一种基因重组人巨细胞病毒融合蛋白pp150/MDBP及其制备方法与应用的制作方法

专利名称：一种基因重组人巨细胞病毒融合蛋白pp150/MDBP及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因重组人巨细胞病毒融合蛋白，尤其涉及一种基因重组人巨细胞病毒融合蛋白pp150/MDBP及其制备方法与应用，属基因工程技术、预防性疫苗和诊断试剂等技术领域。
背景技术：
人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus，HCMV)感染是临床上常见的、严重危害人体健康的传染性疾病。可经过多种途径传播。正常人群感染HCMV后，并不呈现明显的临床症状，但是对于机体免疫能力低下的人群来说，原发感染、病毒潜伏感染后的复发可引起活动性感染，并可引发严重的甚至是致死性的疾病。对于器官移植、骨髓移植、免疫缺陷患者以及免疫抑制治疗的患者，HMCV感染是高发病率与致死率的重要原因。孕妇原发感染HCMV后容易导致胎儿畸形，可产生低体重儿、小头畸形、耳聋、视力损伤、智力低下等不同症状。最近研究表明，HCMV感染与人类动脉粥样硬化甚至是冠心病的发生有重大关系。有文献报道，与周围组织相比，不同的肿瘤细胞中HCMV具有较高的发生率，且HCMV感染可干扰细胞内和细胞外因子两种途径诱导的肿瘤细胞的凋亡，如他可以通过影响癌抑制基因p53、p73促进细胞生长信号的传递或者促进Ras/Raf/MEK/Erk-and PI-3K-的抗凋亡作用而促进导致肿瘤的发生。因此，如何准确、快速、特异性地监测HCMV的活动性感染从而及时给予患者相应的抗病毒治疗以及判断预后，成为临床上的关键。
与病毒提取的抗原组分相比，基因工程方法生产的重组抗原是血清学检测方法中提高准确率的最佳方式之一，且融合抗原的检测准确率要优于单一抗原；若应用于制备疫苗、单抗、多抗和蛋白芯片以及ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测试剂盒，将具有巨大的社会效益和经济效益。

发明内容
针对现有技术的不足和临床诊断的需要，本发明要解决的问题是提供一种基因重组人巨细胞病毒融合蛋白pp150/MDBP及其制备方法，以及所述重组人巨细胞病毒融合蛋白在制备其疫苗、单抗、多抗、蛋白芯片、ELISA检测试剂盒以及与人巨细胞病毒相关产品中的应用。
本发明的技术方案是通过选择优势抗原片段中的抗原表位区域所编码的基因序列，经PCR(polymerase chain reacton，PCR)扩增及拼接，构建了表达融合蛋白pp150/MDBP的融合基因，利用原核表达载体pBV220使融合蛋白在大肠杆菌BL21中以可溶性蛋白形式获得高效表达，并建立了一整套简便有效纯化基因重组人巨细胞病毒融合蛋白的工艺流程，有效提高了融合蛋白的表达量和得率，降低了基因重组融合蛋白的生产成本。
下面对本发明所述基因重组人巨细胞病毒融合蛋白的制备方法进行详细描述本发明涉及的基因重组人巨细胞病毒融合蛋白pp150/MDBP，即人巨细胞病毒UL(unique long，UL)32基因片段编码的pp(phosphoprotein，pp)150蛋白495至691氨基酸片段的197个氨基酸以及UL57基因片段编码的MDBP(methylated DNA bindingprotein，MDBP)蛋白538至601氨基酸片段的64个氨基酸串联形成的融合蛋白；pp150蛋白的197个氨基酸在融合蛋白的N端，MDBP蛋白的64个氨基酸在融合蛋白的C端，两者之间由亮氨酸(Leu)和谷氨酸(Glu)2个氨基酸连接而成，并且融合蛋白的N端增加了1个甲硫氨酸(Met)，融合蛋白全长264个氨基酸，其特征在于该融合蛋白C端64个氨基酸选自UL57基因片段编码的MDBP蛋白538至601氨基酸，编码该融合蛋白的基因序列为ATG CTC GTC TCC CCG CAG GTG ACC AAG GCC AGC CCG GGA AGG GTC CGT CGG GAC AGC GCG TGG GACGTG AGG CCG CTC ACG GAG ACC AGA GGG GAT CTT TTC TCG GGC GAC GAG GAT TCC GAC AGC TCG GATGGC TAT CCC CCC AAC CGT CAA GAT CCG CGT TTC ACC GAC ACG CTG GTG GAC ATC ACG GAT ACC GAGACG AGC GCC AAA CCG CCC GTC ACC ACC GCG TAC AAG TTC GAG CAA CCG ACG TTG ACG TTC GGC GCCGGA GTT AAC GTT CCT GCT GGC GCC GGC GCT GCC ATC CTC ACG CCG ACG CCT GTC AAT CCT TCC ACGGCC CCC GCT CCG GCC CCG ACA CCT ACC TTC GCG GGT ACC CAA ACC CCG GTC AAC GGT AAC TCG CCCTGG GCT CCG ACG GCG CCG TTG CCC GGG GAT TAG AAC CCC GCC AAC TGG CCG CGC GAA CGC GCG TGGGCC CTC AAG AAT CCT CAC CTG GCT TAC AAT CCC TTC AGG TAG CCT ACG ACT TCC ACG GCT TCT CAAAAC ACC GTG TCC ACC ACC CCT CGG AGG CCG TCG ACT CCA CGC GCC GCG GTG ACA CAA ACA GCG TCTCTC GAG TTG GAC GGC AAA GGT GAC GAC GGG GTT CCG GGC GGC GGT GCT GGC GGG GGT GGT GGA CGAGAC GTG AGC GGG 6GC CCG AGC GAC GGT CTG GGT GGC GGT CGT GGT GGT GGG GGT GGT GGG GAT TCCGGG GGA ATG ATG GGG CGC GGC GGT CGC ATG TTG GGC GCT AGC GTG GAC CGT ACC TAT CGG CTC AATTAA该融合蛋白氨基酸序列为Met Leu Val Ser Pro Gln Val Thr Lys Ala Ser Pro Gly Arg Val Val Val Asp Ser Ala5 10 15 20Trp Asp Val Arg Pro Leu Thr Glu Thr Arg Gly Asp Leu Phe Ser Gly Asp Glu Asp Ser25 30 35 40Asp Ser Ser Asp Gly Tyr Pro Pro Asn Arg Gln Asp Pro Arg Phe Thr Asp Thr Leu Val45 50 55 60Asp Ile Thr Asp Thr Glu Thr Ser Ala Lys Pro Pro Val Thr Thr Ala Tyr Lys Phe Glu65 70 75 80Gln Pro Thr Leu Thr Phe Gly Ala Gly Val Asn Val Pro Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ile85 90 95 100Leu Thr Pro Thr Pro Val Asn Pro Ser Thr Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Pro Thr Phe105 110 115 120Ala Gly Thr Gln Thr Pro Val Asn Gly Asn Ser Pro Trp Ala Pro Thr Ala Pro Leu Pro125 130 135 140Gly Asp Met Asn Pro Ala Asn Trp Pro Arg Glu Arg Ala Trp Ala Leu Lys Asn Pro His
145 150 155 160Leu Ala Tyr Asn Pro Phe Arg Met Pro Thr Thr Ser Thr Ala Ser Gln Asn Thr Val Ser165 170 175 180Thr Thr Pro Arg Arg Pro Ser Thr Pro Arg Ala Ala Val Thr Gln Thr Ala Ser Leu Glu185 190 195 200Leu Asp Gly Lys Gly Asp Asp Gly Val Pro Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Arg205 210 215 220Asp Val Ser Gly Gly Pro Ser Asp Gly Leu Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly225 230 235 240Asp Ser Gly Gly Met Met Gly Arg Gly Gly Arg Met Leu Gly Ala Ser Vla Asp Arg Thr245 250 255 260Tyr Arg Leu Asn本发明所述的基因重组人巨细胞病毒融合蛋白pp150/MDBP的制备方法，该融合蛋白是利用基因工程技术制备，具体方法如下(1)通过计算机分析HCMV磷蛋白150(phosphoprotein 150，pp150)的全部氨基酸序列，筛选出pp150蛋白内的强抗原表位，即从第495氨基酸至691氨基酸，其氨基酸序列和DNA序列如下筛选的HCMV pp150蛋白强抗原表位的197个氨基酸序列Leu Val Ser Pro Gln Val Thr Lys Ala Ser Pro Gly Arg Val Val Val Asp Ser Ala Trp5 10 15 20Asp Val Arg Pro Leu Thr Glu Thr Arg Gly Asp Leu Phe Ser Gly Asp Glu Asp Ser Asp25 30 35 40Ser Ser Asp Gly Tyr Pro Pro Asn Arg Gln Asp