbashir等，2001)执行dsRNA的退火。
寡核苷酸序列在下列出
缩写N＝2’-H，n＝2’-O-甲氧乙基，N＝2’-OH，s＝硫代磷酸酯。
CHO-K1细胞的转染紧邻转染前制备Polyplex。在转染前十八小时，将4×104个细胞以每孔0.5mlMEM-α(添加10％(v/v)FBS、2mM谷氨酰胺和10000IU/500ml青霉素/链霉素)的体积置于24孔板。转染之前，从细胞去除生长培养基，并以500μl OptiMEM和100μl PEI/寡核苷酸混合物取代。将板于37℃在潮湿的5％CO2孵育器中培养。随后，每孔添加60μl FBS，将孵育延长20小时。
以ietPEITM转染以氮原子摩尔浓度表示PEI浓度，1μg寡核苷酸含有3nmole阴离子磷酸盐。为了获得关于寡核苷酸(ON)浓度所需要的N/P(PEI总氮原子比寡聚体的磷酸基团)比值，使用下面的公式计算将要与多核酸混和的线性PEI体积 同样的公式用于siRNA双链(将这些试剂视为两条分开的链)。
24孔板实验以3份进行(每孔终体积600μl)，将线性PEI的需要量稀释到150μl的150mM无菌NaCl溶液中，然后温和涡旋。在单独的Eppendorf管中，将寡核苷酸的需要量稀释到150μl NaCl溶液中，然后温和涡旋。然后将150μl PEI溶液立刻加入150μl核酸溶液中，马上涡旋15秒。将PEI/寡核苷酸溶液于室温放置15-30分钟，然后将100μl复合物溶液加至含有500μl所需培养基的各孔。
RNA收获以及实时定量PCR mRNA分析寡核苷酸转染24小时后，根据制造商的程序，以RNeasy 96试剂盒(Qiagen，Chatsworth，CA)分离总RNA。如果执行纯模板mRNA稀释液的标准，将RNA样本单独稀释至10ng/μl，如果将mRNA下调表示为未处理细胞的百分率，则稀释至50ng/12μl。然后将RNA(在两种情况下，各样品上载50ng)与实时定量PCR反应试剂盒PLATINUM QuantitativeRT-PCR THERMOSCRIPT One-step System(Invitrogen)的试剂或与Reverse Transcriptase Q-PCR mastermix试剂盒(Eurogentec)的试剂混和，并根据试剂盒附带的方案运行。
结果下面描述的实验目的在于建立应用线性PEI作为向哺乳动物细胞内递送寡核糖核苷酸的载体的简单通用方案。选择以重组体鼠P2X3嘌呤受体(purinoreceptor)cDNA序列稳定转化的中国仓鼠卵巢细胞株(CHO-K1)和明确特征的P2X3反义抑制序列作为siRNA转染的模式系统(Dorn等，2001)。
线性PEI介导的吸收后的单链RNA活性尽管用于封闭mRNA的大部分反义化合物为寡脱氧核苷酸，或者含有2’-脱氧窗(2’-deoxy window)(嵌合ASO)以诱导RNase H活性，寡核糖核苷酸也显示能有效触发mRNA调节。在多种生物体内存在内源性反义R转录物以调节基因表达，并且显示激活双链内切核糖核酸酶，该酶随后降解目标mRNA。细胞内表达的反义RNA构建体并得到广泛应用，并依赖于系统，显示在RNA加工的不同水平诱导基因表达抑制，例如初级转录物的剪接、成熟mRNA的转运、或翻译(Pestka等，1992)。因其对核酸酶的敏感性，细胞外应用的未修饰的短RNA一般不引起稳定的mRNA或蛋白质调节。经化学修饰(例如硫代磷酸酯)和翼内的2’-修饰(嵌合RNA)(Agrawal等，1992；Wu等，1998)或通过与互补有义链杂交(Martinez等，2002；Schwarz等，2002)的单链RNA的稳定导致活性mRNA封闭试剂。
已显示线性PEI可以转染多种经修饰的ASO(尤其是完整的磷酸二酯MOE gapmer，它们以多种脂类制剂转染时没有活性)和双链RNA(dsRNA)，我们进一步评价了其抗核酸酶的保护特征。P2X3mRNA的抑制显示线性PEI可以适当地转染、保护和递送在3’-末端具有两个MOEDNA修饰和一个硫代磷酸酯键的单链磷酸二酯RNA。无论以400nM(表1)或200nM(表2)，反义单链RNA显示约50％的目标mRNA抑制，而有义单链RNA无活性。
表1CHO-K1中，线性PEI介导转染的P2X3单链(ss)反义RNA(8647)引起的P2X3 mRNA的抑制(8646单链有义RNA；8548/8549无关的对照siRNA)。
表2CHO-K1中，线性PEI介导转染的P2X3单链(ss)反义RNA(8647)引起的P2X3 mRNA的抑制(8646单链有义RNA)。
文献Agrawal S.，Tang J.Y.，Sun D.，Sarin P.S.和Zamecnik P.C.(1992)Synthesis and anti-HIV activity of oligoribonucleotides and theirphosphorothioate analogs.Annals of the New York academy of sciences 660，2-10Behr，J.P.(1997)The Proton Sponge-A Trick to Enter Cells theViruses Did Not Exploit.CHIMIA 51，34-36.