Pro Arg Phe Thr Asp Thr Leu Val Asp45 50 55 60Ile Thr Asp Thr Glu Thr Ser Ala Lys Pro Pro Val Thr Thr Ala Tyr Lys Phe Glu Gln65 70 75 80Pro Thr Leu Thr Phe Gly Ala Gly Val Asn Val Pro Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ile Leu85 90 95 100Thr Pro Thr Pro Val Asn Pro Ser Thr Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Pro Thr Phe Ala105 110 115 120Gly Thr Gln Thr Pro Val Asn Gly Asn Ser Pro Trp Ala Pro Thr Ala Pro Leu Pro Gly125 130 135 140Asp Met Asn Pro Ala Asn Trp Pro Arg Glu Arg Ala Trp Ala Leu Lys Asn Pro His Leu145 150 155 160Ala Tyr Asn Pro Phe Arg Met Pro Thr Thr Ser Thr Ala Ser Gln Asn Thr Val Ser Thr165 170 175 180Thr Pro Arg Arg Pro Ser Thr Pro Arg Ala Ala Val Thr Gln Thr Ala Ser185 190 195
筛选的ppl50蛋白抗原表位的DNA序列CTC GTC TCC CCG CAG GTG ACC AAG GCC AGC CCG GGA AGG GTC CGT CGG GAC AGC GCG TGGGAC GTG AGG CCG CTC ACG GAG ACC AGA GGG GAT CTT TTC TCG GGC GAC GAG GAT TCC GACAGC TCG GAT GGC TAT CCC CCC AAC CGT CAA GAT CCG CGT TTC ACC GAC ACG CTG GTG GACATC ACG GAT ACC GAG ACG AGC GCC AAA CCG CCC GTC ACC ACC GCG TAC AAG TTC GAG CAACCG ACG TTG ACG TTC GGC GCC GGA GTT AAC GTT CCT GCT GGC GCC GGC GCT GCC ATC CTCACG CCG ACG CCT GTC AAT CCT TCC ACG GCC CCC GCT CCG GCC CCG ACA CCT ACC TTC GCGGGT ACC CAA ACC CCG GTC AAC GGT AAC TCG CCC TGG GCT CCG ACG GCG CCG TTG CCC GGGGAT TAG AAC CCC GCC AAC TGG CCG CGC GAA CGC GCG TGG GCC CTC AAG AAT CCT CAC CTGGCT TAC AAT CCC TTC AGG TAG CCT ACG ACT TCC ACG GCT TCT CAA AAC ACC GTG TCC ACCACC CCT CGG AGG CCG TCG ACT CCA CGC GCC GCG GTG ACA CAA ACA GCG TCT在上述抗原表位的DNA序列的两侧选择设计PCR引物，并用化学合成法合成两条引物链，分别为上游引物P15’CAGGAATTCATGCTCGTCTCCCCGCAGGTGAC 3’下游引物P25’CAACTCGAGAGACGCTGTTTGTGTCACCGC 3’其中，上游引物含有ECoRI酶切位点、起始密码子ATG及部分目的基因序列；下游引物含有XhoI的酶切位点和部分目的基因序列，可扩增包含591bp目的基因在内的DNA片段；(2)通过计算机分析HCMV 甲基化DNA结合蛋白(methylated DNA bindingprotein，MDBP)的全部氨基酸序列，筛选出MDBP蛋白内的强抗原表位，即从第538氨基酸至601氨基酸，其氨基酸序列和DNA序列如下筛选的HCMV MDBP蛋白强抗原表位的64个氨基酸序列Leu Asp Gly Lys Gly Asp Asp Gly Val Pro Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Arg5 10 15 20Asp Val Ser Gly Gly Pro Ser Asp Gly Leu Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly25 30 35 40Asp Ser Gly Gly Met Met Gly Arg Gly Gly Arg Met Leu Gly Ala Ser Vla Asp Arg Thr45 50 55 60Tyr Arg Leu Asn筛选的MDBP蛋白抗原表位的DNA序列TTG GAC GGC AAA GGT GAC GAC GGG GTT CCG GGC GGC GGT GCT GGC GGG GGT GGT GGA CGAGAC GTG AGC GGG GGC CCG AGC GAC GGT CTG GGT GGC GGT CGT GGT GGT GGG GGT GGT GGGGAT TCC GGG GGA ATG ATG GGG CGC GGC GGT CGC ATG TTG GGC GCT AGC GTG GAC CGT ACCTAT CGG CTC AAT TAA在上述抗原表位的DNA序列的两侧选择设计PCR引物，并用化学合成法合成两条引物链，分别为
上游引物P15’CAACTCGAGTTGGACGGCAAAGGTGAC 3’下游引物P25’CGCGGATCCATTGAGCCGATAGGTACGGT 3’其中，上游引物含有XhoI酶切位点及部分目的基因序列；下游引物含有BamHI的酶切位点、部分目的基因序列和TAA终止密码子，可扩增包含目的基因在内的192bp的DNA片段。
取HCMV AD169株细胞，裂解细胞并纯化HCMV DNA；以纯化的HCMV DNA为模板，分别用相应引物P1、P2以扩增条件为95℃30秒、59℃40秒、72℃55秒，32个循环PCR扩增HCMV PP150蛋白抗原表位的基因片段；以扩增条件为95℃30秒、56℃40秒、72℃45秒，32个循环PCR扩增HCMV MDBP蛋白抗原表位的基因片段；然后分别经琼脂糖凝电泳回收、纯化扩增的基因片段。
表达融合蛋白重组质粒的构建将上述PCR扩增、纯化回收的基因片段分别转化pMD18-T克隆载体，分别构建出相应的pMD18-T-UL57克隆载体和pMD18-T-UL32克隆载体并转化大肠杆菌，扩菌培养后碱变性法提取质粒，质粒经酶切、PCR扩增验证正确后，pMD18-T-UL57克隆载体和pMD18-T-UL32克隆载体均用XhoI和BamHI双酶切，胶回收纯化线性化pMD18-T-UL32克隆载体和编码HCMV MDBP蛋白、带有XhoI和BamHI粘性末端酶切位点的基因片段，二者在T4DNA连接酶的作用下，构建出含有PP150蛋白基因片段和MDBP蛋白基因片段的pMD18-T-UL32-UL57融合基因克隆载体，并转化大肠杆菌，扩菌培养后碱变性法提取质粒，经双酶切和PCR扩增验证后，该融合基因克隆载体与pBV220表达载体分别用ECoRI和BamHI双酶切，胶回收纯化线性化pBV220表达载体和融合基因，并在T4DNA连接酶的作用下，将PP150蛋白基因片段和MDBP蛋白基因片段构成的融合基因串联插入到表达载体pBV220内的ECoRI和BamHI位点之间，两者翻译框架一致，表达一个融合蛋白。
重组质粒的筛选与鉴定将上述重组质粒转化大肠杆菌BL21，挑取转化子，碱变性法提取质粒，用EcoRI和BamHI酶切及DNA序列分析，筛选出含PP150蛋白基因和MDBP蛋白基因串连片段的重组质粒，PP150蛋白的基因在串连基因的5’端，MDBP蛋白的基因在串连基因的3’端，两者之间由XhoI酶切位点(下划线部分)连接，序列如下ATG CTC GTC TCC CCG CAG GTG ACC AAG GCC AGC CCG GGA AGG GTC CGT CGG GAC AGC GCGTGG GAC GTG AGG CCG CTC ACG GAG ACC AGA GGG GAT CTT TTC TCG GGC GAC GAG GAT TCCGAC AGC TCG GAT GGC TAT CCC CCC AAC CGT CAA GAT CCG CGT TTC ACC GAC ACG CTG GTGGAC ATC ACG GAT ACC GAG ACG AGC GCC A AA CCG CCC GTC ACC ACC GCG TAC AAG TTCGAG CAA CCG ACG TTG ACG TTC GGC GCC GGA GTT AAC GTT CCT GCT GGC GCC GGC GCT GCCATC CTC ACG CCG ACG CCT GTC AAT CCT TCC ACG GCC CCC GCT CCG GCC CCG ACA CCT ACCTTC GCG GGT ACC CAA ACC CCG GTC AAC GGT AAC TCG CCC TGG GCT CCG ACG GCG CCG TTGCCC GGG GAT TAG AAC CCC GCC AAC TGG CCG CGC GAA CGC GCG TGG GCC CTC AAG AAT CCT
CAC CTG GCT TAC AAT CCC TTC AGG TAG CCT ACG ACT TCC ACG GCT TCT CAA AAC ACC GTGTCC ACC ACC CCT CGG AGG CCG TCG ACT CCA CGC GCC GCG GTG ACA CAA ACA GCG TCTCTCGAGTTG GAC GGC AAA GGT GAC GAC GGG GTT CCG GGC GGC GGT GCT GGC GGG GGT GGT GGACGA GAC GTG AGC GGG GGC CCG AGC GAC GGT CTG GGT GGC GGT CGT GGT GGT GGG GGT GGTGGG GAT TCC GGG GGA ATG ATG GGG CGC GGC GGT CGC ATG TTG GGC GCT AGC GTG GAC CGTACC TAT CGG CTC AAT TAA构建的重组质粒表达PP150蛋白的197个氨基酸与MDBP蛋白的64个氨基酸的融合蛋白，该融合蛋白氨基酸序列为Met Leu Val Ser Pro Gln Val Thr Lys Ala Ser Pro Gly Arg Val Val Val Asp Ser Ala5 10 15 20Trp Asp Val Arg Pro Leu Thr Glu Thr Arg Gly Asp Leu Phe Ser Gly Asp Glu Asp Ser25 30 35 40Asp Ser Ser Asp Gly Tyr Pro Pro Asn Arg Gln Asp Pro Arg Phe Thr Asp Thr Leu Val45 50 55 60Asp Ile Thr Asp Thr Glu Thr Ser Ala Lys Pro Pro Val Thr Thr Ala Tyr Lys Phe Glu65 70 75 80Gln Pro Thr Leu Thr Phe Gly Ala Gly Val Asn Val Pro Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ile85 90 95 100Leu Thr Pro Thr Pro Val Asn Pro Ser Thr Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Pro Thr Phe105 110 115 120Ala Gly Thr Gln Thr Pro Val Asn Gly Ash Ser Pro Trp Ala Pro Thr Ala Pro Leu Pro125 130 135 140Gly Asp Met Asn Pro Ala Asn Trp Pro Arg Glu Arg Ala Trp Ala Leu Lys Asn Pro His145 150 155 160Leu Ala Tyr Asn Pro Phe Arg Met Pro Thr Thr Ser Thr Ala Ser Gln Asn Thr Val Ser165 170 175 180Thr Thr Pro Arg Arg Pro Ser Thr Pro Arg Ala Ala Val Thr Gln Thr Ala Ser Leu Glu185 190 195 200Leu Asp Gly Lys Gly Asp Asp Gly Val Pro Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Arg205 210 215 220Asp Val Ser Gly Gly Pro Ser Asp Gly Leu Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly225 230 235 240Asp Ser Gly Gly Met Met Gly Arg Gly Gly Arg Met Leu Gly Ala Ser Vla Asp Arg Thr245 250 255 260Tyr Arg Leu Asn表达融合蛋白工程菌的筛选鉴定将含有重组质粒的阳性转化子，接种到含有氨苄青霉素100μg/mL的LB液体培养基中，30℃振荡培养4～8小时，然后迅速升温至42℃诱导4小时，离心收集菌体进行SDS-PAGE检测筛选并用Western Blotting验证，获得表达融合蛋白的工程菌，表达的融合蛋白的相对分子量约为27000，以可溶性形式存在，表达量约占菌体蛋白总量的25％。
表达融合蛋白的纯化将诱导表达融合蛋白的工程菌离心，收集菌体，冰浴超声破碎细菌，再离心收集上清，收集后的上清先经Sephacryl S200进行初步纯化，接收目的蛋白峰，然后将接收的目的蛋白峰上DEAE-Sepharose FastFlow阴离子柱，用10、50、100、500mmol/L梯度浓度的NaCl溶液洗脱蛋白，收集100mmol/L NaCl溶液洗脱蛋白峰，该峰含有表达的融合蛋白；将上一步DEAE-Sepharose FastFlow阴离子柱100mmol/L NaCl溶液洗脱蛋白峰加入终浓度为1.5mol/L的硫酸铵，然后上Phenyl Sepharose FastFlow疏水柱层析纯化，接收目的蛋白峰，此即为纯化的融合蛋白。
利用本发明方法制备的基因重组人巨细胞病毒融合蛋白即HCMV pp150/MDBP融合蛋白，抗原性强、特异性好，与病毒提取的抗原组分相比，本发明方法生产的重组抗原在人巨细胞病毒检测的应用中准确率明显提高，且融合抗原的检测准确率要优于单一抗原；具有应用方便、成本低、多抗体同时检测等优点，这为在制备其疫苗、单抗、多抗、蛋白芯片、ELISA检测试剂盒以及与人巨细胞病毒相关产品中的应用奠定了基础，同时，本发明建立了一整套简便有效纯化基因重组人巨细胞病毒融合蛋白pp150/MDBP的工艺流程，可有效提高融合蛋白的表达量和得率，并且大大降低了基因重组融合蛋白的生产成本，具有巨大的社会效益和经济效益。


图1人巨细胞病毒UL32基因片段扩增结果图2pMD18-T-UL32克隆载体的构建图3人巨细胞病毒UL57基因片段扩增结果图4pMD18-T-UL57克隆载体的构建图5pMD18-T-UL32-UL57克隆载体双酶切图谱图6pMD18-T-UL32-UL57克隆载体的构建图7pBV220-UL32-UL57表达载体的构建图8pBV220-UL32-UL57表达载体正向测序图谱图9pBV220-UL32-UL57表达载体反向测序图谱图10pBV220-UL32-UL57表达载体双酶切图谱图11工程菌经诱导后融合蛋白表达的SDS-PAGE电泳12BL21工程菌表达融合蛋白的Western blot分析结果图13融合蛋白经DEAE纯化后SDS-PAGE电泳效果14融合蛋白经HIC纯化后SDS-PAGE电泳效果15融合蛋白pp150/MDBP浓度与吸光度的线性回归曲线16重组融合蛋白pp150/MDBP制备的蛋白芯片用于检测HCMV IgG抗体其中1阳性对照，2-4三个重组融合蛋白pp150/MDBP的重复，5阴性对照A血清原液的杂交结果，B血清1∶10稀释。
具体实施例方式
下面结合实施例对发明的内容作进一步阐述1.融合蛋白表达基因的扩增1.1人巨细胞病毒pp150基因UL32基因片段的克隆筛选的pp150蛋白抗原表位的DNA序列是CTC GTC TCC CCG CAG GTG ACC AAG GCC AGC CCG GGA AGG GTC CGT CGG GAC AGC GCG TGGGAC GTG AGG CCG CTC ACG GAG ACC AGA GGG GAT CTT TTC TCG GGC GAC GAG GAT TCC GACAGC TCG GAT GGC TAT CCC CCC AAC CGT CAA GAT CCG CGT TTC ACC GAC ACG CTG GTG GACATC ACG GAT ACC GAG ACG AGC GCC AAA CCG CCC GTC ACC ACC GCG TAC AAG TTC GAG CAACCG ACG TTG ACG TTC GGC GCC GGA GTT AAC GTT CCT GCT GGC GCC GGC GCT GCC ATC CTCACG CCG ACG CCT GTC AAT CCT TCC ACG GCC CCC GCT CCG GCC CCG ACA CCT ACC TTC GCGGGT ACC CAA ACC CCG GTC AAC GGT AAC TCG CCC TGG GCT CCG ACG GCG CCG TTG CCC GGGGAT TAG AAC CCC GCC AAC TGG CCG CGC GAA CGC GCG TGG GCC CTC AAG AAT CCT CAC CTGGCT TAC AAT CCC TTC AGG TAG CCT ACG ACT TCC ACG GCT TCT CAA AAC ACC GTG TCC ACCACC CCT CGG AGG CCG TCG ACT CCA CGC GCC GCG GTG ACA CAA ACA GCG TCT在上述抗原表位的DNA序列的两侧选择设计PCR引物，并用化学合成法合成两条引物链，分别为上游引物P15’CAGGAATTCATGCTCGTCTCCCCGCAGGTGAC 3’下游引物P25’CAACTCGAGAGACGCTGTTTGTGTCACCGC 3’其中，上游引物含有ECoRI酶切位点、起始密码子ATG；下游引物含有XhoI的酶切位点。
取HCMV AD169株细胞，裂解细胞并纯化HCMV DNA；以提取纯化的人巨细胞病毒AD169株的DNA为模板，用引物P1、P2以扩增条件为95℃30秒、59℃40秒、72℃55秒，32个循环PCR扩增HCMV UL32目的基因片段，然后经琼脂糖凝电泳回收、纯化扩增的基因片段。HCMV UL32基因片段的PCR扩增结果见图1，克隆载体的构建图谱见图2。
1.2人巨细胞病毒MDBP基因UL57基因片段的克隆筛选的MDBP蛋白抗原表位的DNA序列是TTG GAC GGC AAA GGT GAC GAC GGG GTT CCG GGC GGC GGT GCT GGC GGG GGT GGT GGA CGAGAC GTG AGC GGG GGC CCG AGC GAC GGT CTG GGT GGC GGT CGT GGT GGT GGG GGT GGT GGGGAT TCC GGG GGA ATG ATG GGG CGC GGC GGT CGC ATG TTG GGC GCT AGC GTG GAC CGT ACCTAT CGG CTC AAT TAA在上述抗原表位的DNA序列的两侧选择设计PCR引物，并用化学合成法合成两条引物链，分别为