Boussif，O.，Lezoualc′h，F.，Zanta，M.A.，Mergny，M.D.，Scherman，D.，Demeneix，B.和Behr，J.P.(1995)A versatile vector for gene andoligonucleotide transfer into cells in culture and in vivoPolyethylenimine.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，7297-301Caplen N.J.，Parrish S.，Imani F.，Fire A.，Morgan R.A.，(2001)PNAS98，9742-9747Dorn G.，Abdel′al S.，Natt F.，Weiler J.，Hall J.，Meigel I.，Mosbacher J.和Wishart W.(2001)Specific inhibition of the rat ligand-gated ionchannel P2X3 funetion via methoxyethoxy-modified phosphorothioatedantisense oligonucleotides.Antisense & Nucleic Acid Drug Development 11，165-174.
Elbashir S.M.，Harborth J.，Lendeckel W.，Yalcin A.，Weber K.和Tuschl T.(2001)Duplexes of 21-nueleotide RNAs mediate RNAinterference in cultured mammalian cells.Nature 411，494-8.
Fire A.，Xu S.，Montgomery M.K.，Kostas S.A.，Driver S.E.和MelloC.C.(1998)Potent and specific genetic interference by double-strandedRNA in Caenorhabditis elegans.Nature 391，806-811Fischer等.(1999)，Pharm.Res.16，1273-1279Freier S.M.and Altmann K.H.(1997)The ups and downs of nucleicacid duplex stabilitystructure-stability studies on chemically-modifiedDNARNA duplexes.Nucl.Acids.Res.25，4429-4443D.Hüsken等，Nucleic Acids Research，2003，Vol.31，No.17 e102
Martin P.(1995)New access to 2′-O-alkylated ribonucleosides andproperties of 2′-O-alkylated oligoribonucleotides.Helvetica Chimica Acta78(2)，486-504.
Martinez J.，Patkaniowska A.，Urlaub H.，Luhrmann R.和Tuschl T.(2002)Single-stranded antisense siRNAs guide target RNA cleavage inRNAi.Cell 110(5)，563-574Pestka S.(1992)Antisense RNA.History and perspective.Annals ofthe New York academy of sciences 660，251-262Schwarz D.S.，Hutvágner G.，Haley B.和Zamore P.D.(2002)Evidence that siRNAs Function as Guides，Not Primers，in the Drosophilaand Human RNAi Pathways.Molecular Cell 10，537-548Thompson，J.D.(2002)Applications of antisense and siRNAs duringpreclinical drug development.Drug Discovery Today 7，912-916.
Wu H.，MacLeod A.R.，Lima W.F.和Crooke S.T.(1998)Identificationand Partial Purification of Human Double Strand RNase Activity.A novelterminating mechanism for oligoribonucleotide antisense drugs.J BiolChem 273.2532-2542.
权利要求
1.降低靶基因表达的方法，包括将细胞暴露于单链寡核糖核苷酸和PEI，其中该单链寡核糖核苷酸含有与所述靶基因编码的mRNA互补并小于50个核糖核苷酸的区域，并且靶基因经RNA干涉被下调。
2.根据权利要求1的方法，其中所述区域少于25个核糖核苷酸。
3.根据的方法，其中所述区域为19至21个核糖核苷酸。
4.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述单链寡核糖核苷酸由与靶基因互补的区域组成。
5.根据前面任一项权利要求的方法，其中所述细胞为真核细胞。
6.根据权利要求5的方法，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
7.根据前面任一项权利要求的方法，其中所述PEI为线性PEI。
8.根据前面任一项权利要求的方法，其中N/P比值在2和10之间。
9.根据权利要求8的方法，其中N/P比值在3和8之间。
10.根据前面任一项权利要求的方法，其中所述单链寡核糖核苷酸包括1、2、3或4个错配，任选地，其中2至4个错配相互接近。
11.根据前面任一项权利要求的方法，其中单链寡核糖核苷酸含有1至10个化学修饰的核苷酸。
12.根据权利要求11的方法，其中化学修饰为2′-O-MOE修饰。
13.根据权利要求11的方法，其中化学修饰为修饰的核苷间键。
14.根据权利要求13的方法，其中化学修饰为硫代磷酸酯键。
15.根据前面任一项权利要求的方法，其中靶基因为人类基因。
16.根据前面任一项权利要求的方法，其中靶基因为在病理状态下过表达的基因。
17.根据前面任一项权利要求的方法，其中靶基因选自癌基因、细胞因子基因、病毒基因、细菌基因、发育基因、朊病毒基因。
18.线性PEI和ssRNA在RNA干涉中的用途。
19.包括足以抑制靶基因表达的量的ssRNA和PEI的试剂盒，其中所述ssRNA含有与靶基因互补的区域，能够通过RNA干涉机制下调所述靶基因。
全文摘要
本发明提供使用短的单链RNA和阳离子聚合物(例如线性PEI)，通过RNA干涉机制下调靶基因的方法。
文档编号C12Q1/68GK1744886SQ200480003304
公开日2006年3月8日 申请日期2004年1月30日 优先权日2003年1月31日
发明者J－C·博洛尼亚, J·哈尔, F·J-C·纳特, J·魏勒 申请人:诺瓦提斯公司