上游引物P15’CAACTCGAGTTGGACGGCAAAGGTGAC 3’下游引物P25’CGCGGATCCATTGAGCCGATAGGTACGGT 3’其中，上游引物含有XhoI酶切位点；下游引物含有BamHI的酶切位点以及终止密码子TAA。
取HCMV AD169株细胞，裂解细胞并纯化HCMV DNA；以提取纯化的人巨细胞病毒AD169株的DNA为模板，用引物P1、P2以扩增条件为95℃ 30秒、56℃ 40秒、72℃ 45秒，32个循环PCR扩增HCMV UL57目的基因片段，然后经琼脂糖凝电泳回收、纯化扩增的基因片段。
HCMV UL57基因片段的PCR扩增结果见图3，克隆载体的构建图谱见图4。
2.pMD18-T-UL32-UL57克隆载体的构建2.1将含有HCMV UL32基因的克隆载体质粒溶液按下列反应体系进行反应成份体积(μl)pMD18-T-UL3220XhoI(10U/ml)1.5BamH I(15U/ml) 110×K buffer3dH2O(sterilized) 4.5总体积 3037℃条件下酶切3h，反应完毕，取反应样品30μl，加3.3μl 10×Loading buffer，混合均匀，行1.5％DNA琼脂糖凝胶电泳，回收线性克隆载体。
2.2将含有HCMV UL57目的基因的克隆载体质粒溶液按下列反应体系进行反应成份体积(μl)pMD18-T-UL5720XhoI(10U/ml)1.5BamH I(15U/ml) 110×K buffer3dH2O(sterilized) 4.5总体积 3037℃条件下酶切3h，反应完毕，取反应样品30μl，加3.3μl 10×Loading buffer，混合均匀，行1.5％DNA琼脂糖凝胶电泳，当观察样品在泳道上行出单一条带时，停止电泳，回收目的基因。
2.3含HCMV UL32目的基因的克隆质粒线性载体与HCMV UL57目的基因的连接将回收的含HCMV UL32目的基因的克隆质粒线性载体与HCMV UL57按摩尔数之比3∶1混合均匀，按下列比例建立反应体系进行反应，16℃条件下，过夜连接。
成份体积(μl)HCMV-UL57 10
linear pMD18-T-UL32(vector)0.510×Ligase Buffer 2T4 DNA Ligase 0.5dH2O(sterilized) 7总体积 202.4细菌转化及阳性克隆的筛选无菌取新鲜的E.coli DH5a感受态细菌300μl，加入质粒载体pMD18-T-UL32-UL57 10μl(60ng)，冰浴2-3min，轻轻混匀，冰浴30min，42℃热休克90sec，冰浴2～3min，无菌条件下加入无抗生素的LB液体培养基700μl，37℃培养45min，1000g离心5min，去除部分液体，保留100μl，重悬菌体，全部铺于LB平板(含Amp 100μg/ml)上，37℃平放培养20min后再倒置培养过夜，于次日晨，观察培养板菌落形成情况，分别挑选生长状态良好的白色单菌落接种到5ml含100μg/ml Amp的LB液体培养基中，37℃、200-250rpm过夜培养，小量提取质粒1.5％琼脂糖凝胶电泳、酶切鉴定后，用含20％的甘油LB培养液，-70℃保存菌种。克隆载体融合基因片段的双酶切结果见图5，融合基因的克隆载体的构建图谱见图6。
3.pBV220-UL32-UL57表达载体的构建3.1融合基因的制备以制备好的含有融合基因的克隆载体pMD18-T-UL32-UL57进行双酶切消化，经琼脂糖凝胶电泳及胶回收等步骤，制备融合基因。
酶切反应体系为成份 体积(μl)pMD18-T-UL32-UL5720EcoRI(15U/ml)3BamH I(15U/ml) 310×K buffer 4dH2O(sterilized)10总体积 403.2线性化表达质粒pBV220的制备将表达质粒pBV220，按下列组分建立如下酶切反应体系成份体积(μl)pBV220 expression vector20EcoRI(15U/ml) 2BamHI(15U/ml) 210×K buffer4dH2O(sterilized) 12
总体积 40总反应体积40μl，37℃消化3h，酶切完毕后，取酶切反应产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，回收空质粒表达载体。
3.3表达质粒pBV220与HCMV UL32-UL57目的基因的连接将回收的HCMV UL32-UL57目的基因与表达质粒空载体pBV220按摩尔数之比3∶1混合均匀，建立连接反应体系(see Table 6-8)，16℃，过夜连接。
成份 体积(μl)HCMV UL32-UL57 10linear pBV220 vector 110×Ligase Buffer2T4 DNA Ligase0.4dH2O(sterilized)6.6总体积 203.4带有HCMV UL32-UL57目的基因的表达载体pBV220的转化及阳性克隆的筛选无菌取新鲜的BL21感受态细菌200μl，加入连接产物10μl，冰浴2-3min，轻轻混匀，冰浴30min，42℃热休克90sec，冰浴2～3min，无菌条件下加入无抗生素的LB液体培养基800μl，37℃、150转/min培养45min，3000g离心1min，去除部分液体，保留100μl，重悬菌体，全部铺于LB(含100μg/ml Amp)平板上，37℃平放培养20min，然后倒置培养过夜。
用提取后的质粒溶液建立如下酶切反应体系成份 体积(μl)pBV220-UL32-UL57 10BamHI(15U/ml)1EcoR I(15U/ml) 110×K buffer 2dH2O(sterilized)6总体积 20总反应体积20μl，37℃消化3h，取酶切产物进行1.5％琼脂糖电泳，分析结果并拍照。得到表达质粒载体pBV220-UL32-UL57(见图7)。融合基因表达载体构建的正反向测序结果见图8-9。表达载体的双酶切结果见图10。
4.融合蛋白pp150/MDBP生产菌的选择与构建4.1宿主菌大肠杆菌BL214.2质粒pBV220-UL32-UL57的转化无菌取新鲜的BL21感受态细菌200μL，加入连接产物10μl，冰浴2-3min，轻轻混匀，冰浴30min，42℃热休克90sec，冰浴2-3min，无菌条件下加入无抗生素的LB液体培养基800μl，37℃、150转/min培养45min，3000g离心1min，去除部分液体，保留溶液约100μl，重悬菌体，全部铺于LB(含100μg/ml Amp)平板上，37℃平放培养20min，然后倒置培养过夜。
5.pBV220-UL32-UL57转化菌的筛选从新鲜转化平板上挑取转化菌落，分别接种于含有氨苄青霉素100μg/mL的选择培养基的试管中，30℃振荡培养过夜，分别离心收集菌体，用碱裂解法，将菌体悬浮，氢氧化钠裂解，醋酸钠中和，离心所得上清液，分别用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，离心回收质粒DNA，回收的质粒DNA分别溶解于TE后，用EcoRI和BamHI双酶切，琼脂糖电泳，筛选出含800bp左右片段样品。
将筛选所得的携有重组质粒的菌样，分别接种于含有氨苄青霉素100μg/mL的LB培养基中，30℃振荡培养过夜，然后按1∶100比例接种于LB培养基中，30℃培养4小时后，42℃继续培养4小时，离心收集菌体。
部分菌体用SDS-PAGE电泳检查全菌蛋白，在27KD处有明显表达条带，经检测目的蛋白条带占全菌总蛋白的25％左右(见图11)，该菌体经上样缓冲液处理后，进行Westernblot分析，发现为单一条带，进一步证明所表达蛋白即为预期的融合蛋白(见图12)。
DNA序列分析挑取上述表达目的蛋白的转化子，碱变性法提取质粒，用EcoRI和BamHI酶切及DNA序列分析测定，质粒内的PP150蛋白基因和MDBP蛋白基因片段的DNA序列完整，与设计的人巨细胞病毒UL32基因片段和人巨细胞病毒UL57基因片段的DNA序列一致，其序列如下ATG CTC GTC TCC CCG CAG GTG ACC AAG GCC AGC CCG GGA AGG GTC CGT CGG GAC AGC GCGTGG GAC GTG AGG CCG CTC ACG GAG ACC AGA GGG GAT CTT TTC TCG GGC GAC GAG GAT TCCGAC AGC TCG GAT GGC TAT CCC CCC AAC CGT CAA GAT CCG CGT TTC ACC GAC ACG CTG GTGGAC ATC ACG GAT ACC GAG ACG AGC GCC AAA CCG CCC GTC ACC ACC GCG TAC AAG TTC GAGCAA CCG ACG TTG ACG TTC GGC GCC GGA GTT AAC GTT CCT GCT GGC GCC GGC GCT GCC ATCCTC ACG CCG ACG CCT GTC AAT CCT TCC ACG GCC CCC GCT CCG GCC CCG ACA CCT ACC TTCGCG GGT ACC CAA ACC CCG GTC AAC GGT AAC TCG CCC TGG GCT CCG ACG GCG CCG TTG CCCGGG GAT TAG AAC CCC GCC AAC TGG CCG CGC GAA CGC GCG TGG GCC CTC AAG AAT CCT CACCTG GCT TAC AAT CCC TTC AGG TAG CCT ACG ACT TCC ACG GCT TCT CAA AAC ACC GTG TCCACC ACC CCT CGG AGG CCG TCG ACT CCA CGC GCC GCG GTG ACA CAA ACA GCG TCTCTC GAGTTG GAC GGC AAA GGT GAC GAC GGG GTT CCG GGC GGC GGT GCT GGC GGG GGT GGT GGA CGAGAC GTG AGC GGG GGC CCG AGC GAC GGT CTG GGT GGC GGT CGT GGT GGT GGG GGT GGT GGGGAT TCC GGG GGA ATG ATG GGG CGC GGC GGT CGC ATG TTG GGC GCT AGC GTG GAC CGT ACCTAT CGG CTC AAT TAA构建的重组质粒表达PP150蛋白的197个氨基酸与MDBP蛋白的64个氨基酸的融合蛋白，该融合蛋白氨基酸序列为Met Leu Val Ser Pro Gln Val Thr Lys Ala Ser Pro Gly Arg Val Val Val Asp Ser Ala5 10 15 20
Trp Asp Val Arg Pro Leu Thr Glu Thr Arg Gly Asp Leu Phe Ser Gly Asp Glu Asp Ser25 30 35 40Asp Ser Ser Asp Gly Tyr Pro Pro Asn Arg Gln Asp Pro Arg Phe Thr Asp Thr Leu Val45 50 55 60Asp Ile Thr Asp Thr Glu Thr Ser Ala Lys Pro Pro Val Thr Thr Ala Tyr Lys Phe Glu65 70 75 80Gln Pro Thr Leu Thr Phe Gly Ala Gly Val Asn Val Pro Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ile85 90 95 100Leu Thr Pro Thr Pro Val Asn Pro Ser Thr Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Pro Thr Phe105 110 115 120Ala Gly Thr Gln Thr Pro Val Asn Gly Asn Ser Pro Trp Ala Pro Thr Ala Pro Leu Pro125 130 135 140Gly Asp Met Ash Pro Ala Asn Trp Pro Arg Glu Arg Ala Trp Ala Leu Lys Asn Pro His145 150 155 160Leu Ala Tyr Asn Pro Phe Arg Met Pro Thr Thr Ser Thr Ala Ser Gln Asn Thr Val Ser165 170 175 180Thr Thr Pro Arg Arg Pro Ser Thr Pro Arg Ala Ala Val Thr Gln Thr Ala Ser Leu Glu185 190 195 200Leu Asp Gly Lys Gly Asp Asp Gly Val Pro Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Arg205 210 215 220Asp Val Ser Gly Gly Pro Ser Asp Gly Leu Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly225 230 235 240Asp Ser Gly Gly Met Met Gly Arg Gly Gly Arg Met Leu Gly Ala Ser Vla Asp Arg Thr245 250 255 260Tyr Arg Leu Asn以上结果说明，构建的人巨细胞病毒融合基因表达载体的生产菌是一个可以高效表达融合蛋白pp150/MDBP的系统，具有工业化生产的价值。
6.融合蛋白的表达及纯化将工程菌单菌落挑入5ml含100μg/ml Amp的LB培养基中，30℃培养过夜，次日转至800ml含100μg/ml Amp的LB培养基中，30℃培养至其进入对数生长期，快速升温至42℃，诱导表达4小时，离心收集菌体。
离心收集的菌体经TE缓冲液洗涤后，冰浴超声破碎，10000g离心10分钟得上清液，收集后的上清液先经Sephacryl S200进行初步纯化，接收目的蛋白峰，然后将接收的目的蛋白峰上DEAE-Sepharose FastFlow阴离子柱，用10、50、100、500mmol/L梯度浓度的NaCl溶液洗脱蛋白，收集100mmol/L NaCl溶液洗脱蛋白峰，该峰含有表达的融合蛋白；将DEAE-Sepharose FastFlow阴离子柱100mmol/L NaCl溶液洗脱蛋白峰加入终浓度为1.5mol/L的硫酸铵，然后上Phenyl Sepharose FastFlow疏水柱层析纯化，接收目的蛋白峰，加入常规稳定保护剂甘露醇或海藻糖，过滤除菌后保存备用，此即为纯化的融合蛋白。(图13-14)。
7.融合蛋白的应用7.1ELISA方法检测血清抗HCMV IgG抗体实验步骤如下7.1.1包被用包被液稀释基因重组人巨细胞病毒融合蛋白pp150/MDBP，使其终浓度分别为10、2、0.4、0.2μg/ml后包被酶联板，每孔加入各相应浓度融合蛋白溶液100μl，其中，每板留3个空白孔，各加入包被液100μl，用封口膜封板，4℃过夜。
7.1.2温育取过夜的包被板置于37℃温箱中温育1小时。
洗板用PBST洗板3-5次，3-5分钟/次，每次200μl。
7.1.3封闭各孔分别加入PBST-BSA1％封闭液100μl，封口后放入37℃恒温箱中，温育1小时。
7.1.4洗板用PBST洗板3-5次，3-5分钟/次，每次200μl。
7.1.5加阳性血清除阴性对照孔加入100μl PBST-BSA 1％之外，其余每孔分别加入100μl用PBST-BSA 1％稀释的HCMV IgG阳性血清(按1∶40比例稀释)，用封口膜封口后，将酶标板置于37℃温箱中温育1小时。
7.1.6洗板用PBST洗板3-5次，3-5分钟/次，每次200μl。
7.1.7加二抗羊抗人IgG-HRP按1∶3000的比例用PBST-BSA 1％稀释完毕后，各孔分别加入该稀释液100μl，封口膜封口后37℃温育1小时。
7.7.8洗板用PBST洗板3-5次，3-5分钟/次，每次200μl。
7.7.9加底物各孔分别加入底物显色液TMB 100μl，然后将酶标板置于暗处放置20分钟，显色。
7.7.10加终止液显色完成后，各孔分别加入2M H2SO4100μl终止反应。
7.1.11酶标仪读数加入终止液终止反应后，15分钟内用450nm波长测定其光吸收值。
结果将纯化后的融合蛋白pp150/MDBP按梯度稀释后，与阳性血清及阴性对照一起包被酶标板，反应完毕后分别测定其A450光吸收值，结果见表1。
表1pp150/MDBP融合蛋白对ELISA检测结果(X±SD)

以重组融合蛋白的蛋白浓度C(μg/ml)为自变量，以相应的A450光吸收值作为因变量，进行线性回归处理，得线性回归方程为A＝0.2362C+1.9683，r＝0.9415线性关系图谱见附图15，表明融合蛋白的浓度与吸光度值呈较好的线性关系。
7.2人巨细胞病毒融合蛋白pp150/MDBP用于制备蛋白芯片法检测HCMV IgG抗体具体实验步骤如下7.2.1将氨基化玻片置于2.5％戊二醛PBS试液中，浸泡2h后，用PBS冲洗3遍。
7.2.2点样将融合蛋白抗原及阳性对照点于醛基玻片上，室温放置24h。
7.2.3温育将点好融合蛋白抗原及阳性对照的玻片置于37℃恒温箱中，温育2h，然后用PBST洗3次，每次10秒，最后用蒸馏水冲洗玻片。
7.2.4封闭将玻片置于含1％BSA的PBST封闭液中，封闭1h，然后用PBST洗3次，每次10秒，蒸馏水冲洗玻片，以硼氰化钠还原5min，然后用PBST洗3次，每次10秒，最后用蒸馏水冲洗玻片。
7.2.5抗原抗体反应将HCMV IgG阳性血清加至阵列上，37℃温育2h，然后用PBST洗3次，每次10秒，最后用蒸馏水冲洗玻片。冲洗完毕的玻片置于离心机中，800rpm离心3min。
7.2.6与二抗结合将2.5μL cy3-抗人IgG(用PBST按1∶30比例稀释而成)加至阵列上，37℃温育30min，然后用PBST洗3次，每次10秒，最后用蒸馏水冲洗玻片。冲洗完毕的玻片置于离心机中，800rpm离心3min。
7.2.7扫描采用ScanArray4000激光聚焦扫描仪进行扫描，扫描分辨率为10μm。
结果重组融合蛋白pp150/MDBP用于阳性HCMVIgG抗体检测的扫描结果见图16，其中1.阳性对照，2-4三个重组融合蛋白pp150/MDBP的重复，5.阴性对照；表明融合蛋白可以用于制备蛋白芯片用于HCMV IgG的检测。
序列表<110>山东省医药生物技术研究中心<120>一种基因重组人巨细胞病毒融合蛋白pp150/MDBP及其制备方法与应用<141>2005-8-8<160>2<210>1<211>264<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>
<222>(1)…(264)<223>一种新型的重组蛋白，即人巨细胞病毒pp150蛋白495至691氨基酸片段的197个氨基酸和MDBP蛋白538至601氨基酸片段的64个氨基酸串联形成的融合蛋白。pp150蛋白的197个氨基酸在融合蛋白的N端，MDBP蛋白的64个氨基酸在融合蛋白的C端，两者之间由亮氨酸(Leu)和谷氨酸(Glu)2个氨基酸连接而成，并且融合蛋白的N端增加了1个甲硫氨酸(Met)，全长264个氨基酸。
<400>1Met Leu Val Ser Pro Gln Val Thr Lys Ala Ser Pro Gly Arg Val Val Val Asp Ser Ala5 10 15 20Trp Asp Val Arg Pro Leu Thr Glu Thr Arg Gly Asp Leu Phe Ser Gly Asp Glu Asp Ser25 30 35 40Asp Ser Ser Asp Gly Tyr Pro Pro Asn Arg Gln Asp Pro Arg Phe Thr Asp Thr Leu Val45 50 55 60Asp Ile Thr Asp Thr Glu Thr Ser Ala Lys Pro Pro Val Thr Thr Ala Tyr Lys Phe Glu65 70 75 80Gln Pro Thr Leu Thr Phe Gly Ala Gly Val Asn Val Pro Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ile85 90 95 100Leu Thr Pro Thr Pro Val Asn Pro Ser Thr Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Pro Thr Phe105 110 115 120Ala Gly Thr Gln Thr Pro Val Asn Gly Asn Ser Pro Trp Ala Pro Thr Ala Pro Leu Pro
125 130 135 140Gly Asp Met Asn Pro Ala Asn Trp Pro Arg Glu Arg Ala Trp Ala Leu Lys Asn Pro His145 150 155 160Leu Ala Tyr Asn Pro Phe Arg Met Pro Thr Thr Ser Thr Ala Ser Gln Ash Thr Val Ser165 170 175 180Thr Thr Pro Arg Arg Pro Ser Thr Pro Arg Ala Ala Val Thr Gln Thr Ala Ser Leu Glu185 190 195 200Leu Asp Gly Lys Gly Asp Asp Gly Val Pro Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Arg205 210 215 220Asp Val Ser Gly Gly Pro Ser Asp Gly Leu Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly225 230 235 240Asp Ser Gly Gly Met Met Gly Arg Gly Gly Arg Met Leu Gly Ala Ser Vla Asp Arg Thr245 250 255 260Tyr Arg Leu Asn<210>2<211>795<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>cds<222>(1)…(795)<220>
<221>mis-feature<222>(1)…(3)<223>合成pp150N端多肽基因时增加的起始密码子<220>
<221>mis-feature<222>(4)…(594)<223>克隆的pp150N端多肽基因的基因序列<220>
<221>mis-feature<222>(595)…(600)<223>连接pp150N端多肽基因的基因序列与MDBP基因片段的Xho I的酶切位点
<220>
<221>mis-feature<222>(600)…(792)<223>MDBP基因片段的64个氨基酸的基因序列<400>2atg ctc gtc tcc ccg cag gtg acc aag gcc agc ccg gga agg gtc cgt cgg gac agc gcg 60Met Leu Val Ser Pro Gln Val Thr Lys Ala Ser Pro Gly Arg Val Val Val Asp Ser Ala1 5 10 15 20tgg gac gtg agg ccg ctc acg gag acc aga ggg gat ctt ttc tcg ggc gac gag gat tcc 120Trp Asp Val Arg Pro Leu Thr Glu Thr Arg Gly Asp Leu Phe Ser Gly Asp Glu Asp Ser25 30 35 40gac agc tcg gat ggc tat ccc ccc aac cgt caa gat ccg cgt ttc acc gac acg ctg gtg 180Asp Ser Ser Asp Gly Tyr Pro Pro Asn Arg Gln Asp Pro Arg Phe Thr Asp Thr Leu Val45 50 55 60gac atc acg gat acc gag acg agc gcc aaa ccg ccc gtc acc acc gcg tac aag ttc gag 240Asp Ile Thr Asp Thr Glu Thr Ser Ala Lys Pro Pro Val Thr Thr Ala Tyr Lys Phe Glu65 70 75 80caa ccg acg ttg acg ttc ggc gcc gga gtt aac gtt cct gct ggc gcc ggc gct gcc atc 300Gln Pro Thr Leu Thr Phe Gly Ala Gly Val Asn Val Pro Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ile85 90 95 100ctc acg ccg acg cct gtc aat cct tcc acg gcc ccc gct ccg gcc ccg aca cct acc ttc 360Leu Thr Pro Thr Pro Val Asn Pro Ser Thr Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Pro Thr Phe105 110 115 120gcg ggt acc caa acc ccg gtc aac ggt aac tcg ccc tgg gct ccg acg gcg ccg ttg ccc 420Ala Gly Thr Gln Thr Pro Val Asn Gly Asn Ser Pro Trp Ala Pro Thr Ala Pro Leu Pro125 130 135 140ggg gat atg aac ccc gcc aac tgg ccg cgc gaa cgc gcg tgg gcc ctc aag aat cct cac 480Gly Asp Met Asn Pro Ala Asn Trp Pro Arg Glu Arg Ala Trp Ala Leu Lys Asn Pro His145 150 155 160ctg gct tac aat ccc ttc agg atg cct acg act tcc acg gct tct caa aac acc gtg tcc 540Leu Ala Tyr Asn Pro Phe Arg Met Pro Thr Thr Ser Thr Ala Ser Gln Asn Thr Val Ser165 170 175 180acc acc cct cgg agg ccg tcg act cca cgc gcc gcg gtg aca caa aca gcg tct ctc gag 600Thr Thr Pro Arg Arg Pro Ser Thr Pro Arg Ala Ala Val Thr Gln Thr Ala Ser Leu Glu185 190 195 200ttg gac ggc aaa ggt gac gac ggg gtt ccg ggc ggc ggt gct ggc ggg ggt ggt gga cga 660Leu Asp Gly Lys Gly Asp Asp Gly Val Pro Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Arg205 210 215 220
gac gtg agc ggg ggc ccg agc gac ggt ctg ggt ggc ggt cgt ggt ggt ggg ggt ggt ggg 720Asp Val Ser Gly Gly Pro Ser Asp Gly Leu Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly225 230 235 240gat tcc ggg gga atg atg ggg cgc ggc ggt cgc atg ttg ggc gct agc gtg gac cgt acc 780Asp Ser Gly Gly Met Met Gly Arg Gly Gly Arg Met Leu Gly Ala Ser Vla Asp Arg Thr245 250 255 260tat cgg ctc aat taaTyr Arg Leu Asnatgctcgtct ccccgcaggt gaccaaggcc agcccgggaa gggtccgtcg ggacagcgcg 60tgggacgtga ggccgctcac ggagaccaga ggggatcttt tctcgggcga cgaggattcc 120gacagctcgg atggctatcc ccccaaccgt caagatccgc gtttcaccga cacgctggtg 180gacatcacgg ataccgagac gagcgccaaa ccgcccgtca ccaccgcgta caagttcgag 240caaccgacgt tgacgttcgg cgccggagtt aacgttcctg ctggcgccgg cgctgccatc 300ctcacgccga cgcctgtcaa tccttccacg gcccccgctc cggccccgac acctaccttc 360gcgggtaccc aaaccccggt caacggtaac tcgccctggg ctccgacggc gccgttgccc 420ggggatatga accccgccaa ctggccgcgc gaacgcgcgt gggccctcaa gaatcctcac 480ctggcttaca atcccttcag gatgcctacg acttccacgg cttctcaaaa caccgtgtcc 540accacccctc ggaggccgtc gactccacgc gccgcggtga cacaaacagc gtctctcgag 600ttggacggca aaggtgacga cggggttccg ggcggcggtg ctggcggggg tggtggacga 660gacgtgagcg ggggcccgag cgacggtctg ggtggcggtc gtggtggtgg gggtggtggg 720gattccgggg gaatgatggg gcgcggcggt cgcatgttgg gcgctagcgt ggaccgtacc 780tatcggctca attaa
权利要求
1.一种基因重组人巨细胞病毒融合蛋白pp150/MDBP，即人巨细胞病毒UL32基因片段编码的pp150蛋白495至691氨基酸片段的197个氨基酸以及UL57基因片段编码的MDBP蛋白538至601氨基酸片段的64个氨基酸串联形成的融合蛋白；pp150蛋白的197个氨基酸在融合蛋白的N端，MDBP蛋白的64个氨基酸在融合蛋白的C端，两者之间由亮氨酸(Leu)和谷氨酸(Glu)2个氨基酸连接而成，并且融合蛋白的N端增加了1个甲硫氨酸(Met)，融合蛋白全长264个氨基酸，其特征在于该融合蛋白C端64个氨基酸选自UL57基因片段编码的MDBP蛋白538至601氨基酸，编码该融合蛋白的基因序列为ATG CTC GTC TCC CCG CAG GTG ACC AAG GCC AGC CCG GGA AGG GTC CGT CGG GAC AGC GCG TGG GACGTG AGG CCG CTC ACG GAG ACC AGA GGG GAT CTT TTC TCG GGC GAC GAG GAT TCC GAC AGC TCG GATGGC TAT CCC CCC AAC CGT CAA GAT CCG CGT TTC ACC GAC ACG CTG GTG GAC ATC ACG GAT ACC GAGACG AGC GCC AAA CCG CCC GTC ACC ACC GCG TAC AAG TTC GAG CAA CCG ACG TTG ACG TTC GGC GCCGGA GTT AAC GTT CCT GCT GGC GCC GGC GCT GCC ATC CTC ACG CCG ACG CCT GTC AAT CCT TCC ACGGCC CCC GCT CCG GCC CCG ACA CCT ACC TTC GCG GGT ACC CAA ACC CCG GTC AAC GGT AAC TCG CCCTGG GCT CCG ACG GCG CCG TTG CCC GGG GAT TAG AAC CCC GCC AAC TGG CCG CGC GAA CGC GCG TGGGCC CTC AAG AAT CCT CAC CTG GCT TAC AAT CCC TTC AGG TAG CCT ACG ACT TCC ACG GCT TCT CAAAAC ACC GTG TCC ACC ACC CCT CGG AGG CCG TCG ACT CCA CGC GCC GCG GTG ACA CAA ACA GCG TCTCTC GAG TTG GAC GGC AAA GGT GAC GAC GGG GTT CCG GGC GGC GGT GCT GGC GGG GGT GGT GGA CGAGAC GTG AGC GGG GGC CCG AGC GAC GGT CTG GGT GGC GGT CGT GGT GGT GGG GGT GGT GGG GAT TCCGGG GGA ATG ATG GGG CGC GGC GGT CGC ATG TTG GGC GCT AGC GTG GAC CGT ACC TAT CGG CTC AATTAA该融合蛋白氨基酸序列为Met Leu Val Ser Pro Gln Val Thr Lys Ala Ser Pro Gly Arg Val Val Val Asp Ser Ala5 10 15 20Trp Asp Val Arg Pro Leu Thr Glu Thr Arg Gly Asp Leu Phe Ser Gly Asp Glu Asp Ser25 30 35 40Asp Ser Ser Asp Gly Tyr Pro Pro Asn Arg Gln Asp Pro Arg Phe Thr Asp Thr Leu Val45 50 55 60Asp Ile Thr Asp Thr Glu Thr Ser Ala Lys Pro Pro Val Thr Thr Ala Tyr Lys Phe Glu65 70 75 80Gln Pro Thr Leu Thr Phe Gly Ala Gly Val Asn Val Pro Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ile85 90 95 100Leu Thr Pro Thr Pro Val Asn Pro Ser Thr Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Pro Thr Phe105 110 115 120Ala Gly Thr Gln Thr Pro Val Asn Gly Asn Ser Pro Trp Ala Pro Thr Ala Pro Leu Pro125 130 135 140Gly Asp Met Asn Pro Ala Asn Trp Pro Arg Glu Arg Ala Trp Ala Leu Lys Asn Pro His145 150 155 160Leu Ala Tyr Asn Pro Phe Arg Met Pro Thr Thr Ser Thr Ala Ser Gln Asn Thr Val Ser165 170 175 180Thr Thr Pro Arg Arg Pro Ser Thr Pro Arg Ala Ala Val Thr Gln Thr Ala Ser Leu Glu185 190 195 200Leu Asp Gly Lys Gly Asp Asp Gly Val Pro Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Arg205 210 215 220Asp Val Ser Gly Gly Pro Ser Asp Gly Leu Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly225 230 235 240Asp Ser Gly Gly Met Met Gly Arg Gly Gly Arg Met Leu Gly Ala Ser Vla Asp Arg Thr245 250 255 260Tyr Arg Leu Asn
2.权利要求1所述的基因重组人巨细胞病毒融合蛋白pp150/MDBP的制备方法，该融合蛋白是利用基因工程技术制备，具体方法如下(1)通过计算机分析HCMV磷蛋白150(phosphoprotein 150，pp150)的全部氨基酸序列，筛选出pp150蛋白内的强抗原表位，即从第495氨基酸至691氨基酸，其氨基酸序列和DNA序列如下筛选的HCMV pp150蛋白强抗原表位的197个氨基酸序列Leu Val Ser Pro Gln Val Thr Lys Ala Ser Pro Gly Arg Val Val Val Asp Ser Ala Trp5 10 15 20Asp Val Arg Pro Leu Thr Glu Thr Arg Gly Asp Leu Phe Ser Gly Asp Glu Asp Ser Asp25 30 35 40Ser Ser Asp Gly Tyr Pro Pro Asn Arg Gln Asp Pro Arg Phe Thr Asp Thr Leu Val Asp45 50 55 60Ile Thr Asp Thr Glu Thr Ser Ala Lys Pro Pro Val Thr Thr Ala Tyr Lys Phe Glu Gln65 70 75 80Pro Thr Leu Thr Phe Gly Ala Gly Val Asn Val Pro Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ile Leu85 90 95 100Thr Pro Thr Pro Val Asn Pro Ser Thr Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Pro Thr Phe Ala105 110 115 120Gly Thr Gln Thr Pro Val Asn Gly Asn Ser Pro Trp Ala Pro Thr Ala Pro Leu Pro Gly125 130 135 140Asp Met Asn Pro Ala Asn Trp Pro Arg Glu Arg Ala Trp Ala Leu Lys Asn Pro His Leu145 150 155 160Ala Tyr Asn Pro Phe Arg Met Pro Thr Thr Ser Thr Ala Ser Gln Asn Thr Val Ser Thr165 170 175 180Thr Pro Arg Arg Pro Ser Thr Pro Arg Ala Ala Val Thr Gln Thr Ala Ser185 190 195筛选的pp150蛋白抗原表位的DNA序列CTC GTC TCC CCG CAG GTG ACC AAG GCC AGC CCG GGA AGG GTC CGT CGG GAC AGC GCG TGGGAC GTG AGG CCG CTC ACG GAG ACC AGA GGG GAT CTT TTC TCG GGC GAC GAG GAT TCC GACAGC TCG GAT GGC TAT CCC CCC AAC CGT CAA GAT CCG CGT TTC ACC GAC ACG CTG GTG GACATC ACG GAT ACC GAG ACG AGC GCC AAA CCG CCC GTC ACC ACC GCG TAC AAG TTC GAG CAACCG ACG TTG ACG TTC GGC GCC GGA GTT AAC GTT CCT GCT GGC GCC GGC GCT GCC ATC CTCACG CCG ACG CCT GTC AAT CCT TCC ACG GCC CCC GCT CCG GCC CCG ACA CCT ACC TTC GCGGGT ACC CAA ACC CCG GTC AAC GGT AAC TCG CCC TGG GCT CCG ACG GCG CCG TTG CCC GGGGAT TAG AAC CCC GCC AAC TGG CCG CGC GAA CGC GCG TGG GCC CTC AAG AAT CCT CAC CTGGCT TAC AAT CCC TTC AGG TAG CCT ACG ACT TCC ACG GCT TCT CAA AAC ACC GTG TCC ACCACC CCT CGG AGG CCG TCG ACT CCA CGC GCC GCG GTG ACA CAA ACA GCG TCT在上述抗原表位的DNA序列的两侧选择设计PCR引物，并用化学合成法合成两条引物链，分别为上游引物P15’CAGGAATTCATGCTCGTCTCCCCGCAGGTGAC 3’下游引物P25’CAACTCGAGAGACGCTGTTTGTGTCACCGC 3’其中，上游引物含有EcoRI酶切位点、起始密码子ATG及部分目的基因序列；下游引物含有XhoI的酶切位点和部分目的基因序列，可扩增包含591bp目的基因在内的DNA片段；(2)通过计算机分析HCMV甲基化DNA结合蛋白(methylated DNA bindingprotein，MDBP)的全部氨基酸序列，筛选出MDBP蛋白内的强抗原表位，即从第538氨基酸至601氨基酸，其氨基酸序列和DNA序列如下筛选的HCMV MDBP蛋白强抗原表位的64个氨基酸序列Leu Asp Gly Lys Gly Asp Asp Gly Val Pro Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Arg5 10 15 20Asp Val Ser Gly Gly Pro Ser Asp Gly Leu Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly25 30 35 40Asp Ser Gly Gly Met Met Gly Arg Gly Gly Arg Met Leu Gly Ala Ser Vla Asp Arg Thr45 50 55 60Tyr Arg Leu Asn筛选的MDBP蛋白抗原表位的DNA序列TTG GAC GGC AAA GGT GAC GAC GGG GTT CCG GGC GGC GGT GCT GGC GGG GGT GGT GGA CGAGAC GTG AGC GGG GGC CCG AGC GAC GGT CTG GGT GGC GGT CGT GGT GGT GGG GGT GGT GGGGAT TCC GGG GGA ATG ATG GGG CGC GGC GGT CGC ATG TTG GGC GCT AGC GTG GAC CGT ACCTAT CGG CTC AAT TAA在上述抗原表位的DNA序列的两侧选择设计PCR引物，并用化学合成法合成两条引物链，分别为上游引物P15’CAACTCGAGTTGGACGGCAAAGGTGAC 3’下游引物P25’CGCGGATCCATTGAGCCGATAGGTACGGT 3’其中，上游引物含有XhoI酶切位点及部分目的基因序列；下游引物含有BamHI的酶切位点、部分目的基因序列和TAA终止密码子，可扩增包含目的基因在内的192bp的DNA片段；取HCMV AD169株细胞，裂解细胞并纯化HCMV DNA；以纯化的HCMV DNA为模板，分别用相应引物P1、P2以扩增条件为95℃ 30秒、59℃ 40秒、72℃ 55秒，32个循环PCR扩增HCMV PP150蛋白抗原表位的基因片段；以扩增条件为95℃ 30秒、56℃ 40秒、72℃ 45秒，32个循环PCR扩增HCMV MDBP蛋白抗原表位的基因片段；然后分别经琼脂糖凝电泳回收、纯化扩增的基因片段；表达融合蛋白重组质粒的构建将上述PCR扩增、纯化回收的基因片段分别转化pMD18-T克隆载体，分别构建出相应的pMD18-T-UL57克隆载体和pMD18-T-UL32克隆载体并转化大肠杆菌，扩菌培养后碱变性法提取质粒，质粒经酶切、PCR扩增验证正确后，pMD18-T-UL57克隆载体和pMD18-T-UL32克隆载体均用XhoI和BamHI双酶切，胶回收纯化线性化pMD18-T-UL32克隆载体和编码HCMV MDBP蛋白、带有XhoI和BamHI粘性末端酶切位点的基因片段，二者在T4 DNA连接酶的作用下，构建出含有PP150蛋白基因片段和MDBP蛋白基因片段的pMD18-T-UL32-UL57融合基因克隆载体，并转化大肠杆菌，扩菌培养后碱变性法提取质粒，经双酶切和PCR扩增验证后，该融合基因克隆载体与pBV220表达载体分别用ECoRI和BamHI双酶切，胶回收纯化线性化pBV220表达载体和融合基因，并在T4 DNA连接酶的作用下，将PP150蛋白基因片段和MDBP蛋白基因片段构成的融合基因串联插入到表达载体pBV220内的ECoRI和BamHI位点之间，两者翻译框架一致，表达一个融合蛋白；重组质粒的筛选与鉴定将上述重组质粒转化大肠杆菌BL21，挑取转化子，碱变性法提取质粒，用EcoRI和BamHI酶切及DNA序列分析，筛选出含PP150蛋白基因和MDBP蛋白基因串连片段的重组质粒，PP150蛋白的基因在串连基因的5’端，MDBP蛋白的基因在串连基因的3’端，两者之间由下划线所示的XhoI酶切位点连接，序列如下ATG CTC GTC TCC CCG CAG GTG ACC AAG GCC AGC CCG GGA AGG GTC CGT CGG GAC AGC GCGTGG GAC GTG AGG CCG CTC ACG GAG ACC AGA GGG GAT CTT TTC TCG GGC GAC GAG GAT TCCGAC AGC TCG GAT GGC TAT CCC CCC AAC CGT CAA GAT CCG CGT TTC ACC GAC ACG CTG GTGGAC ATC ACG GAT ACC GAG ACG AGC GCC AAA CCG CCC GTC ACC ACC GCG TAC AAG TTC GAGCAA CCG ACG TTG ACG TTC GGC GCC GGA GTT AAC GTT CCT GCT GGC GCC GGC GCT GCC ATCCTC ACG CCG ACG CCT GTC AAT CCT TCC ACG GCC CCC GCT CCG GCC CCG ACA CCT ACC TTCGCG GGT ACC CAA ACC CCG GTC AAC GGT AAC TCG CCC TGG GCT CCG ACG GCG CCG TTG CCCGGG GAT TAG AAC CCC GCC AAC TGG CCG CGC GAA CGC GCG TGG GCC CTC AAG AAT CCT CACCTG GCT TAC AAT CCC TTC AGG TAG CCT ACG ACT TCC ACG GCT TCT CAA AAC ACC GTG TCCACC ACC CCT CGG AGG CCG TCG ACT CCA CGC GCC GCG GTG ACA CAA ACA GCG TCT CTC GAGTTG GAC GGC AAA GGT GAC GAC GGG GTT CCG GGC GGC GGT GCT GGC GGG GGT GGT GGA CGAGAC GTG AGC GGG GGC CCG AGC GAC GGT CTG GGT GGC GGT CGT GGT GGT GGG GGT GGT GGGGAT TCC GGG GGA ATG ATG GGG CGC GGC GGT CGC ATG TTG GGC GCT AGC GTG GAC CGT ACCTAT CGG CTC AAT TAA构建的重组质粒表达PP150蛋白的197个氨基酸与MDBP蛋白的64个氨基酸的融合蛋白，即权利要求1内所示的融合蛋白；表达融合蛋白工程菌的筛选鉴定将含有重组质粒的阳性转化子，接种到含有氨苄青霉素100μg/mL的LB液体培养基中，30℃振荡培养4～8小时，然后迅速升温至42℃诱导4小时，离心收集菌体进行SDS-PAGE检测筛选并用Western Blotting验证，获得表达融合蛋白的工程菌，表达的融合蛋白的相对分子量约为27000，以可溶性形式存在，表达量约占菌体蛋白总量的25％；表达融合蛋白的纯化将诱导表达融合蛋白的工程菌离心，收集菌体，冰浴超声破碎细菌，再离心收集上清，收集后的上清先经Sephacryl S200进行初步纯化，接收目的蛋白峰，然后将接收的目的蛋白峰上DEAE-Sepharose FastFlow阴离子柱，用10、50、100、500mmol/L梯度浓度的NaCl溶液洗脱蛋白，收集100mmol/L NaCl溶液洗脱蛋白峰，该峰含有表达的融合蛋白；将上一步DEAE-Sepharose FastFlow阴离子柱100mmol/L NaCl溶液洗脱蛋白峰加入终浓度为1.5mol/L的硫酸铵，然后上Phenyl Sepharose FastFlow疏水柱层析纯化，接收目的蛋白峰，此即为纯化的融合蛋白。
3.权利要求1或2所述的基因重组人巨细胞病毒融合蛋白pp150/MDBP在制备其疫苗、单抗、多抗、蛋白芯片、ELISA检测试剂盒以及与人巨细胞病毒相关产品中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种基因重组人巨细胞病毒融合蛋白pp150/MDBP及其制备方法与应用，涉及基因工程技术、预防性疫苗和诊断试剂等领域。其中所述重组融合蛋白pp150/MDBP，即为人巨细胞病毒pp150蛋白495至691氨基酸片段的197个氨基酸和MDBP蛋白538至601氨基酸片段的64个氨基酸串联形成的融合蛋白；pp150蛋白的197个氨基酸在融合蛋白的N端，MDBP蛋白的64个氨基酸在融合蛋白的C端，两者之间由亮氨酸(Leu)和谷氨酸(Glu)2个氨基酸连接而成，并且融合蛋白的N端增加了1个甲硫氨酸(Met)，融合蛋白全长264个氨基酸。该融合蛋白用于检测人巨细胞病毒抗体或抗原以及用于制备单抗、多抗和蛋白芯片，也可用于制备疫苗、ELISA检测试剂盒和其他相关产品。
文档编号C12N15/10GK1763203SQ200510044398
公开日2006年4月26日 申请日期2005年8月11日 优先权日2005年8月11日
发明者高雪芹, 郭大东, 韩金祥 申请人:山东省医药生物技术研究中心